JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

المستقلبات الميكروبية المشتقة من الأمعاء لها تأثيرات متعددة الأوجه تؤدي إلى سلوك معقد في الحيوانات. نحن نهدف إلى توفير طريقة خطوة بخطوة لتحديد آثار المستقلبات الميكروبية المشتقة من الأمعاء في الدماغ عن طريق التسليم داخل البطين عبر قنية دليلية.

Abstract

تم التحقيق على نطاق واسع في تأثير ميكروبات الأمعاء ومستقلباتها على فسيولوجيا المضيف وسلوكه على نطاق واسع في هذا العقد. كشفت العديد من الدراسات أن المستقلبات المشتقة من ميكروبات الأمعاء تعدل الوظائف الفسيولوجية بوساطة الدماغ من خلال مسارات معقدة بين الأمعاء والدماغ في المضيف. الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs) هي المستقلبات الرئيسية المشتقة من البكتيريا التي يتم إنتاجها أثناء تخمير الألياف الغذائية بواسطة ميكروبيوم الأمعاء. يمكن أن تعمل SCFAs المفرزة من الأمعاء في مواقع متعددة في المحيط ، مما يؤثر على الاستجابات المناعية والغدد الصماء والعصبية بسبب التوزيع الواسع لمستقبلات SCFAs. لذلك ، من الصعب التمييز بين الآثار المركزية والطرفية ل SCFAs من خلال الإدارة الفموية وداخل الصفاق ل SCFAs. تقدم هذه الورقة طريقة قائمة على الفيديو لاستجواب الدور الوظيفي ل SCFAs في الدماغ عبر قنية إرشادية في الفئران التي تتحرك بحرية. يمكن تعديل كمية ونوع SCFAs في الدماغ عن طريق التحكم في حجم التسريب ومعدله. يمكن أن توفر هذه الطريقة للعلماء طريقة لتقدير دور المستقلبات المشتقة من الأمعاء في الدماغ.

Introduction

يأوي الجهاز الهضمي البشري كائنات دقيقة متنوعة تؤثر على المضيف1،2،3. يمكن لبكتيريا الأمعاء هذه إفراز مستقلبات مشتقة من الأمعاء أثناء استخدامها للمكونات الغذائية التي يستهلكها المضيف 4,5. ومن المثير للاهتمام ، يمكن نقل مستقلبات الأمعاء غير المستقلب في المحيط إلى أعضاء أخرى عبر الدورة الدموية6. تجدر الإشارة إلى أن هذه المستقلبات المفرزة يمكن أن تكون بمثابة وسطاء لمحور الأمعاء والدماغ ، والذي يعرف بأنه الاتصال ثنائي الاتجاه بين الجهاز العصبي المركزي والأمعاء7. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن المستقلبات المشتقة من الأمعاء يمكن أن تعدل السلوك المعقد والعاطفة في الحيوانات8،9،10،11.

الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs) هي المستقلبات الرئيسية التي تنتجها ميكروبات الأمعاء أثناء تخمير الألياف الغذائية والكربوهيدرات غير القابلة للهضم6. الأسيتات والبروبيونات والزبدات هي SCFAs الأكثر وفرة في الأمعاء12. SCFAs بمثابة مصدر الطاقة للخلايا في الجهاز الهضمي. يمكن نقل SCFAs غير المستقلب في الأمعاء إلى الدماغ من خلال الوريد البابي ، وبالتالي تعديل الدماغ والسلوك 6,12. وقد أشارت الدراسات السابقة إلى أن SCFAs قد تلعب دورا حاسما في الاضطرابات العصبية والنفسية 6,12. على سبيل المثال ، الحقن داخل الصفاق من الزباديات في الفئران BTBR T + Itpr3tf / J (BTBR) ، وهو نموذج حيواني لاضطراب طيف التوحد (ASD) ، أنقذ عجزهم الاجتماعي13. أظهرت الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية التي تتلقى الميكروبات من الأشخاص المصابين بالاكتئاب زيادة في السلوكيات الشبيهة بالقلق و SCFAs البرازية14. سريريا ، لوحظت تغيرات في مستويات SCFAs البرازية في الأشخاص الذين يعانون من ASD مقارنة بالضوابط النامية عادة15,16. الأشخاص الذين يعانون من الاكتئاب لديهم مستويات SCFAs أقل في البراز من الأشخاص الأصحاء17,18. اقترحت هذه الدراسات أن SCFAs يمكن أن تغير السلوك في الحيوانات والبشر من خلال طرق مختلفة.

تمارس المستقلبات الميكروبية تأثيرات متنوعة على مواقع متعددة في الجسم ، مما يؤثر على فسيولوجيا المضيف والسلوكيات 4,19 ، بما في ذلك الجهاز الهضمي والعصب المبهم والعصب الودي. من الصعب تحديد الدور الدقيق للمستقلبات المشتقة من الأمعاء في الدماغ عند إدارة المستقلبات عبر الطرق الطرفية. تقدم هذه الورقة بروتوكولا قائما على الفيديو للتحقيق في آثار المستقلبات المشتقة من الأمعاء في دماغ فأر يتحرك بحرية (الشكل 1). أظهرنا أنه يمكن إعطاء SCFAs بشكل حاد من خلال قنية الدليل أثناء الاختبارات السلوكية. يمكن تعديل نوع وحجم ومعدل ضخ المستقلبات اعتمادا على الغرض. يمكن تعديل موقع القنية لاستكشاف تأثير مستقلبات الأمعاء في منطقة معينة من الدماغ. نحن نهدف إلى تزويد العلماء بطريقة لاستكشاف التأثير المحتمل للمستقلبات الميكروبية المشتقة من الأمعاء على الدماغ والسلوك.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية ورعاية الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات بجامعة تشنغ كونغ الوطنية (NCKU).

