Evaluación de la eficiencia fotosintética en mutantes fotorrespiratorios mediante análisis de fluorescencia de clorofila

Resumen

Describimos un enfoque para medir los cambios en la eficiencia fotosintética en plantas después del tratamiento con bajo_CO2 utilizando fluorescencia de clorofila.

Resumen

La fotosíntesis y la fotorrespiración representan los mayores flujos de carbono en el metabolismo primario de las plantas y son necesarios para la supervivencia de las plantas. Muchas de las enzimas y genes importantes para la fotosíntesis y la fotorrespiración han sido bien estudiados durante décadas, pero algunos aspectos de estas vías bioquímicas y su diafonía con varios procesos subcelulares aún no se comprenden completamente. Gran parte del trabajo que ha identificado los genes y proteínas importantes en el metabolismo de las plantas se ha llevado a cabo en entornos altamente controlados que pueden no representar mejor cómo funcionan la fotosíntesis y la fotorrespiración en entornos naturales y agrícolas. Teniendo en cuenta que el estrés abiótico resulta en una eficiencia fotosintética deteriorada, es necesario el desarrollo de una pantalla de alto rendimiento que pueda monitorear tanto el estrés abiótico como su impacto en la fotosíntesis.

Por lo tanto, hemos desarrollado un método relativamente rápido para detectar cambios inducidos por el estrés abiótico en la eficiencia fotosintética que puede identificar genes no caracterizados con roles en la fotorrespiración utilizando el análisis de fluorescencia de clorofila y la detección de bajo_CO2 . Este artículo describe un método para estudiar los cambios en la eficiencia fotosintética en mutantes knockout de ADN transferido (ADN-T) en Arabidopsis thaliana. El mismo método se puede utilizar para la detección de mutantes inducidos por metanosulfonato de etilo (EMS) o la detección de supresores. La utilización de este método puede identificar candidatos a genes para un estudio adicional en el metabolismo primario de las plantas y las respuestas al estrés abiótico. Los datos de este método pueden proporcionar información sobre la función de los genes que puede no reconocerse hasta la exposición a entornos de mayor estrés.

Introducción

Las condiciones de estrés abiótico comúnmente observadas en los campos de los agricultores pueden afectar negativamente los rendimientos de los cultivos al reducir la eficiencia fotosintética. Las condiciones ambientales perjudiciales, como las olas de calor, el cambio climático, la sequía y la salinidad del suelo, pueden causar estrés abiótico que altera la disponibilidad de_CO2 y reduce la respuesta de una planta al alto estrés lumínico. Los dos flujos de carbono terrestres más grandes son la fotosíntesis y la fotorrespiración, que son esenciales para el crecimiento de las plantas y el rendimiento de los cultivos. Muchas de las proteínas y enzimas importantes involucradas en estos procesos han sido caracterizadas en condiciones de laboratorio e identificadas a nivel genético¹. Aunque se ha avanzado mucho en la comprensión de la fotosíntesis y la fotorrespiración, muchos pasos, incluido el transporte entre orgánulos vegetales, permanecen sin caracterizar ^2,3.

La fotorrespiración, el segundo mayor flujo de carbono en las plantas después de la fotosíntesis, comienza cuando la enzima Rubisco fija oxígeno en lugar de dióxido de carbono a ribulosa 1,5 bisfosfato (RuBP), generando el compuesto inhibidor 2-fosfoglicolato (2PG)¹. Para minimizar los efectos inhibitorios de 2PG y reciclar el carbono previamente fijado, las plantas C3 han desarrollado el proceso multiorgánulo de fotorrespiración. La fotorrespiración convierte dos moléculas de 2PG en una molécula de 3-fosfoglicerato (3PGA), que puede volver a entrar en^{el ciclo 1} de fijación de carbono C3. Por lo tanto, la fotorrespiración solo convierte el 75% del carbono previamente fijado de la generación de 2PG y consume ATP en el proceso. Como resultado, el proceso de fotorrespiración es un arrastre significativo del 10% -50% en el proceso fotosintético, dependiendo de la disponibilidad de agua y las temperaturas de la temporada de crecimiento⁴.

