JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

למטבוליטים מיקרוביאליים שמקורם במעיים יש השפעות רבות פנים המובילות להתנהגות מורכבת אצל בעלי חיים. אנו שואפים לספק שיטה שלב אחר שלב כדי להגדיר את ההשפעות של מטבוליטים מיקרוביאליים שמקורם במעיים במוח באמצעות העברה תוך-חדרית באמצעות צינורית מנחה.

Abstract

ההשפעה של מיקרוביוטה של המעיים והמטבוליטים שלהם על הפיזיולוגיה וההתנהגות של המארחים נחקרה בהרחבה בעשור זה. מחקרים רבים גילו כי מטבוליטים שמקורם במיקרוביוטה של המעיים מווסתים תפקודים פיזיולוגיים בתיווך המוח באמצעות מסלולים מורכבים בין המעי למוח אצל הפונדקאי. חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFAs) הן המטבוליטים העיקריים שמקורם בחיידקים המיוצרים במהלך תסיסת סיבים תזונתיים על-ידי המיקרוביום של המעי. SCFAs מופרשים מהמעיים יכולים לפעול באתרים רבים בפריפריה, ולהשפיע על התגובה החיסונית, האנדוקרינית והעצבית עקב התפוצה העצומה של קולטני SCFAs. לכן, מאתגר להבדיל בין ההשפעות המרכזיות וההיקפיות של SCFAs באמצעות מתן פומי ותוך-צפקי של SCFAs. מאמר זה מציג שיטה מבוססת וידאו לחקור את התפקיד התפקודי של SCFAs במוח באמצעות צינורית מנחה בעכברים הנעים בחופשיות. ניתן להתאים את כמות וסוג ה-SCFAs במוח על ידי שליטה בנפח ובקצב העירוי. שיטה זו יכולה לספק למדענים דרך להעריך את תפקידם של מטבוליטים שמקורם במעיים במוח.

Introduction

מערכת העיכול האנושית מכילה מיקרואורגניזמים מגוונים המשפיעים על המארח 1,2,3. חיידקי המעיים האלה יכולים להפריש מטבוליטים שמקורם במעיים במהלך השימוש שלהם ברכיבים תזונתיים הנצרכים על-ידי המארח 4,5. באופן מעניין, מטבוליטים של המעיים שאינם מטבוליסטים בפריפריה יכולים להיות מועברים לאיברים אחרים דרך מחזור6. שימו לב שהמטבוליטים המופרשים האלה יכולים לשמש כמתווכים לציר המעי-מוח, המוגדר כתקשורת דו-כיוונית בין מערכת העצבים המרכזית למעי7. מחקרים קודמים הראו כי מטבוליטים שמקורם במעיים יכולים לווסת התנהגות ורגש מורכבים אצל בעלי חיים 8,9,10,11.

חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFAs) הן המטבוליטים העיקריים המיוצרים על-ידי מיקרוביוטה של המעיים במהלך תסיסה של סיבים תזונתיים ופחמימות בלתי ניתנות לעיכול6. אצטט, פרופיונאט ובוטיראט הם ה-SCFAs הנפוצים ביותר במעיים12. SCFAs משמשים כמקור אנרגיה לתאים במערכת העיכול. SCFAs לא מטבוליים במעיים יכולים להיות מועברים למוח דרך וריד הפורטל, ובכך לווסת את המוח ואת ההתנהגות 6,12. מחקרים קודמים הציעו כי SCFAs עשויים למלא תפקיד קריטי בהפרעות נוירופסיכיאטריות 6,12. לדוגמה, הזרקה תוך-צפקית של בוטיראט בעכברי BTBR T+ Itpr3tf/J (BTBR), מודל חייתי של הפרעת ספקטרום האוטיזם (ASD), הצילה את הגירעונות החברתיים שלהם13. חולדות שטופלו באנטיביוטיקה וקיבלו מיקרוביוטה מנבדקים דיכאוניים הראו עלייה בהתנהגויות דמויות חרדה וב-SCFAs צואתיים14. מבחינה קלינית, שינויים ברמות SCFAs בצואה נצפו אצל אנשים עם ASD בהשוואה לקבוצת הביקורתהמתפתחת בדרך כלל 15,16. לאנשים עם דיכאון יש רמות נמוכות יותר של SCFAs בצואה מאשרלנבדקים בריאים 17,18. מחקרים אלה הציעו כי SCFAs יכולים לשנות התנהגות אצל בעלי חיים ובני אדם באמצעות מסלולים שונים.

מטבוליטים מיקרוביאליים מפעילים השפעות מגוונות על אתרים רבים בגוף, ומשפיעים על הפיזיולוגיה וההתנהגויות של המארח 4,19, כולל מערכת העיכול, עצב הוואגוס והעצב הסימפתטי. קשה להצביע על התפקיד המדויק של מטבוליטים שמקורם במעיים במוח בעת מתן המטבוליטים דרך נתיבים היקפיים. המאמר הזה מציג פרוטוקול מבוסס וידאו כדי לחקור את ההשפעות של מטבוליטים שמקורם במעיים במוחו של עכבר שנע בחופשיות (איור 1). הראינו כי ניתן לתת SCFAs באופן חריף דרך צינורית המדריך במהלך מבחנים התנהגותיים. ניתן לשנות את הסוג, הנפח וקצב העירוי של מטבוליטים בהתאם למטרה. ניתן לכוונן את אתר הקנוליזציה כדי לחקור את ההשפעה של מטבוליטים במעיים באזור מסוים במוח. אנו שואפים לספק למדענים שיטה לחקור את ההשפעה הפוטנציאלית של מטבוליטים מיקרוביאליים שמקורם במעיים על המוח ועל ההתנהגות.