1. التحضير لحيوان التجارب

  1. احصل على الفئران الذكور C57BL / 6JNarl من النوع البري من 6 إلى 8 أسابيع من بائع.
  2. قم بإيواء الفئران في قفص فأر قياسي مع تشاو الماوس القياسي والماء المعقم ad libitum.
    ملاحظة: ظروف السكن لمركز حيوانات المختبر في NCKU هي 22 ± درجة حرارة 1 درجة مئوية ، و 55٪ ± رطوبة 10٪ ، ودورة ضوء / ظلام 13 ساعة / 11 ساعة.

2. الجراحة المجسمة

  1. إعداد وتعقيم الأداة المجسمة والأدوات الجراحية والمواد ذات الصلة.
    ملاحظة: يجب تعقيم جميع العناصر التي ستتصل مباشرة بموقع الجراحة لتجنب العدوى.
  2. تخدير الماوس عن طريق وضعه في قفص زجاجي شبكي مع 1٪ -5٪ أيسوفلوران في الأكسجين.
    ملاحظة: راقب الماوس عن كثب لضمان الحفاظ على معدل التنفس عند حوالي نفس واحد في الثانية.
  3. أخرج الماوس من غرفة التخدير. حلق الموقع الجراحي (رأس الماوس) باستخدام أداة تشذيب الحيوانات الأليفة. ضع الماوس على الإطار المجسمة عن طريق تثبيت قواطع الماوس على شريط القواطع في حامل القواطع المجسمة. تغطية الأنف مع قناع مخروط الأنف.
  4. تخدير الفأر مع 1٪ -2.5٪ isoflurane في الأكسجين طوال الجراحة المجسمة. تقييم الإحساس بألم الماوس عبر منعكس قرصة إصبع القدم وضمان معدل تنفس ثابت قبل شق الموقع الجراحي.
  5. ضع وسادة تدفئة (37.0 درجة مئوية) أسفل الماوس على الإطار المجسمة للحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء الجراحة. بدلا من ذلك ، حافظ على درجة الحرارة الأساسية بمساعدة مسبار حراري مستقيمي يربط بين جهاز الدفء المبرمج ووسادة التدفئة.
  6. قم بإزالة الفراء المشذب على الرأس باستخدام شريط لاصق. حقن الفأر مع كيتوبروفين مسكن (5 ملغ / كغ) تحت الجلد لتخفيف الألم. ضع مرهم العين لتجنب جفاف العينين.
  7. أدخل شريط الأذن المدبب في قناة الأذن لإصلاح الرأس.
  8. توسيط الرأس عن طريق ضبط مقياس شريط الأذن.
  9. شد مشبك الأنف على حامل القواطع لتجنب الحركة الرأسية. اضغط على الرأس برفق للتحقق من أن الرأس ثابت وتجنب أن يصبح الرأس فضفاضا أثناء الجراحة اللاحقة.
  10. قم بتطهير فروة الرأس بثلاث مقشرات متناوبة من الكلورهيكسيدين باستخدام قطعة قطن. ابدأ كل مقشر من الوسط نحو الجانب الخارجي (من المنطقة المركزية الأكثر تطهيرا إلى المنطقة الأقل تطهيرا).
    ملاحظة: يمكن أن يساعد استخدام المقشرات من الوسط إلى الخارج العلماء على تقليل العدوى والتلوث من الفراء. المنطقة الخارجية قريبة من منطقة الرأس غير المحلوقة ، والتي لا تزال تحتوي على كمية كبيرة من الفراء وليس من السهل تطهيرها جيدا.
  11. شق فروة الرأس بطريقة أمامية / خلفية (<1 سم) باستخدام شفرة جراحية. افتح الشق وامسح الجمجمة بقطعة قطن تمسك بها ملقط تشريح مجهري.
    ملاحظة: يجب تعقيم ملقط التشريح المجهري والشفرة الجراحية ومسحات القطن عن طريق التعقيم قبل الجراحة. أثناء العملية الجراحية ، قم بتعقيم جميع المعدات الجراحية باستخدام معقم خرز زجاجي (150 درجة مئوية) لمدة 5 ثوان على الأقل قبل وبعد كل. قم بإعداد كوب معقم لحمل الشفرة الجراحية والملقط أثناء العملية الجراحية وبين الحيوانات.
  12. تحديد بريغما ولامدا على الجمجمة. استخدم Bregma كمرجع لتحديد موقع المنطقة محل الاهتمام.
    1. اختياري: قم بتركيب المثقاب المجسمة على حامل المثقاب المجسم، واستخدم طرف المثقاب للإشارة إلى Bregma كمرجع. قم بتعقيم المثقاب المجسمة باستخدام معقم الخرز الزجاجي (150 درجة مئوية) لمدة 5 ثوان على الأقل.
  13. معايرة ومحاذاة المستوى الأفقي للجمجمة المسطحة في المستويات اليسرى / اليمنى والأمامية / الخلفية بواسطة Bregma / Lambda.
    ملاحظة: إذا لم يكن في مستوى أفقي صحيح، فأعد تركيب الماوس على الجهاز المجسم.