Las enzimas involucradas en la fotorrespiración han sido un área de investigación enfocada durante décadas, pero sólo un pequeño número de proteínas de transporte han sido caracterizadas a nivel genético, a pesar de que al menos 25 pasos de transporte están involucrados en el proceso ^5,6,7. Las dos proteínas de transporte que están directamente involucradas en el movimiento del carbono generado en el proceso de fotorrespiración son el transportador de glicolato plastídico/glicerato PLGG1 y el simportador de sodio de ácidos biliares BASS6, ambos involucrados en la exportación de glicolato del cloroplasto ^5,6.

Bajo ambiente [CO₂], Rubisco fija una molécula de oxígeno a RuBP aproximadamente el 20% del tiempo¹. Cuando las plantas se someten a [_CO2] bajo, las tasas de fotorrespiración aumentan, lo que hace que el bajo [CO₂] sea un entorno ideal para detectar mutantes que pueden ser importantes bajo un estrés elevado de fotorrespiración. La prueba adicional de líneas de proteína de transporte de cloroplastos T-DNA bajo bajo bajo_CO2 durante 24 h y la medición de los cambios en la fluorescencia de clorofila llevaron a la identificación de líneas vegetales bass6-1 que demostraron un fenotipo⁵ mutante de fotorrespiración. La caracterización adicional demostró que BASS6 es un transportador de glicolato en la membrana interna del cloroplasto.

Este artículo describe en detalle un protocolo similar al que se utilizó inicialmente para identificar BASS6 como un transportador de fotorrespiración, que provenía de una lista de proteínas de transporte putativas ubicadas dentro de la membrana del cloroplasto⁸ Este protocolo se puede utilizar en un experimento de alto rendimiento que caracterice mutantes de ADN-T de Arabidopsis o plantas mutantes generadas por EMS como una forma de identificar genes importantes para mantener la eficiencia fotosintética bajo una gama de tensiones abióticas como el calor, alto estrés lumínico, sequía y disponibilidad de_CO2 . El cribado de mutantes vegetales utilizando fluorescencia de clorofila se ha utilizado en el pasado para identificar rápidamente genes importantes para el metabolismo primario⁹. Con hasta un 30% del genoma de Arabidopsis que contiene genes que codifican proteínas de función desconocida o mal caracterizada, el análisis inducido por el estrés de la eficiencia fotosintética podría proporcionar información sobre las funciones moleculares no observadas en condiciones controladas en plantas mutantes¹⁰. El objetivo de este método es identificar mutantes de la vía fotorrespiratoria mediante un cribado bajo de_CO2 . Presentamos un método para identificar mutantes que interrumpen la fotorrespiración después de la exposición a niveles bajos de_CO2. Una ventaja de este método es que es un cribado de alto rendimiento para plántulas que se puede realizar en un período de tiempo relativamente corto. Las secciones del protocolo de video proporcionan detalles sobre la preparación y esterilización de semillas, el crecimiento de las plantas y el tratamiento con bajo contenido de_CO2 , la configuración del sistema de imágenes de fluorescencia, la medición del rendimiento cuántico de las muestras tratadas, resultados representativos y conclusiones.

Protocolo

1. Preparación y esterilización de semillas

NOTA: La preparación de semillas consiste en la ingesta de semillas y la esterilización de semillas. Es importante tener en cuenta que todos estos pasos deben llevarse a cabo en una campana de flujo laminar para mantener las condiciones estériles. Todos los materiales, reactivos y medios de crecimiento necesarios deben ser esterilizados en autoclave (consulte la Tabla de materiales).