Protocol

כל פרוטוקולי הניסוי והטיפול בבעלי החיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת צ'נג קונג (NCKU) (IACUC).

1. הכנה לחיה הניסיונית

  1. השג עכברים זכרים מסוג C57BL/6JNarl בני 6-8 שבועות מספקים פרטיים.
  2. אחסן את העכברים בכלוב עכברים סטנדרטי עם צ'או עכבר סטנדרטי ומים מעוקרים ad libitum.
    הערה: תנאי הדיור של מרכז חיות המעבדה של NCKU הם טמפרטורה של 22 ± 1 מעלות צלזיוס, 55% ± 10% לחות, ומחזור אור/חושך של 13 שעות/11 שעות.

2. ניתוח סטריאוטקסי

  1. הכן ועקר את המכשיר הסטריאוטקסי, כלי הניתוח והפריטים הקשורים.
    הערה: כל הפריטים שייגעו ישירות עם אתר הניתוח צריכים להיות מעוקרים כדי למנוע זיהום.
  2. הרדמת העכבר על ידי הצבתו בכלוב הפרספקס עם 1%-5% איזופלורן בחמצן.
    הערה: התבונן מקרוב בעכבר כדי להבטיח שקצב הנשימה נשמר בסביבות נשימה אחת בשנייה.
  3. הוציאו את העכבר מתא ההרדמה. לגלח את האתר כירורגי (ראש עכבר) עם גוזם לחיות מחמד. הנח את העכבר על המסגרת הסטריאוטקסית על-ידי קיבוע החותכות של העכבר על מוט החותך במחזיק החותך הסטריאוטקסי. מכסים את האף במסכת האף.
  4. הרדימו את העכבר עם 1%-2.5% איזופלורן בחמצן לאורך כל הניתוח הסטריאוטקסי. להעריך את nociception של העכבר באמצעות רפלקס צביטה הבוהן ולהבטיח קצב נשימה קבוע לפני חתיך את האתר כירורגי.
  5. הניחו כרית חימום (37.0°C) מתחת לעכבר על המסגרת הסטריאוטקסית כדי לשמור על טמפרטורת הגוף במהלך הניתוח. לחלופין, שמרו על טמפרטורת הליבה בעזרת בדיקה תרמית רקטלית המחברת בין המחמם המתוכנת לבין כרית החימום.
  6. הסר את הפרווה הגזומה על הראש באמצעות סרט דבק. להזריק לעכבר Ketoprofen משכך כאבים (5 מ"ג / ק"ג) תת עורית כדי להקל על הכאב. יש למרוח משחת עיניים כדי למנוע יובש בעיניים.
  7. הכנס את מוט האוזן המחודד לתעלת האוזן כדי לתקן את הראש.
  8. מרכזו את הראש על ידי התאמת קנה המידה של מוט האוזניים.
  9. הדקו את מהדק האף על מחזיק החותך כדי למנוע תזוזה אנכית. לחץ על הראש בעדינות כדי לבדוק שהראש קבוע ולמנוע מהראש להשתחרר במהלך הניתוח הבא.
  10. יש לחטא את הקרקפת באמצעות שלושה קרצופים מתחלפים של כלורהקסידין באמצעות צמר גפן. התחילו כל קרצוף מהאמצע לכיוון הצד החיצוני (מהאזור המרכזי הכי מחוטא לאזור הכי פחות מחוטא).
    הערה: השימוש בפילינגים מהאמצע ועד החוץ יכול לעזור למדענים למזער את הזיהום והזיהום מהפרווה. האזור החיצוני קרוב לאזור הראש הלא מגולח, שעדיין יש בו כמות גדולה של פרווה ולא קל לחטא אותו ביסודיות.
  11. יש לחדור את הקרקפת באופן קדמי/אחורי (<1 ס"מ) באמצעות להב ניתוחי. פותחים את החתך ומנגבים את הגולגולת בעזרת צמר גפן המוחזק על ידי מלקחיים זעירים.
    הערה: יש לעקר את המלקחיים הזעירים, הלהב הכירורגי ומקלוני הכותנה על ידי אוטוקלבינג לפני הניתוח. במהלך התהליך הכירורגי, לעקר את כל הציוד הכירורגי באמצעות מחטא חרוזי זכוכית (150 מעלות צלזיוס) למשך 5 שניות לפחות לפני ואחרי כל חיה. הכינו מעוקרת להחזקת להב הניתוח והמלקחיים במהלך התהליך הכירורגי ובין בעלי חיים.
  12. זהה את ברגמה ולמבדה על הגולגולת. השתמש ב- Bregma כהפניה לאיתור אזור העניין.
    1. אופציונלי: הרכב את המקדחה הסטריאוטקסית על מחזיק המקדחה הסטריאוטקסית, והשתמש בקצה המקדחה כדי להצביע על ברגמה כהפניה. יש לעקר את המקדחה הסטריאוטקסית באמצעות מעקר חרוזי הזכוכית (150 מעלות צלזיוס) למשך 5 שניות לפחות.
  13. כייל ויישר את המישור האופקי השטוח של הגולגולת במישורים שמאליים/ימניים וקדמיים/אחוריים על ידי Bregma/Lambda.
    הערה: אם לא במישור אופקי נכון, טען מחדש את העכבר על המכשיר הסטריאוטקסי.