3. التجارية دليل مخصص زرع قنية

  1. تحديد وتسمية موضع البطين الجانبي الأيمن، استنادا إلى الإحداثيات المجسمة: المسافة إلى بريغما، الأمامية/الخلفية (A/P): 0.26 مم، الإنسية/الجانبية (M/L): -1.0 مم، الظهرية/البطنية (D/V): -2.0 مم20.
    ملاحظة: يمكن تعديل الإحداثيات استنادا إلى المنطقة محل الاهتمام. استندت إحداثيات البطين الجانبي إلى الفئران البالغة C57BL/6J التي يتراوح وزنها بين 26 و30 جم. إذا تم استخدام الفئران الأصغر سنا ، فراجع المناقشة.
  2. حفر حفرة (قطرها = 1.5 مم) من خلال الجمجمة في الموقع المسمى باستخدام مثقاب مجسمة لزرع قنية دليل تجاري.
  3. حفر اثنين إلى أربعة ثقوب أخرى (قطرها = 1.5 ملم) على الجمجمة باستخدام مثقاب مجسمة لتركيب مسامير الفولاذ المقاوم للصدأ.
    ملاحظة: قم بتعقيم المثقاب المجسمة باستخدام معقم خرز زجاجي (150 درجة مئوية) لمدة 5 ثوان على الأقل قبل وبعد كل.
  4. امسح قصاصات العظام وأوقف النزيف باستخدام قطعة قطن.
  5. امسح الجمجمة باستخدام ليدوكائين (1 ملغم / كغم) باستخدام قطعة قطن للحصول على تأثيرات مخدرة موضعية ومضادة للحكة ومسكنة للألم. إذا لم يتوقف النزيف بعد الحفر ، ضع قطعة قطن بلطف على الحفرة للإرقاء.
  6. قم بتركيب اثنين إلى أربعة مسامير غير قابلة للصدأ على الثقوب لتوفير مراسي لأكريليك الأسنان.
  7. ضع قنية الدليل التجاري على حامل القنية المجسمة وقم بتطهيرها باستخدام معقم الخرز الزجاجي (150 درجة مئوية).
    ملاحظة: تم تخصيص قنية الدليل التجاري والدمية التجارية والحاقن التجاري (الشكل 2A) وفقا للمواصفات الموضحة في جدول المواد.
  8. حرك حامل القنية المجسمة إلى الفتحة المحفورة للبطين الجانبي وأدخل قنية التوجيه التجاري ببطء في الحفرة حتى العمق المطلوب (2.5 مم).
    ملاحظة: يمكن تعريف الإحداثيات الظهرية/البطنية عن طريق تعيين طرف قنية الدليل التجاري كمرجع عندما يتم إدخال الطرف بالكاد في الحفرة.
  9. ضع 10 ميكرولتر من لاصق n-butyl cyanoacrylate (غراء لاصق للأنسجة) لإصلاح قنية الدليل التجاري في الحفرة المحفورة وانتظر لمدة 3-4 دقائق. حرر قنية الدليل التجاري بلطف من حامل القنية المجسمة وانقل الحامل بعيدا.
  10. ضع أكريليك الأسنان على فروة الرأس المحفورة لإصلاح قنية الدليل التجاري وانتظر لمدة 5 دقائق على الأقل. زرع الدمية التجارية في قنية الدليل التجاري لتجنب انسداد القنية بالدم أو سوائل الجسم (الشكل 2B).
  11. حرر شريط الأذن من قناة الأذن وأزل الماوس من الإطار المجسم.
  12. ضع الماوس في قفص جديد مع وسادة تدفئة تحته للتعافي من التخدير وراقب باستمرار حتى يستيقظ الماوس تماما.
    ملاحظة: لا تترك الحيوان دون مراقبة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء الصارم. يجب ألا يعود الحيوان الذي خضع لعملية جراحية إلى صحبة الحيوانات الأخرى حتى يتعافى تماما.
  13. أعد الماوس إلى مسكن واحد أو سكن جماعي ، اعتمادا على بروتوكول IACUC المؤسسي والتصميم التجريبي. بالنسبة للإسكان الجماعي ، تأكد من وجود عدد أقل من الفئران في قفص لتقليل الإصابات غير المرغوب فيها أو انفصال الكانيولا.
  14. قم بإعطاء الإيبوبروفين (0.2 مجم / مل) في مياه الشرب لمدة 3 أيام على الأقل للرعاية بعد العملية الجراحية ، وراقب مرتين في اليوم علامات الألم والضيق لمدة 3 أيام على الأقل.
    1. أثناء الرعاية بعد العملية الجراحية ، ضع مرهم روكسيثروميسين حول الجلد لمنع الالتهاب والعدوى في الفئران.
    2. استمر في مراقبة حالة الحيوان وإعطاء حقن داخل الصفاق في الوقت المناسب من 5٪ من الجلوكوز و / أو 0.9٪ كلوريد الصوديوم لتوفير طاقة كافية.
    3. إذا تدهورت حالة الألم أو الضيق أو العدوى بشكل مطرد ، فقم بالقتل الرحيم للفأر عن طريق استنشاق CO2 .
  15. انتظر لمدة 1 أسبوع بعد العملية حتى يكون الماوس جاهزا للتسليم داخل البطين من SCFAs والاختبارات السلوكية.

4. إعداد SCFAs

  1. قم بإذابة خلات الصوديوم وبوتيرات الصوديوم وبروبيونات الصوديوم في السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي (ACSF) (انظر جدول المواد).
  2. تأكد من إذابة المواد الكيميائية بالكامل ، ثم اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 ، وقم بتصفية خليط SCFAs من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر للتعقيم.

5. إعداد نظام التسريب للتوصيل داخل البطين من SCFAs أثناء الاختبار السلوكي

  1. قم بتركيب كاميرا سقف لتسجيل السلوك. قم بتوصيل الكاميرا بجهاز كمبيوتر للتحكم في برنامج تسجيل الفيديو (الشكل 3).
  2. املأ حقنة 10 ميكرولتر بالماء المقطر.
    ملاحظة: تجنب فقاعات الهواء في حقنة الميكرولتر.
  3. قم بتوصيل مضخة الحقن المجهري بوحدة التحكم في الحقن المجهري.
  4. قم بتركيب حقنة الميكرولتر على مضخة الحقن المجهري. لتثبيت المحقنة ، اضغط على الزر لتخفيف المشبك وتثبيت المحقنة على الموضع المقابل. أغلق المشبك وقم بتشديد المسمار الذي يحتفظ بالمكبس على مضخة الحقن المجهري (الشكل 4A).
  5. أدخل الحاقن التجاري في أنبوب البولي إيثيلين (الشكل 2A).
  6. قم بتعليق أنبوب البولي إيثيلين على كاميرا السقف فوق ساحة الاختبار.
  7. املأ أنبوب البولي إيثيلين بالماء المقطر باستخدام حقنة الأنسولين. قم بتوصيل حقنة الميكرولتر بأنبوب البولي إيثيلين المعلق.
    ملاحظة: تأكد من أن أنبوب البولي إيثيلين طويل بما يكفي للسماح للماوس بالتحرك بحرية في جميع أنحاء ساحة الاختبار.

6. إعدادات النظام من وحدة تحكم الحقن المجهري

  1. قم بتشغيل وحدة التحكم في الحقن المجهري واضغط على عرض جميع القنوات للوصول إلى شاشة الأوامر (الشكل 4C). اضغط على التكوين واضبط مستوى الصوت المستهدف على 9800 نانولتر مع معدل التسليم إلى 100 نانولتر/ثانية. قم ببث 9800 نانولتر من الماء المقطر من أنبوب البولي إيثيلين المتصل بحقنة الميكرولتر (اضغط على الاتجاه للتبديل إلى وضع Infuse واضغط على RUN) (انظر المربعات الحمراء في شاشة الأوامر في الشكل 4C).
  2. اضغط على التكوين واضبط مستوى الصوت المستهدف على 3000 نانولتر مع معدل التسليم إلى 100 نانولتر/ثانية. اسحب 3000 نانولتر من الزيت المعدني (اضغط على الاتجاه للتبديل إلى وضع السحب واضغط على RUN) (انظر المربعات الحمراء في شاشة الأوامر في الشكل 4C).
    ملاحظة: يجب ملاحظة فصل واضح بين الزيت والماء على أنبوب البولي إيثيلين.
  3. قم بتفكيك أنبوب البولي إيثيلين من إبرة حقنة الميكرولتر. بصق 3000 نانولتر من الماء المقطر من إبرة حقنة ميكرولتر (اضغط على الاتجاه للتبديل إلى وضع Infuse واضغط على RUN).
  4. أدخل حقنة الميكرولتر مرة أخرى في أنبوب البولي إيثيلين. اضغط على التكوين واضبط مستوى الصوت المستهدف على 9500 نانولتر مع معدل التسليم إلى 100 نانولتر/ثانية. سحب 9500 نانولتر من SCFAs (اضغط على الاتجاه للتبديل إلى وضع السحب واضغط على RUN). قم بتسمية مرحلة SCFAs النفطية للتحقق مما إذا كان قد تم غرس SCFAs بنجاح.
  5. اضغط على التكوين واضبط هدف مستوى الصوت المطلوب بمعدل التسليم على 7 nL / s. اضغط على الاتجاه للتبديل إلى وضع Infuse (انظر المربعات الحمراء في شاشة الأوامر في الشكل 4C).
    ملاحظة: تحديد وحدة التخزين استنادا إلى وقت التسريب. على سبيل المثال ، إذا كان وقت التسريب هو 3 دقائق لمعدل التسليم البالغ 7 nL / s ، فإن الحجم المستهدف = 1,260 nL.
  6. اضغط على RUN لبث حقنة الميكرولتر إلى الأمام حتى يخرج السائل في الطرف الأمامي من الحاقن التجاري قبل إدخال الحاقن في القنية لحقن SCFAs.

