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Descriviamo un approccio per misurare i cambiamenti nell'efficienza fotosintetica nelle piante dopo il trattamento con bassa CO2 utilizzando la fluorescenza della clorofilla.
La fotosintesi e la fotorespirazione rappresentano i maggiori flussi di carbonio nel metabolismo primario delle piante e sono necessari per la sopravvivenza delle piante. Molti degli enzimi e dei geni importanti per la fotosintesi e la fotorespirazione sono stati ben studiati per decenni, ma alcuni aspetti di questi percorsi biochimici e la loro diafonia con diversi processi subcellulari non sono ancora completamente compresi. Gran parte del lavoro che ha identificato i geni e le proteine importanti nel metabolismo delle piante è stato condotto in ambienti altamente controllati che potrebbero non rappresentare al meglio come funzionano la fotosintesi e la fotorespirazione in ambienti naturali e agricoli. Considerando che lo stress abiotico si traduce in una ridotta efficienza fotosintetica, è necessario lo sviluppo di uno schermo ad alto rendimento in grado di monitorare sia lo stress abiotico che il suo impatto sulla fotosintesi.
Pertanto, abbiamo sviluppato un metodo relativamente veloce per lo screening di cambiamenti indotti da stress abiotico all'efficienza fotosintetica in grado di identificare geni non caratterizzati con ruoli nella fotorespirazione utilizzando l'analisi della fluorescenza clorofilliana e lo screening a bassa CO2 . Questo articolo descrive un metodo per studiare i cambiamenti nell'efficienza fotosintetica nei mutanti knockout del DNA trasferito (T-DNA) in Arabidopsis thaliana. Lo stesso metodo può essere utilizzato per lo screening dei mutanti indotti dal metansolfonato di etile (EMS) o per lo screening dei soppressori. L'utilizzo di questo metodo può identificare i candidati geni per ulteriori studi sul metabolismo primario delle piante e sulle risposte allo stress abiotico. I dati di questo metodo possono fornire informazioni sulla funzione genica che potrebbe non essere riconosciuta fino all'esposizione a ambienti di stress aumentati.
Le condizioni di stress abiotico comunemente osservate nei campi degli agricoltori possono avere un impatto negativo sui raccolti riducendo l'efficienza fotosintetica. Condizioni ambientali dannose come ondate di calore, cambiamenti climatici, siccità e salinità del suolo possono causare stress abiotici che alterano la disponibilità di CO2 e riducono la risposta di una pianta a stress luminosi elevati. I due maggiori flussi di carbonio terrestri sono la fotosintesi e la fotorespirazione, che sono essenziali per la crescita delle piante e la resa delle colture. Molte delle importanti proteine ed enzimi coinvolti in questi processi sono stati caratterizzati i....
1. Preparazione e sterilizzazione delle sementi
NOTA: La preparazione delle sementi consiste nell'assorbimento e nella sterilizzazione dei semi. È importante notare che tutti questi passaggi devono essere eseguiti in una cappa a flusso laminare per mantenere condizioni sterili. Tutti i materiali, i reagenti e i substrati di crescita necessari devono essere sottoposti ad autoclave (vedere la Tabella dei materiali).
I risultati mostrano immagini di lastre di immagini grezze e fluorescenza dallo screening ambientale e a bassa CO2 di WT e mutanti di prova. Ogni piantina è etichettata per numero di area, con le corrispondenti letture di fluorescenza fornite come QY. I dati vengono esportati come file di testo e possono essere aperti in un foglio di calcolo per l'analisi (vedere la tabella supplementare S1). Le linee mutanti plgg1-1 e abcb26 sono state selezionate per dimostrare l'identific.......
I metodi sperimentali descritti in questo documento presentano alcuni vantaggi e limitazioni. Un vantaggio è che questo metodo può schermare molte piantine di piante, anche se devono essere prese alcune precauzioni per prevenire la contaminazione della piastra del supporto vegetale durante il processo di placcatura e crescita. Pertanto, è fondamentale sigillare le piastre di Arabidopsis con nastro chirurgico. Un altro vantaggio di questo esperimento è che ha un periodo di stress fotorespiratorio più breve di 12 ore .......
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o conflitti di interesse.
Questa ricerca è stata finanziata dal Louisiana Board of Regents (AWD-AM210544).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL microcentrifuge tube | VWR | 10810-070 | container for seed sterilization |
agarose | VWR | 9012-36-6 | chemical used to suspend seeds for ease of plating |
Arabidopsis thaliana seeds (abcb26) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_085232 | arabidopsis seeds used as experimental group |
Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_053469C | parental arabidopsis seeds |
Arabidopsis thaliana seeds (WT) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | Col-0 | arabidopsis wild type seeds used as a control group |
bleach | clorox | generic bleach | chemical used to sterilize seeds |
Carbolime absorbent | Medline products | S232-104-001 | CO2 absorbent |
Closed FluorCam | Photon Systems Instruments | FC 800-C | Fluorescence imager |
FluoroCam FC 800-C | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence imager |
FluoroCam7 | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence image analysis software |
Gelzan (plant agar) | Phytotech labs | 71010-52-1 | chemical used to solidify MS media as plates |
glass flask 1 L | Fisherbrand | FB5011000 | container for making and autoclaving MS media |
growth chamber | caron | 7317-50-2 | growth chamber used to grow plants |
Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS) | Phytotech labs | M5531 | growth media for arabidopsis seedlings |
potassium Hydroxide (KOH) | Phytotech labs | 1310-58-3 | make as 1 M solution for ph adjustment |
spider lights | Mean Well Enterprises | XLG-100-H-AB | lights used in the light assay |
Square Petri Dish with Grid, sterile | Simport Scientific | D21016 | used to hold MS media for arabidopsis seedlings |
surgical tape | 3M | 1530-1 | tape used to seal plates |
tween 20 | biorad | 9005-64-5 | surfactant used to assist seed sterilization |
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