1. Imbibación y estratificación de semillas
   NOTA: Las líneas de semillas utilizadas son plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) y tipo silvestre (WT, Col-0).
   1. Dispensar las semillas en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Beber las semillas en agua estéril en una campana de flujo laminar y estratificar a 4 °C en la oscuridad durante 2 días.
2. Esterilización de semillas
   1. En condiciones estériles, preparar 10 ml de solución de lejía al 50% (v/v) y añadir aproximadamente 20 μL de Tween 20. Para la esterilización de semillas, retire el agua de las semillas absorbidas, agregue 1 ml de solución de lejía en los tubos de microcentrífuga e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos.
   2. Retire la solución de lejía con una pipeta.
   3. Enjuague las semillas en 1 ml de agua estéril para resuspender. Retire el agua una vez que las semillas se hayan asentado en el fondo. Repita los pasos 1.6 y 1.7 siete veces.
   4. Resuspender las semillas en solución estéril de agarosa al 0,1%.
3. Recubrimiento de semillas
   1. Haga un volumen de 1 L de Murashige & Skoog Basal Medium con vitaminas y 1.0 g / L de ácido 2-(N-morphonio) etanosulfónico (MS) agregando 5.43 g del polvo a 500 ml de agua destilada. Ajuste el pH entre 5.6 y 5.8 usando hidróxido de potasio (KOH). Llene hasta 1 L con agua destilada.
      1. Dividir la solución líquida en 500 ml y colocar cada mitad en un matraz de 1 L que contenga una barra agitadora magnética. Añadir 5 g de agar en polvo para obtener una solución de agar al 1% p/v para cada matraz.
      2. Autoclave a 121 °C y 15 psi durante 30 min; Luego, coloque a temperatura ambiente mientras remueve lentamente. Cuando se enfríe, vierta 25 ml de agar MS en una placa de Petri cuadrada. Deja que se solidifique.
         NOTA: Estas placas de Murashige & Skoog Basal Medium contienen 1% de MS medio con vitaminas y 1% de agar para el cultivo de los mutantes de prueba.
   2. Corte una punta de pipeta de 200 μL con una cuchilla de afeitar. Colocar una semilla en el centro de la cuadrícula cuadrada designada para cada mutante de ensayo o genotipo (1 cm² cuadrado) de una placa cuadrada de EM (figura 1) utilizando una micropipeta de 200 μL.
      NOTA: La cuadrícula cuadrada de 1 cm x 1 cm ayuda a mantener una distancia uniforme entre las plántulas y evitar la superposición, lo que será importante en imágenes y análisis de fluorescencia posteriores.
   3. Una vez que las semillas hayan sido plateadas, envuélvalas con cinta quirúrgica alrededor de la tapa para sellar, y colóquelas en la cámara de crecimiento en las condiciones que se describen a continuación.

2. Crecimiento de las plantas y tratamiento bajo en_CO2

1. Cultivar las plantas durante 7-9 días a 20 °C bajo un ciclo de luz de 8 h de 120 μmol·m−²s⁻¹ y 16 h de oscuridad a 18 °C. Revise las plantas en el 6º día para determinar si son lo suficientemente grandes para obtener imágenes. En el 8º día después del enchapado, exponga las plantas a un bajo nivel de_CO2.
2. Tratamiento bajo en_CO2
   1. Después de los 7-9 días, colocar cuatro de las ocho placas de las condiciones de la cámara de crecimiento ambiental en condiciones fotorrespiratorias de 20 °C, niveles de luz continuos de 200 μmol·m−2 s⁻¹ y bajo CO2 durante ¹²h.
   2. Construya la condición de bajo_CO2 utilizando un recipiente hermético transparente con 100 g de cal sodada colocado en el fondo del recipiente. Coloque el recipiente dentro de la misma cámara de crecimiento que el control. Mantener las plantas de control por debajo de 120 μmol·m−2 s⁻¹ en CO2 ambiental durante₁₂ h.