3. השתלת צינורית מדריך מותאם אישית מסחרית

  1. זהה ותייג את מיקום החדר הלטרלי הימני, בהתבסס על הקואורדינטות הסטריאוטקסיות: מרחק לברגמה, קדמית/אחורית (A/P): 0.26 מ"מ, מדיאלית/צידית (M/L): -1.0 מ"מ, גב/גחון (D/V): -2.0 מ"מ20.
    הערה: ניתן לשנות את הקואורדינטות בהתבסס על אזור העניין. הקואורדינטות של החדר הצדדי התבססו על עכברי C57BL/6J בוגרים עם טווח משקל של 26-30 גרם. אם משתמשים בעכברים צעירים יותר, עיין בדיון.
  2. קדחו חור (קוטר = 1.5 מ"מ) דרך הגולגולת באתר המסומן באמצעות מקדחה סטריאוטקסית להשתלת צינורית מדריך מסחרית.
  3. קודחים עוד שניים עד ארבעה חורים (קוטר = 1.5 מ"מ) על הגולגולת באמצעות מקדחה סטריאוטקסית להרכבת ברגים מנירוסטה.
    הערה: יש לעקר את המקדחה הסטריאוטקסית באמצעות מחטא חרוזי זכוכית (150 מעלות צלזיוס) למשך 5 שניות לפחות לפני ואחרי כל חיה.
  4. נגבו את שאריות העצם והפסיקו את הדימום בעזרת צמר גפן.
  5. נגבו את הגולגולת עם לידוקאין (1 מ"ג/ק"ג) באמצעות צמר גפן להרדמה מקומית, תרופות נוגדות דיכאון ושיכוך כאבים. אם הדימום אינו מפסיק לאחר הקידוח, בעדינות להניח צמר גפן על החור עבור hemostasis.
  6. הרכיבו שניים עד ארבעה ברגים מנירוסטה על החורים כדי לספק עוגנים לאקריליק דנטלי.
  7. הניחו את צינורית המדריך המסחרי על מחזיק הצינורית הסטריאוטקסית וחטאו עם מחטא חרוזי הזכוכית (150 מעלות צלזיוס).
    הערה: המדריך המסחרי צינורית, דמה מסחרית ומזרק מסחרי (איור 2A) הותאמו אישית עם המפרטים המוצגים בטבלת החומרים.
  8. הזיזו את מחזיק הצינורית הסטריאוטקסית לחור שנקדח עבור החדר הצדדי והכניסו באיטיות את צינורית ההנחיה המסחרית לתוך החור עד לעומק הרצוי (2.5 מ"מ).
    הערה: ניתן להגדיר את הקואורדינטות הגביות/גחוניות על ידי הגדרת קצה צינורית המדריך המסחרי כהפניה כאשר הקצה בקושי מוכנס לתוך החור.
  9. יש למרוח 10 μL של דבק n-butyl cyanoacrylate (דבק דבק רקמות) כדי לתקן את צינורית ההנחיה המסחרית בחור הקדוח ולהמתין 3-4 דקות. שחררו בעדינות את צינורית המדריך המסחרי ממחזיק הצינורית הסטריאוטקסית והרחיקו את המחזיק.
  10. יש למרוח את האקריליק הדנטלי על הקרקפת המשופעת כדי לתקן את צינורית המדריך המסחרי ולהמתין לפחות 5 דקות. שתל את הבובה המסחרית בצינורית המדריך המסחרי כדי למנוע סתימת צינורית על-ידי דם או נוזל גוף (איור 2B).
  11. שחררו את מוט האוזן מתעלת האוזן והסירו את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית.
  12. הכניסו את העכבר לכלוב חדש עם כרית חימום מתחתיו להתאוששות מהרדמה והתבוננו ברציפות עד שהעכבר מתעורר במלואו.
    הערה: אין להשאיר את בעל החיים ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה סטרנלית. בעל חיים שעבר ניתוח לא צריך לחזור לחברה של בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה.
  13. החזר את העכבר לדיור יחיד או לדיור קבוצתי, בהתאם לפרוטוקול IACUC המוסדי ולתכנון הניסוי. עבור דיור קבוצתי, ודא כי פחות עכברים שוכנים בכלוב כדי למזער פציעות לא רצויות או ניתוק של צינורית.
  14. לתת איבופרופן (0.2 מ"ג / מ"ל) במי השתייה במשך 3 ימים לפחות לטיפול לאחר הניתוח, ולנטר פעמיים ביום עבור סימנים של כאב ומצוקה במשך 3 ימים לפחות.
    1. במהלך הטיפול שלאחר הניתוח, להחיל משחה roxithromycin סביב העור כדי למנוע דלקת וזיהום בעכברים.
    2. המשיכו לעקוב אחר מצב החיה ותנו הזרקה תוך-צפקית בזמן של 5% גלוקוז ו/או 0.9% נתרן כלורי כדי לספק מספיק אנרגיה.
    3. אם מצב הכאב, המצוקה או הזיהום מתדרדר בהתמדה, הרדימו את העכבר על ידי שאיפת CO2 .
  15. המתן שבוע לאחר הניתוח כדי שהעכבר יהיה מוכן לאספקה תוך-חדרית של SCFAs ובדיקות התנהגותיות.