7. ضخ SCFAs في البطين الجانبي من خلال قنية الدليل التجاري في الفأر المتحرك بحرية

  1. تخدير الماوس عن طريق وضعه في قفص زجاجي شبكي مع 1٪ -5٪ أيسوفلوران في الأكسجين.
    ملاحظة: راقب الماوس عن كثب لضمان الحفاظ على معدل التنفس عند حوالي نفس واحد في الثانية.
  2. قشر الماوس وأدخل الحاقن التجاري في قنية الدليل التجاري (الشكل 4B).
    ملاحظة: إذا كانت قنية الدليل التجاري متصلة بالدم أو سائل الجسم، فقم بفكها بلطف باستخدام ملاقط.
  3. اسمح للفأر بالتعافي من التخدير لمدة 15 دقيقة في قفص قبل الاختبار السلوكي.
  4. لاختبار الحركة الأساسي ، ضع الماوس في قفص جديد واسمح له بالاستكشاف بحرية لمدة 35 دقيقة. قم ببث SCFAs باستخدام معدل تسليم يبلغ 7 nL / s لحجم مستهدف يبلغ 2100 nL في أول 5 دقائق (اضغط على الاتجاه إلى وضع Infuse واضغط على RUN).
    ملاحظة: يمكن تحليل الحركة في قفص الرواية باستخدام برنامج تتبع الفيديو لسلوك الحيوان21,22.
  5. تخدير الماوس (تكرار الخطوة 7.1) وإزالة الحاقن التجاري من قنية الدليل التجاري.
    ملاحظة: يمكن حقن الماوس بشكل متكرر بعناصر تحكم / مستقلبات مختلفة بعد إعطاء المدة الزمنية المناسبة لغسل الحقن السابق. طالما أن القنية مثبتة على رأس الفأر ، يمكن اختبار الماوس بشكل متكرر باستخدام مستقلبات مختلفة.

8. استعادة نظام الحقن المجهري

  1. قم بتفكيك أنبوب البولي إيثيلين من حقنة الميكرولتر.
  2. حقن الهواء في الأنبوب باستخدام حقنة الأنسولين للتخلص من الماء المقطر في أنبوب البولي إيثيلين. إفراغ حقنة ميكرولتر.
  3. اضغط على Reset Pos على شاشة التكوين لفتح شاشة تعريف إيقاف المحاقن (الشكل 4C).
  4. اضغط على مفتاح سحب حتى يصدر صوت صفير لإعادة ضبط مضخة الحقن المجهري على الموضع المسحوب بالكامل (الشكل 4C).
  5. ارجع إلى شاشة الأوامر وقم بإيقاف تشغيل وحدة التحكم في الحقن المجهري إذا كانت هناك علامة ** END REACHED** على هذه الشاشة (الشكل 4C).

9. اختياري: التحقق من صحة الحقن داخل البطين عن طريق التتبع العصبي

  1. غرس 2100 نانولتر من المقتفي العصبي بمعدل تسليم 7 نانولتر / ثانية للتحقق من موقع التسريب.
    ملاحظة: اترك الحاقن في قنية التوجيه لمدة 5 دقائق لمنع التدفق العكسي.
  2. تخدير الفأر عن طريق جرعة زائدة من الايزوفلوران (5 ٪) بعد 30 دقيقة من ضخ المقتفي العصبي.
  3. تحقق من معدل التنفس ومنعكس قرصة الذيل / المخلب في الماوس المخدر.
    ملاحظة: يجب ألا تستجيب الفئران قبل الخطوة التالية.
  4. قم بعمل شق 4-5 سم عبر الجلد والعضلات وجدار البطن أسفل القفص الصدري.
  5. حرك الكبد قليلا بعيدا عن الحجاب الحاجز بعناية.
  6. شق الحجاب الحاجز لفضح قلب الماوس.
  7. قم باختراق الماوس عبر القلب مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وبارافورمالديهايد بارد بنسبة 4٪ في PBS.
  8. قطع رأس الفأر وتشريح الدماغ بعناية باستخدام ملقط تشريح مجهري ومقص تشريح مجهري لإخراج الدماغ كله23. ضع عينات الدماغ في بارافورمالدهيد 4٪ بارد في PBS لمدة 3-4 أيام واغسلها 3 × 5 دقائق باستخدام PBS.
  9. قطع الدماغ إلى قسمين في حامل شريحة دماغ الفأر في الجزء الثامن من حامل شريحة دماغ الفأر (1 مم / مقطع) من الاتجاه الأمامي إلى الخلفي. ضع الدماغ في قالب التضمين وقم بتضمين عينات الدماغ في أغاروز منخفض الانصهار (4٪ في PBS).
  10. قم بلصق الدماغ المضمن في الأغاروز على مرحلة الاهتزاز باستخدام الغراء الفائق. قسم الدماغ بشكل كورانيكي إلى شرائح دماغية 50 ميكرومتر باستخدام الاهتزاز.
  11. احتضان شرائح الدماغ في الجسم المضاد الذي يستهدف المقتفي العصبي المخفف في المخزن المؤقت المانع (تخفيف 1: 1000) بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يحتوي المخزن المؤقت المانع على 10٪ من مصل الحصان و 0.1٪ Triton X-100 و 0.02٪ من أزيد الصوديوم.
  12. اغسل الشرائح 3 × 5 دقائق باستخدام PBST (PBS مع 0.1٪ triton X-100).
  13. احتضان شرائح الدماغ في الجسم المضاد الثانوي المترافق مع صبغة التألق المخفف في المخزن المؤقت المانع (تخفيف 1:500) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  14. اغسل الشرائح 3 × 5 دقائق باستخدام PBS.
  15. قم بتركيب شرائح الدماغ على الشريحة باستخدام وسط تركيب يحتوي على 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
  16. قم بتغطية الشريحة بغطاء مجهري.
  17. ضع طلاء الأظافر على حافة الانزلاق لتجنب تسرب وسط التركيب.
  18. بعد الحضانة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء ، قم بتصوير إشارة التألق في موقع التسريب باستخدام مجهر التألق.