3. Configuración del sistema de imágenes de fluorescencia

1. Coloque una placa de prueba (preparada de acuerdo con las secciones 1 y 2) centrada debajo de la cámara a una distancia fija en el sistema de imágenes de fluorescencia.
2. Dentro del software del instrumento, navegue hasta Live Window y marque la casilla Parpadeos para activar los flashes de medición no actínicos.
3. Haga clic en las herramientas Zoom y Enfoque hasta que se vea una imagen completa y nítida. Con este fin, use un escenario o un estante para ajustar la distancia entre las plantas y la cámara. Mantén el zoom, el enfoque y la distancia de la cámara constantes durante todo el experimento.
4. Establezca el valor de El. Shutter en 0 y ajuste la sensibilidad para obtener una señal fluorescente en el rango de 200-500 unidades digitales.
   NOTA: Un valor de obturación El. más bajo (0-1) asegurará que los flashes de medición no sean actínicos, mientras que un valor más alto (2) mejorará la resolución de la imagen.
5. Coloque un medidor de luz en la misma posición utilizada para ajustar la configuración de la cámara.
6. En la ventana activa, marque la casilla Super para iniciar un pulso de saturación que dure 800 ms. Recuerde marcar la casilla cada vez para un nuevo pulso.
7. Use el control deslizante para ajustar el porcentaje de potencia relativa para el Super pulso hasta que el medidor de luz lea 6,000-8,000 μmol·m−²s⁻¹.

4. Diseñar el programa de rendimiento cuántico

1. Importe herramientas operativas estándar para el sistema de imágenes.
   Incluir default.inc
   Incluye light.inc
   NOTA: La sintaxis del programa utilizada como referencia en este experimento es para un sistema de imágenes FluorCam.
2. Defina las siguientes variables globales según los ajustes de luz configurados:
   Obturador = 0
   Sensibilidad = 40
   Super = 65
3. Incluya el paso de tiempo para registrar datos:
   TS = 20ms
4. Recopile la medición Fo muestreando fluorescencia en un estado adaptado a la oscuridad.
   F0duración = 2s;
   F0period = 200ms;
   NOTA: F0duration define el intervalo de tiempo durante el cual se registra la fluorescencia adaptada a la oscuridad. F0period define el intervalo de tiempo durante el cual se repite la medición de fluorescencia adaptada a la oscuridad.
5. Registre las mediciones de Fo en tablas de datos.
   <0,F0period.. F0duration>=>mfmsub
   <0s>->checkpoint,"startFo"
   =>checkpoint,"endFo";
   Donde < , > representa el conjunto de valores de fluorescencia indexados por tiempo; => almacena las mediciones en un archivo del sistema; MFMSUB representa todo el conjunto de datos del experimento; y checkpoint crea un subconjunto para datos de mediciones específicas como startFo.
6. Recopile y almacene la medición de Fm muestreando fluorescencia después de un pulso de saturación.
   PulseDuration=960ms; ##
   a1=F0duración + 40ms
   a2 = a1 + 480ms;
   =>SatPulse(PulseDuration);
   =>mfmsub
   =>mfmsub;
   =>punto de control,"startFm"
   =>checkpoint,"endFm"
   =>checkpoint,"timeVisual";
   Donde a1 y a2 son variables para coordinar el tiempo de muestreo con el pulso de saturación; a1 representa la hora de inicio de la medición de Fm; y a2 representa el punto medio del pulso.

5. Medición del rendimiento cuántico de las muestras tratadas

1. Inmediatamente después del tratamiento, cubra las placas con papel de aluminio durante 15 minutos para la adaptación a la oscuridad. Retire la lámina para medir el rendimiento cuántico del fotosistema II con un fluorómetro modificado por amplitud de pulso. Luego, coloque la placa de plántula directamente debajo de la cámara y ejecute el protocolo de rendimiento cuántico que se encuentra en el repositorio de GitHub.
2. Descargue el protocolo quantum_yield de GitHub (https://github.com/South-lab/fluorescent-screen) o use un programa de diseño similar de la sección 4. Utilice el software del fluorómetro para abrir el archivo de programa haciendo clic en el icono de la carpeta y navegando a la ubicación del archivo.
3. Ejecute el programa de rendimiento cuántico haciendo clic en el icono del rayo rojo.
4. Una vez completado el protocolo, navegue hasta la ventana de análisis previo . Divida la placa en plántulas individuales utilizando las Herramientas de selección para resaltar todos los píxeles de cada plántula en la imagen de la placa. Haga clic en Exclusión de fondo para eliminar los píxeles de fondo resaltados, dejando solo el área de plántula.
5. Haga clic en Analizar para generar datos de fluorescencia para cada plántula en la imagen de la placa. Ajuste manualmente el rango de valores de fluorescencia para mostrar valores mínimos y máximos consistentes entre todas las placas.
6. Haga clic en Promedio numérico en la pestaña Experimento | Exportar | Numérico. Seleccione Todos los datos y por columna y haga clic en Aceptar para generar un archivo de texto que contenga mediciones QY para cada plántula.