4. הכנת SCFAs

  1. ממיסים את הנתרן אצטט, נתרן בוטיראט ונתרן פרופיונאט בנוזל המוח והשדרה המלאכותי (ACSF) (ראו טבלת חומרים).
  2. ודא שהכימיקלים מומסים במלואם, ולאחר מכן כוונן את ה- pH ל- 7.4, וסנן את תערובת ה- SCFAs דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר לעיקור.

5. הגדר את מערכת העירוי להעברה תוך-חדרית של SCFAs במהלך בדיקות התנהגותיות

  1. הרכיבו מצלמת תקרה כדי לתעד את ההתנהגות. חבר את המצלמה למחשב כדי לשלוט בתוכנת הקלטת הווידאו (איור 3).
  2. מלאו מזרק 10 μL במים מזוקקים.
    הערה: יש להימנע מבועות אוויר במזרק המיקרוליטר.
  3. חבר משאבת מיקרו-הזרקה לבקר המיקרו-הזרקה.
  4. הרכב את מזרק המיקרוליטר על משאבת המיקרו-הזרקה. כדי להתקין את המזרק, לחץ על הלחצן כדי לשחרר את המהדק ולהתקין את המזרק על המיקום המתאים. סגרו את המהדק והדקו את הבורג התומך בבוכנה במשאבת המיקרו-הזרקה (איור 4A).
  5. הכנס את המזרק המסחרי לצינור הפוליאתילן (איור 2A).
  6. תלו את צינור הפוליאתילן על מצלמת התקרה מעל זירת הבדיקה.
  7. מלא את צינור הפוליאתילן במים מזוקקים באמצעות מזרק אינסולין. חבר את מזרק המיקרוליטר לצינור הפוליאתילן התלוי.
    הערה: ודא שצינור הפוליאתילן ארוך מספיק כדי לאפשר לעכבר לנוע בחופשיות לאורך כל זירת הבדיקה.

6. הגדרות המערכת של בקר המיקרו-הזרקה

  1. הפעל את בקר המיקרו-הזרקה ולחץ על הצג את כל הערוצים כדי לגשת למסך הפקודה (איור 4C). לחץ על תצורה והגדר את יעד עוצמת הקול ל- 9,800 nL עם קצב אספקה ל- 100 nL/s. החדירו 9,800 nL של מים מזוקקים מצינור הפוליאתילן המחובר למזרק המיקרוליטר (לחצו על 'כיוון' כדי לעבור למצב 'החדרה' ולחצו על RUN) (ראו ריבועים אדומים במסך הפקודה של איור 4C).
  2. לחץ על תצורה והגדר את יעד עוצמת הקול ל- 3,000 nL עם קצב אספקה ל- 100 nL/s. משכו 3,000 nL של שמן מינרלי (לחצו על ' כיוון ' כדי לעבור למצב ' משיכה' ולחצו על RUN) (ראו ריבועים אדומים במסך הפקודה של איור 4C).
    הערה: יש לראות הפרדת שלב שמן-מים צלולה על צינור הפוליאתילן.
  3. לפרק את צינור פוליאתילן מן מחט מזרק microliter. יש לירוק החוצה 3,000 nL של מים מזוקקים ממחט מזרק המיקרוליטר (לחץ על כיוון כדי לעבור למצב ההחדרה ולחץ על RUN).
  4. הכנס את מזרק microliter בחזרה לתוך צינור פוליאתילן. לחץ על תצורה והגדר את יעד עוצמת הקול ל- 9,500 nL עם קצב אספקה ל- 100 nL/s. משוך 9,500 nL של SCFAs (לחץ על כיוון כדי לעבור למצב משיכה והקש RUN). סמן את שלב ה-OIL-SCFAs כדי לוודא אם ה-SCFAs מוחדרים בהצלחה.
  5. לחץ על תצורה והגדר את יעד עוצמת הקול הרצוי עם קצב אספקה ל- 7 nL/s. לחצו על ' כיוון ' כדי לעבור למצב 'החדרה' (ראו ריבועים אדומים במסך הפקודה של איור 4C).
    הערה: קבע את עוצמת הקול בהתבסס על זמן העירוי. לדוגמה, אם זמן העירוי הוא 3 דקות עבור קצב המסירה של 7 nL/s, נפח היעד = 1,260 nL.
  6. לחץ על RUN כדי להחדיר את מזרק המיקרוליטר קדימה עד שהנוזל יוצא בקצה הקדמי של המזרק המסחרי לפני החדרת המזרק לצינורית להזרקת SCFAs.

7. עירוי של SCFAs לחדר לרוחב דרך צינורית המדריך המסחרי בעכבר הנע בחופשיות

  1. הרדמת העכבר על ידי הצבתו בכלוב הפרספקס עם 1%-5% איזופלורן בחמצן.
    הערה: התבונן מקרוב בעכבר כדי להבטיח שקצב הנשימה נשמר בסביבות נשימה אחת בשנייה.
  2. שפשפו את העכבר והכניסו את המזרק המסחרי לתוך צינורית המדריך המסחרי (איור 4B).
    הערה: אם צינורית המדריך המסחרי מחוברת על ידי דם או נוזל גוף, פתח אותה בעדינות עם פינצטה.
  3. אפשרו לעכבר להתאושש מהרדמה במשך 15 דקות בכלוב לפני בדיקה התנהגותית.
  4. למבחן התנועה הבסיסי, הניחו את העכבר בכלוב חדש ואפשרו לו לחקור בחופשיות במשך 35 דקות. החדירו SCFAs באמצעות קצב אספקה של 7 nL/s עבור נפח יעד של 2,100 nL ב-5 הדקות הראשונות (לחץ על כיוון למצב ההחדרה והקש RUN).
    הערה: ניתן לנתח את התנועה בכלוב החדש באמצעות תוכנת מעקב וידאו אחר התנהגות בעלי חיים21,22.
  5. הרדימו את העכבר (חזרה על שלב 7.1) והסירו את המזרק המסחרי מהצינורית המסחרית.
    הערה: ניתן להזריק לעכבר שוב ושוב פקדים/מטבוליטים שונים לאחר מתן משך הזמן המתאים לשטיפת הזריקה הקודמת. כל עוד הצינורית קבועה על ראש העכבר, ניתן לבדוק את העכבר שוב ושוב עם מטבוליטים שונים.

8. שחזור מערכת המיקרו הזרקות

  1. לפרק את צינור פוליאתילן מן מזרק microliter.
  2. הזריקו אוויר לצינור באמצעות מזרק האינסולין כדי להשליך את המים המזוקקים בצינור הפוליאתילן. לרוקן את מזרק המיקרוליטר.
  3. לחצו על ' אפס קופה ' במסך ' תצורה ' כדי לפתוח את המסך 'הגדרת עצירת מזרק ' (איור 4C).
  4. לחצו על 'משיכה ' עד שנשמע צליל צפצוף כדי לאפס את משאבת המיקרו-הזרקה למצב שבו היא נסוגה במלואה (איור 4C).
  5. חזור למסך הפקודה וכבה את בקר המיקרו-הזרקה אם יש סימן ** END REACHED** במסך זה (איור 4C).

9. אופציונלי: אימות של הזרקה תוך-מוחית על-ידי עוקב עצבי

  1. החדירו 2,100 nL של העקיבה העצבית עם קצב אספקה של 7 nL/s כדי לאמת את אתר העירוי.
    הערה: השאירו את המזרק בצינורית המדריך למשך 5 דקות כדי למנוע זרימה חוזרת.
  2. הרדמת העכבר על ידי מנת יתר של איזופלורן (5%) 30 דקות לאחר עירוי של מעקב עצבי.
  3. בדוק את קצב הנשימה ואת רפלקס צביטה של זנב/כפה בעכבר המורדם.
    הערה: עכברים חייבים להפסיק להגיב לפני השלב הבא.
  4. בצע חתך של 4-5 ס"מ דרך העור, השריר ודופן הבטן מתחת לכלוב הצלעות.
  5. יש להרחיק מעט את הכבד מהסרעפת בזהירות.
  6. חותכים את הסרעפת כדי לחשוף את לב העכבר.
  7. יש לחדור לעכבר דרך הלב עם תמיסת מלח אפופת פוספטים (PBS) ופרפורמלדהיד קר כקרח ב-PBS.
  8. ערפו את העכבר ונתחו את המוח בזהירות בעזרת מלקחיים מיקרו-דיסקים ומספריים זעירים כדי להוציא את כל המוח23. מניחים את דגימות המוח בפרפורמלדהיד קר כקרח 4% ב- PBS למשך 3-4 ימים ושוטפים אותן 3 x 5 דקות עם PBS.
  9. חתכו את המוח לשני חלקים במחזיק פרוסת המוח של העכבר בחיתוך השמיני של מחזיק פרוסת המוח של העכבר (1 מ"מ/חתך) מהכיוון הקדמי לכיוון האחורי. מניחים את המוח בתבנית ההטבעה ומטמיעים את דגימות המוח באגרוז של נקודת התכה נמוכה (4% ב-PBS).
  10. הדביקו את המוח המוטבע באגרוז על במת הוויברטום באמצעות superglue. חלקו את המוח לפרוסות מוח של 50 מיקרומטר באמצעות הוויברטום.
  11. דגירה של פרוסות המוח בנוגדן המכוון לעוקבת העצבית המדוללת בחסימת חיץ (דילול 1:1,000) במשך הלילה בטמפרטורת החדר.
    הערה: המאגר החוסם הכיל 10% סרום סוסים, 0.1% טריטון X-100 ו-0.02% נתרן אזיד.
  12. שוטפים את הפרוסות 3 x 5 דקות עם PBST (PBS עם 0.1% טריטון X-100).
  13. דגירה של פרוסות המוח בנוגדן משני מצומד בצבע פלואורסצנטי מדולל בחיץ חוסם (דילול 1:500) במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
  14. שוטפים את הפרוסות 3 x 5 דקות עם PBS.
  15. הרכיבו את פרוסות המוח על המגלשה עם מדיום הרכבה המכיל 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI).
  16. כסו את השקופית בכיסוי מיקרוסקופ.
  17. יש למרוח לק על קצה ההחלקה כדי למנוע דליפה של מדיום ההרכבה.
  18. לאחר דגירה של לילה בטמפרטורת החדר, מוגנת מפני אור, דמיינו את האות הפלואורסצנטי באתר העירוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

10. אופציונלי: עירוי של מטבוליטים באמצעות צינורית הנחיה מותאמת אישית מנירוסטה בחדר הצדדי בעכברים

  1. עקוב אחר סעיפי הפרוטוקול 1-8 והחלף את צינורית המדריך המסחרית בצינורית מדריך מנירוסטה כדי להחדיר כימיקלים דרך מזרק נירוסטה בעכבר.
    הערה: היתרונות והחסרונות של הצינוריות המסחריות והנירוסטה השונות מפורטות בסעיף הדיון.
  2. בצעו את הפרוטוקול הניתוחי באותו אופן כפי שמתואר בסעיפים 2 ו-3 של הפרוטוקול, מלבד זכרו להחליף את צינורית ההנחיה המסחרית בצינורית הנחיה מפלדת אל-חלד (איור 5B).
    הערה: צינורית מדריך נירוסטה, בובת נירוסטה ומזרק נירוסטה (איור 5A) הותאמו אישית עם המפרטים המוצגים בטבלת החומרים. הכנס את צינורית מדריך הנירוסטה המותאמת אישית לתוך החור עד לעומק הרצוי (2.0 מ"מ).
  3. החדירו SCFAs דרך צינורית ההנחיה מפלדת אל-חלד באמצעות מערכת המיקרו-הזרקות המורכבת מבקר המיקרו-הזרקה ומשאבת המיקרו-הזרקה (איור 4B) (זהה לסעיפים 4-7 בפרוטוקול). עבור בובת הנירוסטה של צינורית מדריך הנירוסטה, כופפו צד אחד של מזרק הנירוסטה בעדינות עד שקצה הצד השני ארוך ב-1 מ"מ מהצינורית המנחה מנירוסטה.
  4. החדירו 2,100 nL של העקיבה העצבית דרך צינורית הנחיית הנירוסטה לחדר הצדדי בעכברים (זהה לפרוטוקול סעיף 9).
  5. אסוף את הדגימה במשך 30 דקות לאחר עירוי מעקב עצבי (זהה לפרוטוקול סעיף 9).
  6. בצע רכישת תמונה בפרוסות המוח החדורות של המעקב העצבי (זהה לפרוטוקול סעיף 9).

תוצאות

העכבר הוחדר ל-SCFAs שבוע לאחר ההחלמה מהשתלת צינורית המדריך כדי להעריך את פעילות התנועה בכלוב חדש. העכבר הוכנס לכלוב חדשני והוחדר עם 2,100 nL של SCFAs או ACSF ב-5 הדקות הראשונות (קצב אספקה של 7 nL/s) לתוך המוח דרך צינורית המדריך המסחרית שהושתלה בחדר הצדדי של המוח. פעילות התנועה בכלוב חדש נרשמה במשך 30 דקות נ...

Discussion

מטבוליטים שמקורם במעיים נקשרו למחלות המתווכות על ידי המוח ללא מנגנון מדויק רב, בין היתר בשל אתרי הקשירה המרובים שלהם בגוף 6,12,24. דיווחים קודמים הצביעו על כך ש-SCFAs יכולים לשמש כליגנדים לקולטנים מצומדים לחלבון G, לווסתים אפיגנטיים ולמקורות ל?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים הקשורים לעבודה זו.

Acknowledgements

אנו מודים לצוות מרכז חיות המעבדה באוניברסיטת נשיונל צ'נג קונג (NCKU) על הטיפול בבעלי החיים. עבודה זו נתמכה על ידי מלגה מקרן החינוך של פרופ' קון-ין הואנג מקרן צ'נג-סינג לרפואה ל- C.-W.L.; הכספים ממשרד המדע והטכנולוגיה (MOST) בטייוואן: (מחקר לתואר ראשון MOST 109-2813-C-006-095-B) ל- T.-H.Y.; (רוב 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) ל W.-L.W.; ופרויקט נבטי ההשכלה הגבוהה, משרד החינוך למטה קידום האוניברסיטה ב- NCKU ל- W.-L.W.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41Pfizern/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbitThermoFisher ScientificA-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal)MilliporeAB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, SterileNEST121921LA01
CaCl2 Sigma-AldrichC1016ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2%PhoenixNDC 57319-611-09
Chlorhexidine solutionPhoenixNDC 57319-599-09
Commercial dummyRWD Life Science62004Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannulRWD Life Science62104Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injectorRWD Life Science62204Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylicHYGENICn/a
Fixing screwsRWD Life Science62521
Fluoroshield mounting medium with DAPIAbcamAB104139
Horse serumThermoFisher Scientific16050130
Insulin syringesBBraunXG-LBB-9151133S-1BX1 mL
Isoflurane Panion & BF biotechDG-4900-250D
KCl Sigma-AldrichP3911ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen Swiss Pharmaceuticaln/a
Lidocaine AstraZenecan/a
Low melting point agaroseInvitrogen16520
MgCl2 Sigma-AldrichM8266ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slipsMARIENFELD101242
Microscope slidesThermoFisher Scientific4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NFMacron Fine ChemicalsMA-6358-04
NaCl Sigma-AldrichS9888ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4 Sigma-AldrichS8282ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3 Sigma-AldrichS5761ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue)3M1469SB3M Vetbond
Neural tracer Santa CruzSC-358883FluoroGold
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Polyethylene tubeRWD Life Science62329OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) OintmentDechra 12920060
Sodium acetate Sigma-AldrichS2889SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide Sigma-AldrichS2002
Sodium butyrate Sigma-AldrichB5887SCFAs: 8 mM
Sodium propionate Sigma-AldrichP1880SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannulaChun Ta stainless steel enterprise CO., LTD.n/aOD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injectorChun Ta stainless steel enterprise CO., LTD.n/aOD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
SuperglueKrazy GlueKG94548R
Triton X-100Merck1.08603.1000
Equipment
Cannula holderRWD Life ScienceB485-68217
Ceiling cameraFOSCAMR2
Digital stereotaxic instrumentsStoelting51730D
Dissecting microscopeINNOVIEWSEM-HT/TW
Glass Bead SterilizerRWD Life ScienceRS1501
Heating padStoelting53800M
Leica microscope LeicaDM2500
Micro Dissecting ForcepsROBOZRS-5136Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting ScissorsROBOZRS-59184.5" Angled Sharp
Microinjection controllerWorld Precision Instruments (WPI)MICRO2TSMARTouch Controller
Microinjection syringe pumpWorld Precision Instruments (WPI)UMP3T-1UltraMicroPump3  
Microliter syringeHamilton8001410 µL
Optical Fiber Cold Light with double FiberStepLGY-150Local vendor
Pet trimmerWAHL09962-2018
Vaporiser for IsofluraneStepAS-01Local vendor
VibratomeLeicaVT1000S
Software
Animal behavior video tracking softwareNoldusEthoVisionVersion: 15.0.1416
Leica Application Suite X softwareLeicaLASXVersion: 3.7.2.22383

References

  1. Lynch, J. B., Hsiao, E. Y. Microbiomes as sources of emergent host phenotypes. Science. 365 (6460), 1405-1409 (2019).
  2. Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome-gut-brain axis in health and disease. Gastroenterology Clinics of North America. 46 (1), 77-89 (2017).
  3. Sharon, G., Sampson, T. R., Geschwind, D. H., Mazmanian, S. K. The central nervous system and the gut microbiome. Cell. 167 (4), 915-932 (2016).
  4. Krautkramer, K. A., Fan, J., Backhed, F. Gut microbial metabolites as multi-kingdom intermediates. Nature Reviews: Microbiology. 19 (2), 77-94 (2021).
  5. Lavelle, A., Sokol, H. Gut microbiota-derived metabolites as key actors in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 223-237 (2020).
  6. Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. The role of short-chain fatty acids in microbiota-gut-brain communication. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 16 (8), 461-478 (2019).
  7. Morais, L. H., Schreiber, H. L. T., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews: Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  8. Sharon, G., et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).
  9. St Laurent, R., O'Brien, L. M., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
  10. Govindarajan, N., Agis-Balboa, R. C., Walter, J., Sananbenesi, F., Fischer, A. Sodium butyrate improves memory function in an Alzheimer's disease mouse model when administered at an advanced stage of disease progression. Journal of Alzheimer's Disease. 26 (1), 187-197 (2011).
  11. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  12. Silva, Y. P., Bernardi, A., Frozza, R. L. The role of short-chain fatty acids from gut microbiota in gut-brain communication. Frontiers in Endocrinology. 11, 25 (2020).
  13. Kratsman, N., Getselter, D., Elliott, E. Sodium butyrate attenuates social behavior deficits and modifies the transcription of inhibitory/excitatory genes in the frontal cortex of an autism model. Neuropharmacology. 102, 136-145 (2016).
  14. Kelly, J. R., et al. Transferring the blues: Depression-associated gut microbiota induces neurobehavioural changes in the rat. Journal of Psychiatric Research. 82, 109-118 (2016).
  15. Wang, L., et al. Elevated fecal short chain fatty acid and ammonia concentrations in children with autism spectrum disorder. Digestive Diseases and Sciences. 57 (8), 2096-2102 (2012).
  16. Adams, J. B., Johansen, L. J., Powell, L. D., Quig, D., Rubin, R. A. Gastrointestinal flora and gastrointestinal status in children with autism--comparisons to typical children and correlation with autism severity. BMC Gastroenterology. 11, 22 (2011).
  17. Skonieczna-Zydecka, K., et al. Faecal short chain fatty acids profile is changed in Polish depressive women. Nutrients. 10 (12), 1939 (2018).
  18. Szczesniak, O., Hestad, K. A., Hanssen, J. F., Rudi, K. Isovaleric acid in stool correlates with human depression. Nutritional Neuroscience. 19 (7), 279-283 (2016).
  19. Martin, A. M., Sun, E. W., Rogers, G. B., Keating, D. J. The influence of the gut microbiome on host metabolism through the regulation of gut hormone release. Frontiers in Physiology. 10, 428 (2019).
  20. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . Paxinos and Franklin's The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).
  21. York, J. M., Blevins, N. A., McNeil, L. K., Freund, G. G. Mouse short- and long-term locomotor activity analyzed by video tracking software. Journal of Visualized Experiments. (76), e50252 (2013).
  22. Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice. Journal of Visualized Experiments. (164), e61023 (2020).
  23. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments. (168), e61941 (2021).
  24. Needham, B. D., Kaddurah-Daouk, R., Mazmanian, S. K. Gut microbial molecules in behavioural and neurodegenerative conditions. Nature Reviews: Neuroscience. 21 (12), 717-731 (2020).
  25. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
  26. Xiaoguang, W., et al. Establishment of a valuable mimic of Alzheimer's disease in rat animal model by intracerebroventricular injection of composited amyloid beta protein. Journal of Visualized Experiments. (137), e56157 (2018).
  27. Venniro, M., Shaham, Y. An operant social self-administration and choice model in rats. Nature Protocols. 15 (4), 1542-1559 (2020).
  28. Ucal, M., et al. Rat model of widespread cerebral cortical demyelination induced by an intracerebral injection of pro-inflammatory cytokines. Journal of Visualized Experiments. (175), e57879 (2021).
  29. Oberrauch, S., et al. Intraventricular drug delivery and sampling for pharmacokinetics and pharmacodynamics study. Journal of Visualized Experiments. (181), e63540 (2022).
  30. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injections of the enteric bacterial metabolic product propionic acid impair cognition and sensorimotor ability in the Long-Evans rat: further development of a rodent model of autism. Behavioural Brain Research. 200 (1), 33-41 (2009).
  31. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injection of propionic acid, an enteric metabolite implicated in autism, induces social abnormalities that do not differ between seizure-prone (FAST) and seizure-resistant (SLOW) rats. Behavioural Brain Research. 278, 542-548 (2015).
  32. Perry, R. J., et al. Acetate mediates a microbiome-brain-beta-cell axis to promote metabolic syndrome. Nature. 534 (7606), 213-217 (2016).
  33. Muller, P. A., et al. Microbiota modulate sympathetic neurons via a gut-brain circuit. Nature. 583 (7816), 441-446 (2020).
  34. Pardridge, W. M. CSF, blood-brain barrier, and brain drug delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 13 (7), 963-975 (2016).
  35. Wu, J. -. T., et al. Oral short-chain fatty acids administration regulates innate anxiety in adult microbiome-depleted mice. Neuropharmacology. , (2022).
  36. Lee, J., et al. Gut microbiota-derived short-chain fatty acids promote poststroke recovery in aged mice. Circulation Research. 127 (4), 453-465 (2020).
  37. Chiu, C., et al. Temporal course of cerebrospinal fluid dynamics and amyloid accumulation in the aging rat brain from three to thirty months. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 3 (2012).
  38. Schuler, B., Rettich, A., Vogel, J., Gassmann, M., Arras, M. Optimized surgical techniques and postoperative care improve survival rates and permit accurate telemetric recording in exercising mice. BMC Veterinary Research. 5, 28 (2009).
  39. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  40. Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
  41. de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
  42. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
  43. Wolter, J. M., et al. Cas9 gene therapy for Angelman syndrome traps Ube3a-ATS long non-coding RNA. Nature. 587 (7833), 281-284 (2020).
  44. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses for combinatorial cell-subclass-specific labeling. Neuron. 109 (9), 1449-1464 (2021).
  45. Xie, M., et al. TREM2 interacts with TDP-43 and mediates microglial neuroprotection against TDP-43-related neurodegeneration. Nature Neuroscience. 25 (1), 26-38 (2022).
  46. Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
  47. Bermudez-Martin, P., et al. The microbial metabolite p-Cresol induces autistic-like behaviors in mice by remodeling the gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 157 (2021).
  48. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  49. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).
  50. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  51. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  52. Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  53. Kaelberer, M. M., et al. A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction. Science. 361 (6408), (2018).
  54. Needham, B. D., Tang, W., Wu, W. L. Searching for the gut microbial contributing factors to social behavior in rodent models of autism spectrum disorder. Developmental Neurobiology. 78 (5), 474-499 (2018).
  55. Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
  56. Chu, C., et al. The microbiota regulate neuronal function and fear extinction learning. Nature. 574 (7779), 543-548 (2019).
  57. Wu, W. L., et al. Microbiota regulate social behaviour via stress response neurons in the brain. Nature. 595 (7867), 409-414 (2021).
  58. Buchanan, K. L., et al. The preference for sugar over sweetener depends on a gut sensor cell. Nature Neuroscience. 25 (2), 191-200 (2022).
  59. Han, W., et al. A neural circuit for gut-induced reward. Cell. 175 (3), 665-678 (2018).
  60. Yamawaki, Y., et al. Antidepressant-like effect of sodium butyrate (HDAC inhibitor) and its molecular mechanism of action in the rat hippocampus. World Journal of Biological Psychiatry. 13 (6), 458-467 (2012).
  61. Ho, L., et al. Protective roles of intestinal microbiota derived short chain fatty acids in Alzheimer's disease-type beta-amyloid neuropathological mechanisms. Expert Review of Neurotherapeutics. 18 (1), 83-90 (2018).
  62. Liu, J., et al. Anti-neuroinflammatory effect of short-chain fatty acid acetate against Alzheimer's disease via upregulating GPR41 and inhibiting ERK/JNK/NF-kappaB. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (27), 7152-7161 (2020).
  63. van de Wouw, M., et al. Short-chain fatty acids: microbial metabolites that alleviate stress-induced brain-gut axis alterations. Jounal of Physiology. 596 (20), 4923-4944 (2018).
  64. Olson, C. A., et al. The gut microbiota mediates the anti-seizure effects of the ketogenic diet. Cell. 173 (7), 1728-1741 (2018).
  65. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved