クロロフィル蛍光解析による光呼吸変異体の光合成効率評価

要約

クロロフィル蛍光を用いて低_CO2 処理後の植物の光合成効率の変化を測定する手法について述べる。

要約

光合成と光呼吸は、植物の一次代謝における最大の炭素フラックスを表し、植物の生存に必要です。光合成と光呼吸に重要な酵素と遺伝子の多くは、何十年にもわたってよく研究されてきましたが、これらの生化学的経路のいくつかの側面といくつかの細胞内プロセスとのクロストークはまだ完全には理解されていません。植物の代謝に重要な遺伝子とタンパク質を特定した研究の多くは、高度に制御された環境下で行われており、自然環境や農業環境下で光合成と光呼吸がどのように機能するかを最もよく表していない可能性があります。非生物的ストレスが光合成効率を阻害することを考慮すると、非生物的ストレスとその光合成への影響の両方をモニタリングできるハイスループットスクリーンの開発が必要である。

そこで、クロロフィル蛍光解析と低_CO2 スクリーニングを用いて、光呼吸に関与する特徴のない遺伝子を同定できる、非生物的ストレスによる光合成効率の変化を比較的迅速にスクリーニングする方法を開発しました。本論文では、 シロイヌナズナの転写DNA(T-DNA)ノックアウト変異体の光合成効率の変化を調べる方法について説明します。同じ方法を、エチルメタンスルホン酸(EMS)誘発変異体のスクリーニングまたはサプレッサースクリーニングに使用することができる。この方法を利用することで、植物の一次代謝と非生物的ストレス応答のさらなる研究のための遺伝子候補を特定することができます。この方法からのデータは、増加したストレス環境にさらされるまで認識されない可能性のある遺伝子機能への洞察を提供することができます。

概要

農家の畑で一般的に見られる非生物的ストレス条件は、光合成効率を低下させることにより、作物収量に悪影響を与える可能性があります。熱波、気候変動、干ばつ、土壌塩分などの有害な環境条件は、CO₂の利用可能性を変化させ、高い光ストレスに対する植物の反応を低下させる非生物的ストレスを引き起こす可能性があります。2つの最大の陸生炭素フラックスは、植物の成長と作物収量に不可欠な光合成と光呼吸です。これらのプロセスに関与する重要なタンパク質および酵素の多くは、実験室条件下で特性評価され、遺伝子レベルで同定されています¹。光合成と光呼吸の理解には多くの進歩が見られましたが、植物小器官間の輸送を含む多くのステップは特徴付けられていません^2,3。

光合成に次いで植物で2番目に大きい炭素フラックスである光呼吸は、酵素Rubiscoが二酸化炭素の代わりに酸素をリブロース1,5ビスリン酸(RuBP)に固定し、阻害化合物2-ホスホグリコール酸(2PG)¹を生成するときに始まります。2PGの阻害効果を最小限に抑え、以前に固定された炭素をリサイクルするために、C3植物は光呼吸の多器官プロセスを進化させました。光呼吸は、2分子の2PGを1分子の3-ホスホグリセリン酸(3PGA)に....

プロトコル

1.種子の準備と滅菌

注:種子の準備は、種子の吸収と種子の滅菌で構成されます。これらのステップはすべて、無菌状態を維持するために層流フード内で実行されることに注意することが重要です。必要なすべての材料、試薬、および成長培地はオートクレーブ滅菌する必要があります(材料の表を参照)。

1. 種子の吸収と層別化
   注:使用されるシードラインは、 plgg1-1 (salk_053463)、 abcb26 (salk_085232)、および野生型(WT、Col-0)です。
   1. 種子を1.5 mLの微量遠心チューブに分注します。種子を層流フード内の滅菌水に吸収し、暗所で4°Cで2日間成層します。
2. 種子殺菌
   1. 無菌条件下で、10 mLの50%(v / v)漂白剤溶液を調製し、約20 μLのTween 20を追加します。種子滅菌のために、吸収された種子から水を取り除き、1 mLの漂白剤溶液を微量遠心管に加え、室温で5分間インキュベートします。
   2. ピペットで漂白剤溶液を取り除きます。
   3. 種子を1 mLの滅菌水ですすぎ、再懸濁します。種子が底に落ち着いたら水を取り除きます。手順 1.6 と手順 1.7 を 7 回繰り返します。
   4. 種子を滅菌0.1%ア....

結果

結果は、WTおよび試験変異体の周囲および低_CO2スクリーニングからの生および蛍光画像のプレート画像を示す。各植物にはエリア番号で標識され、対応する蛍光測定値はQYとして与えられます。データはテキストファイルとしてエクスポートされ、分析のためにスプレッドシートで開くことができます(補足表S1を参照)。変異株plgg1-1およびabcb26は、光呼吸スト.......

ディスカッション

このホワイトペーパーで概説されている実験方法には、いくつかの利点と制限があります。1つの利点は、この方法が多くの植物苗をスクリーニングできることですが、メッキおよび成長プロセス中の植物培地プレートの汚染を防ぐためにいくつかの予防措置を講じる必要があります。したがって、シロイヌナズナプレートをサージカルテープで密封することが重要です。この実験の別の利点.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	VWR	10810-070	container for seed sterilization
agarose	VWR	9012-36-6	chemical used to suspend seeds for ease of plating
Arabidopsis thaliana seeds (abcb26)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_085232	arabidopsis seeds used as experimental group
Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_053469C	parental arabidopsis seeds
Arabidopsis thaliana seeds (WT)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	Col-0	arabidopsis wild type seeds used as a control group
bleach	clorox	generic bleach	chemical used to sterilize seeds
Carbolime absorbent	Medline products	S232-104-001	CO2 absorbent
Closed FluorCam	Photon Systems Instruments	FC 800-C	Fluorescence imager
FluoroCam FC 800-C	Photon Systems Instruments	Closed FluorCam FC 800-C/1010-S	Fluorescence imager
FluoroCam7	Photon Systems Instruments	Closed FluorCam FC 800-C/1010-S	Fluorescence image analysis software
Gelzan (plant agar)	Phytotech labs	71010-52-1	chemical used to solidify MS media as plates
glass flask 1 L	Fisherbrand	FB5011000	container for making and autoclaving MS media
growth chamber	caron	7317-50-2	growth chamber used to grow plants
Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS)	Phytotech labs	M5531	growth media for arabidopsis seedlings
potassium Hydroxide (KOH)	Phytotech labs	1310-58-3	make as 1 M solution for ph adjustment
spider lights	Mean Well Enterprises	XLG-100-H-AB	lights used in the light assay
Square Petri Dish with Grid, sterile	Simport Scientific	D21016	used to hold MS media for arabidopsis seedlings
surgical tape	3M	1530-1	tape used to seal plates
tween 20	biorad	9005-64-5	surfactant used to assist seed sterilization