6. Abrir el archivo de datos

1. Abra el archivo de texto en una hoja de cálculo para su análisis. De los encabezados que muestran el número de área, el tamaño de los píxeles, Fm, Ft, Fq y QY, identifique el número de área para el genotipo del núcleo (WT o mutante de prueba) y QYmax. Realice una prueba t por pares con respecto al tipo salvaje para determinar la importancia. Los datos se interpretan como significativamente diferentes cuando los valores p están por debajo de 0,05.

Resultados

Los resultados muestran imágenes de placas de imágenes crudas y fluorescentes de detección ambiental y baja de_CO2 de WT y mutantes de prueba. Cada plántula está etiquetada por número de área, con las lecturas de fluorescencia correspondientes dadas como QY. Los datos se exportan como un archivo de texto y se pueden abrir en una hoja de cálculo para su análisis (consulte la Tabla suplementaria S1). Se seleccionaron las líneas mutantes plgg1-1 y abcb26 para demostrar ...

Discusión

Los métodos experimentales descritos en este documento vienen con algunas ventajas y limitaciones. Una ventaja es que este método puede examinar muchas plántulas de plantas, aunque se deben tomar algunas precauciones para evitar la contaminación de la placa de medios vegetales durante el proceso de recubrimiento y crecimiento. Por lo tanto, es fundamental sellar las placas de Arabidopsis con cinta quirúrgica. Otra ventaja de este experimento es que tiene un período de estrés fotorrespiratorio más corto de 12 h en...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	VWR	10810-070	container for seed sterilization
agarose	VWR	9012-36-6	chemical used to suspend seeds for ease of plating
Arabidopsis thaliana seeds (abcb26)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_085232	arabidopsis seeds used as experimental group
Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_053469C	parental arabidopsis seeds
Arabidopsis thaliana seeds (WT)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	Col-0	arabidopsis wild type seeds used as a control group
bleach	clorox	generic bleach	chemical used to sterilize seeds
Carbolime absorbent	Medline products	S232-104-001	CO2 absorbent
Closed FluorCam	Photon Systems Instruments	FC 800-C	Fluorescence imager
FluoroCam FC 800-C	Photon Systems Instruments	Closed FluorCam FC 800-C/1010-S	Fluorescence imager
FluoroCam7	Photon Systems Instruments	Closed FluorCam FC 800-C/1010-S	Fluorescence image analysis software
Gelzan (plant agar)	Phytotech labs	71010-52-1	chemical used to solidify MS media as plates
glass flask 1 L	Fisherbrand	FB5011000	container for making and autoclaving MS media
growth chamber	caron	7317-50-2	growth chamber used to grow plants
Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS)	Phytotech labs	M5531	growth media for arabidopsis seedlings
potassium Hydroxide (KOH)	Phytotech labs	1310-58-3	make as 1 M solution for ph adjustment
spider lights	Mean Well Enterprises	XLG-100-H-AB	lights used in the light assay
Square Petri Dish with Grid, sterile	Simport Scientific	D21016	used to hold MS media for arabidopsis seedlings
surgical tape	3M	1530-1	tape used to seal plates
tween 20	biorad	9005-64-5	surfactant used to assist seed sterilization