10. اختياري: ضخ المستقلبات من خلال قنية دليل الفولاذ المقاوم للصدأ مخصصة في البطين الجانبي في الفئران

  1. اتبع أقسام البروتوكول 1-8 واستبدل قنية الدليل التجاري بقنية دليل من الفولاذ المقاوم للصدأ لبث المواد الكيميائية من خلال حاقن الفولاذ المقاوم للصدأ في الماوس.
    ملاحظة: يتم توضيح إيجابيات وسلبيات مختلف القنيبات التجارية والفولاذ المقاوم للصدأ في قسم المناقشة.
  2. قم بإجراء البروتوكول الجراحي بنفس الطريقة الموضحة في قسمي البروتوكول 2 و 3 ، باستثناء تذكر استبدال قنية الدليل التجاري بقنية دليل من الفولاذ المقاوم للصدأ (الشكل 5B).
    ملاحظة: تم تخصيص قنية دليل الفولاذ المقاوم للصدأ ، وهمية الفولاذ المقاوم للصدأ ، وحاقن الفولاذ المقاوم للصدأ (الشكل 5A) مع المواصفات الموضحة في جدول المواد. أدخل قنية التوجيه المخصصة من الفولاذ المقاوم للصدأ في الحفرة حتى العمق المطلوب (2.0 مم).
  3. قم ببث SCFAs عبر قنية دليل الفولاذ المقاوم للصدأ باستخدام نظام الحقن المجهري الذي يتكون من وحدة التحكم في الحقن المجهري ومضخة الحقن المجهري (الشكل 4B) (نفس أقسام البروتوكول 4-7). بالنسبة لدمية الفولاذ المقاوم للصدأ لقنية دليل الفولاذ المقاوم للصدأ ، قم بثني جانب واحد من حاقن الفولاذ المقاوم للصدأ بلطف حتى يصبح طرف الجانب الآخر أطول بمقدار 1 مم من قنية التوجيه المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ.
  4. غرس 2100 نانولتر من المقتفي العصبي من خلال قنية دليل الفولاذ المقاوم للصدأ في البطين الجانبي في الفئران (نفس قسم البروتوكول 9).
  5. اجمع العينة لمدة 30 دقيقة بعد ضخ التتبع العصبي (مثل قسم البروتوكول 9).
  6. قم بإجراء الحصول على الصور في شرائح الدماغ المشبعة بالمقتفي العصبي (مثل قسم البروتوكول 9).

النتائج

تم غرس الفأر مع SCFAs 1 بعد أسبوع من الشفاء من زرع قنية الدليل لتقييم النشاط الحركي في قفص جديد. تم وضع الفأر في قفص جديد وغرسه مع 2100 نانولتر من SCFAs أو ACSF في أول 5 دقائق (معدل تسليم 7 nL / s) في الدماغ من خلال قنية الدليل التجاري المزروعة في البطين الجانبي للدماغ. تم تسجيل النشاط الحركي في قفص جديد لمد...

Discussion

ارتبطت المستقلبات المشتقة من الأمعاء بأمراض بوساطة الدماغ دون آلية دقيقة للغاية ، ويرجع ذلك جزئيا إلى مواقع ارتباطها المتعددة في الجسم6،12،24. أشارت التقارير السابقة إلى أن SCFAs يمكن أن تكون بمثابة روابط للمستقبلات المرتبطة بالبروتين G ، وا...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذا العمل.

Acknowledgements

نحن نقدر موظفي مركز المختبر في جامعة تشنغ كونغ الوطنية (NCKU) لرعاية الحيوانات. تم دعم هذا العمل من خلال المنحة الدراسية المقدمة من صندوق البروفيسور كون ين هوانغ للتعليم التابع لمؤسسة تشنغ - هسينغ الطبية إلى C.-W.L. ؛ الأموال من وزارة العلوم والتكنولوجيا (MOST) في تايوان: (البحوث الجامعية MOST 109-2813-C-006-095-B) إلى T.-H.Y. ؛ (معظم 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) إلى W.-L.W.; ومشروع براعم التعليم العالي ، وزارة التربية والتعليم إلى مقر التقدم الجامعي في NCKU إلى W.-L.W.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41Pfizern/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbitThermoFisher ScientificA-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal)MilliporeAB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, SterileNEST121921LA01
CaCl2 Sigma-AldrichC1016ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2%PhoenixNDC 57319-611-09
Chlorhexidine solutionPhoenixNDC 57319-599-09
Commercial dummyRWD Life Science62004Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannulRWD Life Science62104Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injectorRWD Life Science62204Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylicHYGENICn/a
Fixing screwsRWD Life Science62521
Fluoroshield mounting medium with DAPIAbcamAB104139
Horse serumThermoFisher Scientific16050130
Insulin syringesBBraunXG-LBB-9151133S-1BX1 mL
Isoflurane Panion & BF biotechDG-4900-250D
KCl Sigma-AldrichP3911ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen Swiss Pharmaceuticaln/a
Lidocaine AstraZenecan/a
Low melting point agaroseInvitrogen16520
MgCl2 Sigma-AldrichM8266ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slipsMARIENFELD101242
Microscope slidesThermoFisher Scientific4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NFMacron Fine ChemicalsMA-6358-04
NaCl Sigma-AldrichS9888ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4 Sigma-AldrichS8282ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3 Sigma-AldrichS5761ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue)3M1469SB3M Vetbond
Neural tracer Santa CruzSC-358883FluoroGold
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Polyethylene tubeRWD Life Science62329OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) OintmentDechra 12920060
Sodium acetate Sigma-AldrichS2889SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide Sigma-AldrichS2002
Sodium butyrate Sigma-AldrichB5887SCFAs: 8 mM
Sodium propionate Sigma-AldrichP1880SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannulaChun Ta stainless steel enterprise CO., LTD.n/aOD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injectorChun Ta stainless steel enterprise CO., LTD.n/aOD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
SuperglueKrazy GlueKG94548R
Triton X-100Merck1.08603.1000
Equipment
Cannula holderRWD Life ScienceB485-68217
Ceiling cameraFOSCAMR2
Digital stereotaxic instrumentsStoelting51730D
Dissecting microscopeINNOVIEWSEM-HT/TW
Glass Bead SterilizerRWD Life ScienceRS1501
Heating padStoelting53800M
Leica microscope LeicaDM2500
Micro Dissecting ForcepsROBOZRS-5136Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting ScissorsROBOZRS-59184.5" Angled Sharp
Microinjection controllerWorld Precision Instruments (WPI)MICRO2TSMARTouch Controller
Microinjection syringe pumpWorld Precision Instruments (WPI)UMP3T-1UltraMicroPump3  
Microliter syringeHamilton8001410 µL
Optical Fiber Cold Light with double FiberStepLGY-150Local vendor
Pet trimmerWAHL09962-2018
Vaporiser for IsofluraneStepAS-01Local vendor
VibratomeLeicaVT1000S
Software
Animal behavior video tracking softwareNoldusEthoVisionVersion: 15.0.1416
Leica Application Suite X softwareLeicaLASXVersion: 3.7.2.22383

References

  1. Lynch, J. B., Hsiao, E. Y. Microbiomes as sources of emergent host phenotypes. Science. 365 (6460), 1405-1409 (2019).
  2. Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome-gut-brain axis in health and disease. Gastroenterology Clinics of North America. 46 (1), 77-89 (2017).
  3. Sharon, G., Sampson, T. R., Geschwind, D. H., Mazmanian, S. K. The central nervous system and the gut microbiome. Cell. 167 (4), 915-932 (2016).
  4. Krautkramer, K. A., Fan, J., Backhed, F. Gut microbial metabolites as multi-kingdom intermediates. Nature Reviews: Microbiology. 19 (2), 77-94 (2021).
  5. Lavelle, A., Sokol, H. Gut microbiota-derived metabolites as key actors in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 223-237 (2020).
  6. Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. The role of short-chain fatty acids in microbiota-gut-brain communication. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 16 (8), 461-478 (2019).
  7. Morais, L. H., Schreiber, H. L. T., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews: Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  8. Sharon, G., et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).
  9. St Laurent, R., O'Brien, L. M., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
  10. Govindarajan, N., Agis-Balboa, R. C., Walter, J., Sananbenesi, F., Fischer, A. Sodium butyrate improves memory function in an Alzheimer's disease mouse model when administered at an advanced stage of disease progression. Journal of Alzheimer's Disease. 26 (1), 187-197 (2011).
  11. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  12. Silva, Y. P., Bernardi, A., Frozza, R. L. The role of short-chain fatty acids from gut microbiota in gut-brain communication. Frontiers in Endocrinology. 11, 25 (2020).
  13. Kratsman, N., Getselter, D., Elliott, E. Sodium butyrate attenuates social behavior deficits and modifies the transcription of inhibitory/excitatory genes in the frontal cortex of an autism model. Neuropharmacology. 102, 136-145 (2016).
  14. Kelly, J. R., et al. Transferring the blues: Depression-associated gut microbiota induces neurobehavioural changes in the rat. Journal of Psychiatric Research. 82, 109-118 (2016).
  15. Wang, L., et al. Elevated fecal short chain fatty acid and ammonia concentrations in children with autism spectrum disorder. Digestive Diseases and Sciences. 57 (8), 2096-2102 (2012).
  16. Adams, J. B., Johansen, L. J., Powell, L. D., Quig, D., Rubin, R. A. Gastrointestinal flora and gastrointestinal status in children with autism--comparisons to typical children and correlation with autism severity. BMC Gastroenterology. 11, 22 (2011).
  17. Skonieczna-Zydecka, K., et al. Faecal short chain fatty acids profile is changed in Polish depressive women. Nutrients. 10 (12), 1939 (2018).
  18. Szczesniak, O., Hestad, K. A., Hanssen, J. F., Rudi, K. Isovaleric acid in stool correlates with human depression. Nutritional Neuroscience. 19 (7), 279-283 (2016).
  19. Martin, A. M., Sun, E. W., Rogers, G. B., Keating, D. J. The influence of the gut microbiome on host metabolism through the regulation of gut hormone release. Frontiers in Physiology. 10, 428 (2019).
  20. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . Paxinos and Franklin's The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).
  21. York, J. M., Blevins, N. A., McNeil, L. K., Freund, G. G. Mouse short- and long-term locomotor activity analyzed by video tracking software. Journal of Visualized Experiments. (76), e50252 (2013).
  22. Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice. Journal of Visualized Experiments. (164), e61023 (2020).
  23. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments. (168), e61941 (2021).
  24. Needham, B. D., Kaddurah-Daouk, R., Mazmanian, S. K. Gut microbial molecules in behavioural and neurodegenerative conditions. Nature Reviews: Neuroscience. 21 (12), 717-731 (2020).
  25. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
  26. Xiaoguang, W., et al. Establishment of a valuable mimic of Alzheimer's disease in rat animal model by intracerebroventricular injection of composited amyloid beta protein. Journal of Visualized Experiments. (137), e56157 (2018).
  27. Venniro, M., Shaham, Y. An operant social self-administration and choice model in rats. Nature Protocols. 15 (4), 1542-1559 (2020).
  28. Ucal, M., et al. Rat model of widespread cerebral cortical demyelination induced by an intracerebral injection of pro-inflammatory cytokines. Journal of Visualized Experiments. (175), e57879 (2021).
  29. Oberrauch, S., et al. Intraventricular drug delivery and sampling for pharmacokinetics and pharmacodynamics study. Journal of Visualized Experiments. (181), e63540 (2022).
  30. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injections of the enteric bacterial metabolic product propionic acid impair cognition and sensorimotor ability in the Long-Evans rat: further development of a rodent model of autism. Behavioural Brain Research. 200 (1), 33-41 (2009).
  31. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injection of propionic acid, an enteric metabolite implicated in autism, induces social abnormalities that do not differ between seizure-prone (FAST) and seizure-resistant (SLOW) rats. Behavioural Brain Research. 278, 542-548 (2015).
  32. Perry, R. J., et al. Acetate mediates a microbiome-brain-beta-cell axis to promote metabolic syndrome. Nature. 534 (7606), 213-217 (2016).
  33. Muller, P. A., et al. Microbiota modulate sympathetic neurons via a gut-brain circuit. Nature. 583 (7816), 441-446 (2020).
  34. Pardridge, W. M. CSF, blood-brain barrier, and brain drug delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 13 (7), 963-975 (2016).
  35. Wu, J. -. T., et al. Oral short-chain fatty acids administration regulates innate anxiety in adult microbiome-depleted mice. Neuropharmacology. , (2022).
  36. Lee, J., et al. Gut microbiota-derived short-chain fatty acids promote poststroke recovery in aged mice. Circulation Research. 127 (4), 453-465 (2020).
  37. Chiu, C., et al. Temporal course of cerebrospinal fluid dynamics and amyloid accumulation in the aging rat brain from three to thirty months. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 3 (2012).
  38. Schuler, B., Rettich, A., Vogel, J., Gassmann, M., Arras, M. Optimized surgical techniques and postoperative care improve survival rates and permit accurate telemetric recording in exercising mice. BMC Veterinary Research. 5, 28 (2009).
  39. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  40. Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
  41. de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
  42. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
  43. Wolter, J. M., et al. Cas9 gene therapy for Angelman syndrome traps Ube3a-ATS long non-coding RNA. Nature. 587 (7833), 281-284 (2020).
  44. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses for combinatorial cell-subclass-specific labeling. Neuron. 109 (9), 1449-1464 (2021).
  45. Xie, M., et al. TREM2 interacts with TDP-43 and mediates microglial neuroprotection against TDP-43-related neurodegeneration. Nature Neuroscience. 25 (1), 26-38 (2022).
  46. Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
  47. Bermudez-Martin, P., et al. The microbial metabolite p-Cresol induces autistic-like behaviors in mice by remodeling the gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 157 (2021).
  48. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  49. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).
  50. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  51. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  52. Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  53. Kaelberer, M. M., et al. A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction. Science. 361 (6408), (2018).
  54. Needham, B. D., Tang, W., Wu, W. L. Searching for the gut microbial contributing factors to social behavior in rodent models of autism spectrum disorder. Developmental Neurobiology. 78 (5), 474-499 (2018).
  55. Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
  56. Chu, C., et al. The microbiota regulate neuronal function and fear extinction learning. Nature. 574 (7779), 543-548 (2019).
  57. Wu, W. L., et al. Microbiota regulate social behaviour via stress response neurons in the brain. Nature. 595 (7867), 409-414 (2021).
  58. Buchanan, K. L., et al. The preference for sugar over sweetener depends on a gut sensor cell. Nature Neuroscience. 25 (2), 191-200 (2022).
  59. Han, W., et al. A neural circuit for gut-induced reward. Cell. 175 (3), 665-678 (2018).
  60. Yamawaki, Y., et al. Antidepressant-like effect of sodium butyrate (HDAC inhibitor) and its molecular mechanism of action in the rat hippocampus. World Journal of Biological Psychiatry. 13 (6), 458-467 (2012).
  61. Ho, L., et al. Protective roles of intestinal microbiota derived short chain fatty acids in Alzheimer's disease-type beta-amyloid neuropathological mechanisms. Expert Review of Neurotherapeutics. 18 (1), 83-90 (2018).
  62. Liu, J., et al. Anti-neuroinflammatory effect of short-chain fatty acid acetate against Alzheimer's disease via upregulating GPR41 and inhibiting ERK/JNK/NF-kappaB. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (27), 7152-7161 (2020).
  63. van de Wouw, M., et al. Short-chain fatty acids: microbial metabolites that alleviate stress-induced brain-gut axis alterations. Jounal of Physiology. 596 (20), 4923-4944 (2018).
  64. Olson, C. A., et al. The gut microbiota mediates the anti-seizure effects of the ketogenic diet. Cell. 173 (7), 1728-1741 (2018).
  65. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved