自由移动小鼠中肠道来源的微生物代谢物的脑室内递送

摘要

肠道来源的微生物代谢物具有多方面的作用，导致动物的复杂行为。我们的目标是提供一种循序渐进的方法，通过引导套管通过脑室内输送来描述肠道来源的微生物代谢物在大脑中的作用。

摘要

肠道微生物群及其代谢物对宿主生理和行为的影响在这十年中得到了广泛的研究。大量研究表明，肠道微生物群衍生的代谢物通过宿主中复杂的肠脑通路调节大脑介导的生理功能。短链脂肪酸（SCFA）是肠道微生物组在膳食纤维发酵过程中产生的主要细菌衍生代谢物。来自肠道的分泌的SCFA可以在外周的多个部位起作用，由于SCFAs受体的广泛分布，影响免疫，内分泌和神经反应。因此，通过口服和腹膜内给药来区分SCFAs的中枢效应和外周效应具有挑战性。本文提出了一种基于视频的方法，通过引导套管在自由移动的小鼠中询问SCFAs 在 大脑中的功能作用。大脑中SCFA的数量和类型可以通过控制输注量和速率来调节。这种方法可以为科学家提供一种方法来了解肠道衍生代谢物在大脑中的作用。

引言

人体胃肠道含有^{影响宿主的各种}微生物1，^2，3。这些肠道细菌在利用宿主消耗的膳食成分时可以分泌肠道衍生的代谢物^4，5。有趣的是，未在外周代谢的肠道代谢物可以通过循环转运到其他器官⁶。值得注意的是，这些分泌的代谢物可以作为肠脑轴的介质，定义为中枢神经系统和肠道之间的双向^通信7。先前的研究表明，肠道衍生的代谢物可以调节动物的复杂行为和情绪⁸，⁹，^10，11。

短链脂肪酸（SCFAs）是肠道微生物群在膳食纤维和难消化碳水化合物发酵过程中产生的主要代谢物⁶。乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐是肠道中含量最高的 SCFAs12。SCFA是胃肠道细胞的能量来源。肠道中未代谢的SCFA可以通过门静脉运输到大脑，从而调节大脑和行为^6，12。先前的研究表明，SCFA可能在神经精神疾病中起关键作用^6，12。例如，在自闭症谱系障碍（ASD）的动物模型BTBR T⁺ Itpr3^{tf /} J（BTBR）小鼠中腹腔注射丁酸盐挽救了他们的社会缺陷¹³。接受来自抑郁受试者微生物群的抗生素处理的大鼠显示出焦虑样行为和粪便SCFAs的增加¹⁴。临床上，与通常的对照组相比，在ASD患者中观察到粪便SCFAs水平的变化^15，16。抑郁症患者的粪便SCFAs水平低于健康受试者^17，18。这些研究表明，SCFAs可以通过各种途径改变动物和人类的行为。

微生物代谢物对体内多个部位产生多种影响，影响宿主生理和^{行为4，19，}包括胃肠道、迷走神经和交感神经。当通过外周途径施用代谢物时，很难确定肠道来源代谢物在大脑中的确切作用。本文提出了一种基于视频的方案，用于研究肠道衍生代谢物对自由移动的小鼠大脑的影响（图1）。我们发现，在行为测试期间，可以通过引导套管急性给予SCFA。代谢物的类型、体积和输注速率可以根据目的进行修改。可以调整插管部位，以探索肠道代谢物在特定大脑区域的影响。我们的目标是为科学家提供一种方法来探索肠道来源的微生物代谢物对大脑和行为的潜在影响。

研究方案

所有实验方案和动物护理均已获得国立成功大学（NCKU）机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1.实验动物的准备

1. 从供应商处获得6-8周龄的野生型C57BL / 6JNarl雄性小鼠。
2. 将小鼠饲养在标准小鼠笼中，用标准老鼠食物和 随意消毒的水。
   注意:NCKU实验动物中心的外壳条件为22±1°C温度，55%±10%湿度和13小时/ 11小时亮/暗循环。

2. 立体定位手术

1. 准备和消毒立体定位器械、手术器械和相关物品。
   注意:所有直接接触手术部位的物品都应消毒以避免感染。
2. 通过将小鼠置于Plexiglas笼中用1%-5%异氟醚在氧气中麻醉小鼠。
   注意:密切观察鼠标以确保呼吸频率保持在每秒一次呼吸左右。
3. 将鼠标取出麻醉室。用宠物修剪器剃除手术部位（小鼠头部）。通过将鼠标门牙固定在立体定位门牙支架中的门牙杆上，将鼠标放在立体定位框架上。用鼻锥面罩遮住鼻子。
4. 在整个立体定位手术中用1%-2.5%异氟醚在氧气中麻醉小鼠。通过脚趾捏反射 评估 小鼠的伤害感受，并确保在切开手术部位之前保持恒定的呼吸频率。
5. 在立体定位框架上的鼠标下方放置加热垫（37.0°C），以在手术过程中保持体温。或者，借助连接程序加热器和加热垫的直肠热探头保持核心温度。
6. 用胶带去除头上修剪过的皮毛。皮下注射镇痛药酮洛芬（5mg / kg）以缓解疼痛。涂抹眼膏以避免眼睛干涩。
7. 将尖头插入耳道以固定头部。
8. 通过调整耳杆的比例使头部居中。
9. 拧紧门牙支架上的鼻夹，避免垂直移动。轻轻按压头部以检查头部是否固定，并避免头部在随后的手术中变得松动。
10. 使用棉签对头皮进行三次氯己定交替擦洗。从中间到外侧（从消毒最严格的中心区域到消毒最少的区域）开始每次擦洗。
    注意:从中间到外部使用磨砂膏可以帮助科学家最大限度地减少毛皮的感染和污染。外部区域靠近未剃光头的区域，那里仍然有大量的皮毛，不容易彻底消毒。
11. 使用手术刀片以前/后方式（<1 cm）切开头皮。打开切口，用显微解剖钳握住的棉签擦拭头骨。
    注意:显微解剖钳、手术刀片和棉签必须在手术前通过高压灭菌进行灭菌。在手术过程中，在每只动物前后使用玻璃珠灭菌器（150°C）对所有手术设备进行至少5秒的消毒。准备一个消毒的烧杯，以便在手术过程中和动物之间固定手术刀片和镊子。
12. 识别头骨上的布雷格玛和 Lambda。使用 Bregma 作为参考来定位感兴趣区域。
    1. 可选:将立体定位钻头安装在立体定位钻架上，并使用钻头的尖端将 Bregma 作为参考。使用玻璃珠灭菌器（150°C）对立体定位钻头进行灭菌至少5秒。
13. 通过Bregma/Lambda在左/右和前/后平面上校准和对齐扁平头骨水平面。
    注意:如果不在正确的水平面上，请将鼠标重新安装在立体定位仪器上。

3.商业定制导引套管植入

1. 根据立体定位坐标识别并标记右外侧心室的位置:到前/后（A / P）的距:0.26 mm，内侧/外侧（M / L）:-1.0 mm，背侧/腹侧（D / V）:-2.0 mm²⁰。
   注意:可以根据感兴趣的区域修改坐标。侧脑室的坐标基于体重范围为26-30g的成年C57BL / 6J小鼠。如果使用较年轻的小鼠，请参阅讨论。
2. 使用立体定位钻头在标记部位的颅骨上钻一个孔（直径 = 1.5 mm），以植入商业引导套管。
3. 使用立体定位钻头在颅骨上再钻两到四个孔（直径 = 1.5 毫米），以安装不锈钢螺钉。
   注意:在每只动物之前和之后，使用玻璃珠灭菌器（150°C）对立体定位钻头进行至少5秒的消毒。
4. 擦拭骨屑并用棉签止血。
5. 用棉签用利多卡因（1 mg / kg）擦拭头骨，以获得局部麻醉，止痒和止痛效果。如果钻孔后出血没有停止，请轻轻地将棉签放在孔上止血。
6. 在孔上安装两到四个不锈钢螺钉，为牙科丙烯酸提供锚。
7. 将商业引导套管放在立体定位套管支架上，并用玻璃珠灭菌器（150°C）消毒。
   注意:商用导向套管、商用假人和商用喷油器（图 2A）是按照 材料表中显示的规格定制的。
8. 将立体定向套管支架移动到为侧心室钻孔的孔中，然后将商业导向套管缓慢插入孔中，直到所需的深度（2.5 mm）。
   注意:当尖端几乎没有插入孔中时，可以通过将商业导引套管的尖端设置为参考来定义背/腹坐标。
9. 应用 10 μL 氰基丙烯酸正丁酯粘合剂（组织粘合剂胶）将商业导向套管固定在钻孔中并等待 3-4 分钟。从立体定位套管支架上轻轻松开商业导向套管，然后将支架移开。
10. 将牙科丙烯酸涂抹在切开的头皮上以固定商业导引套管并等待至少 5 分钟。将商业假人植入商业导引套管中，以避免套管被血液或体液堵塞（图2B）。
11. 从耳道上松开耳杆，然后将鼠标从立体定位框架中取出。
12. 将鼠标放入一个新的笼子中，下面有一个加热垫，以便从麻醉中恢复过来，并持续观察直到鼠标完全醒来。
    注意:在动物恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前，不要让动物无人看管。接受手术的动物在完全康复之前不应回到其他动物的陪伴下。
13. 将鼠标返回到单个住房或组住房，具体取决于机构IACUC协议和实验设计。对于集体住房，确保将较少的小鼠饲养在笼子中，以尽量减少不必要的伤害或套管的脱离。
14. 在饮用水中给予布洛芬 （0.2 mg/mL） 至少 3 天进行术后护理，每天监测两次疼痛和痛苦迹象至少 3 天。
    1. 在术后护理期间，在皮肤周围涂抹罗红霉素软膏，以防止小鼠发炎和感染。
    2. 继续监测动物的状态，并及时腹腔注射5%葡萄糖和/或0.9%氯化钠以提供足够的能量。
    3. 如果疼痛，痛苦或感染状态稳步恶化，则通过吸入CO₂ 对小鼠实施安乐死。
15. 手术后等待1周，以使小鼠准备好进行SCFA的脑室内递送和行为测试。

4. SCFA的准备

1. 将乙酸钠，丁酸钠和丙酸钠溶解在人工脑脊液（ACSF）中（见 材料表）。
2. 确保化学物质完全溶解，然后将pH调节至7.4，并通过0.22μm过滤器过滤SCFAs混合物进行灭菌。

5.在行为测试期间建立脑室内递送SCFA的输液系统

1. 安装天花板摄像头以记录行为。将相机与计算机连接以控制视频录制软件（图3）。
2. 用蒸馏水填充 10 μL 注射器。
   注意:避免微升注射器中的气泡。
3. 将显微注射泵与显微注射控制器连接。
4. 将微升注射器安装在显微注射泵上。要安装注射器，请按下按钮松开夹子并将注射器安装到相应位置。关闭夹子并拧紧显微注射泵上的柱塞固定螺钉（图4A）。
5. 将商用注射器插入聚乙烯管（图2A）。
6. 将聚乙烯管挂在测试场上方的天花板摄像头上。
7. 使用胰岛素注射器用蒸馏水填充聚乙烯管。将微升注射器连接到悬挂的聚乙烯管。
   注意:确保聚乙烯管足够长，以允许鼠标在整个测试领域自由移动。

6. 显微注射控制器的系统设置

1. 打开显微注射控制器，然后按显示所有通道以访问命令屏幕（图4C）。按配置并将体积目标设置为 9，800 nL，输送速率为 100 nL/s。从连接到微升注射器的聚乙烯管中注入 9，800 nL 蒸馏水（按方向切换到注入模式并按 RUN）（参见图 4C 命令屏幕中的红色方块）。
2. 按配置并将体积目标设置为 3，000 nL，输送速率为 100 nL/s。提取 3，000 nL 矿物油（按"方向"切换到"提取"模式，然后按 RUN）（请参阅图 4C 命令屏幕中的红色方块）。
   注意:聚乙烯管上应观察到清晰的油水相分离。
3. 从微升注射器针头上拆卸聚乙烯管。从微升注射器针头中吐出 3，000 nL 蒸馏水（按 方向 切换到 注入 模式并按 RUN）。
4. 将微升注射器插回聚乙烯管中。按配置并将体积目标设置为 9，500 nL，输送速率为 100 nL/s。提取 9，500 nL 的 SCFA（按方向切换到提取模式并按 RUN）。标记油-SCFAs相以验证SCFAs是否成功注入。
5. 按配置并将所需的体积目标（输送速率）设置为 7 nL/s。按方向切换到注入模式（参见图 4C 命令屏幕中的红色方块）。
   注意:根据输注时间确定体积。例如，如果输注时间为3分钟，输送速率为7 nL / s，则目标体积= 1，260 nL。
6. 按 RUN 向前注入微升注射器，直到液体从商业注射器的前端流出，然后将注射器插入套管以进行 SCFA 注射。

7.在自由移动的小鼠中，通过商业引导套管将SCFA输注到侧脑室

1. 通过将小鼠置于Plexiglas笼中用1%-5%异氟醚在氧气中麻醉小鼠。
   注意:密切观察鼠标以确保呼吸频率保持在每秒一次呼吸左右。
2. 擦拭鼠标并将商用注射器插入商业导向套管（图4B）。
   注意:如果商业导引套管被血液或体液堵塞，请用镊子轻轻疏通。
3. 在行为测试之前，让小鼠在笼子中从麻醉中恢复15分钟。
4. 对于基本的运动测试，将鼠标放在一个新的笼子中，让它自由探索35分钟。在前 5 分钟内，目标体积为 2，100 nL 的递送速率为 7 nL/s 的注入 SCFA（按方向进入注入模式并按 RUN）。
   注意:可以使用动物行为视频跟踪软件^21，22分析新型笼子中的运动。
5. 麻醉小鼠（重复步骤7.1）并从商业引导套管中取出商业注射器。
   注意:在给予适当的时间长度以洗掉先前的注射后，可以重复注射不同的对照/代谢物。只要将套管固定在小鼠头上，就可以用不同的代谢物反复测试鼠标。

8. 显微注射系统的恢复

1. 从微升注射器上拆卸聚乙烯管。
2. 使用胰岛素注射器将空气注入管中，以丢弃聚乙烯管中的蒸馏水。清空微升注射器。
3. 按配置屏幕上的重置位置以打开注射器停止定义屏幕（图4C）。
4. 按 撤回 ，直到出现蜂鸣声，将显微注射泵重置为完全撤回的位置（图4C）。
5. 如果此屏幕上有**已结束**符号，请返回命令屏幕并关闭显微注射控制器（图4C）。

9. 可选:通过神经示踪剂验证脑室内注射

1. 以 7 nL/s 的递送速率注入 2，100 nL 的神经示踪剂以验证输注部位。
   注意:将注射器留在导向套管中5分钟以防止回流。
2. 输注神经示踪剂后30分钟通过过量的异氟醚（5%）麻醉小鼠。
3. 检查麻醉小鼠的呼吸频率和尾巴/爪子捏反射。
   注意:在下一步之前，鼠标必须无响应。
4. 在肋骨下方的皮肤、肌肉和腹壁上做一个 4-5 厘米的切口。
5. 小心地将肝脏稍微从横膈膜上移开。
6. 切开隔膜以暴露小鼠的心脏。
7. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）和PBS中冰冷的4%多聚甲醛灌注小鼠通过心脏。
8. 将小鼠斩首，用显微解剖钳和显微解剖剪刀仔细解剖大脑，取出整个大脑²³.将脑样品放入PBS中冰冷的4%多聚甲醛中3-4天，并用PBS洗涤3 x 5分钟。
9. 在小鼠脑切片支架（1 mm /切片）的第八个切口（1 mm/切片）从前向到后方向将大脑切成两部分。将大脑放入包埋模具中，并将大脑样品嵌入低熔点琼脂糖（PBS中的4%）。
10. 使用强力胶将嵌入琼脂糖中的大脑粘在振动切片机的舞台上。使用振动切片机将大脑冠状地切成50μm脑切片。
11. 在室温下孵育在封闭缓冲液（1:1，000稀释度）中稀释的神经示踪剂的抗体中的脑切片过夜。
    注意:封闭缓冲液含有10%马血清，0.1%Triton X-100和0.02%叠氮化钠。
12. 用PBST清洗切片3 x 5分钟（PBS含0.1%Triton X-100）。
13. 在室温下将脑切片在封闭缓冲液（1:500稀释度）中稀释的荧光染料偶联二抗中孵育2小时。
14. 用PBS清洗切片3 x 5分钟。
15. 用含有4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂将脑切片安装在载玻片上。
16. 用显微镜盖玻片盖住载玻片。
17. 在滑动边缘涂上指甲油，以避免安装介质泄漏。
18. 在室温下孵育过夜后，避光，使用荧光显微镜对输注部位的荧光信号进行成像。

10.可选:通过小鼠侧脑室中的定制不锈钢引导套管输注代谢物

1. 遵循协议第 1-8 节，用不锈钢引导套管替换商业导引套管，通过鼠标中的不锈钢注射器注入化学品。
   注意:讨论部分详细介绍了不同商用和不锈钢插管的优缺点。
2. 按照与方案第2节和第3节中所述相同的方式执行手术方案，但请记住用不锈钢导引套管替换商业导引套管（图5B）。
   注意:不锈钢导向套管、不锈钢假人和不锈钢喷油器（图 5A）是按照 材料表中显示的规格定制的。将定制的不锈钢导管插入孔中，直到达到所需的深度（2.0 mm）。
3. 使用由显微注射控制器和显微注射泵组成的显微注射系统（图4B）（与协议第4-7节相同），通过不锈钢导管套管注入SCFA。对于不锈钢导向套管的不锈钢假人，轻轻弯曲不锈钢注射器的一侧，直到另一侧的尖端比不锈钢导向套管长 1 毫米。
4. 通过不锈钢引导套管将2，100nL的神经示踪剂注入小鼠的侧脑室（与方案第9节相同）。
5. 神经示踪剂输注后收集样本30分钟（与方案第9节相同）。
6. 在神经示踪剂注入的脑切片中进行图像采集（与协议第9节相同）。

结果

在引导套管植入恢复后1周向小鼠注入SCFAs，以评估新型笼子中的运动活动。将小鼠放置在一个新的笼子中，并在前5分钟（输送速率为7nL / s）通过植入大脑侧脑室的商业引导套管向大脑注入2，100nL SCFAs或ACSF。输注后再记录30分钟新笼中的运动活动。在SCFAs和ACSF输注之间的新笼子中的运动活动没有观察到差异（图6）（每组n = 2只小鼠;数据显示为平均±s.e.m.并通过双向方差分析?...

讨论

肠道来源的代谢物与脑介导的疾病有关，没有太多精确的机制，部分原因是它们在体内的多个结合位点⁶，^12，24。先前的报告表明，SCFAs可以作为G蛋白偶联受体的配体，表观遗传调节因子^{和体内多个}部位的能量产生来源6^，12。为了绕过源自外周的混杂因素（如免疫细胞、激素和自主?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41	Pfizer	n/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit	ThermoFisher Scientific	A-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal)	Millipore	AB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Sterile	NEST	121921LA01
CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016	ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2%	Phoenix	NDC 57319-611-09
Chlorhexidine solution	Phoenix	NDC 57319-599-09
Commercial dummy	RWD Life Science	62004	Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannul	RWD Life Science	62104	Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm
Commercial injector	RWD Life Science	62204	Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylic	HYGENIC	n/a
Fixing screws	RWD Life Science	62521
Fluoroshield mounting medium with DAPI	Abcam	AB104139
Horse serum	ThermoFisher Scientific	16050130
Insulin syringes	BBraun	XG-LBB-9151133S-1BX	1 mL
Isoflurane	Panion & BF biotech	DG-4900-250D
KCl	Sigma-Aldrich	P3911	ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen	Swiss Pharmaceutical	n/a
Lidocaine	AstraZeneca	n/a
Low melting point agarose	Invitrogen	16520
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slips	MARIENFELD	101242
Microscope slides	ThermoFisher Scientific	4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NF	Macron Fine Chemicals	MA-6358-04
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282	ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue)	3M	1469SB	3M Vetbond
Neural tracer	Santa Cruz	SC-358883	FluoroGold
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Polyethylene tube	RWD Life Science	62329	OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) Ointment	Dechra	12920060
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889	SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium butyrate	Sigma-Aldrich	B5887	SCFAs: 8 mM
Sodium propionate	Sigma-Aldrich	P1880	SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannula	Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD.	n/a	OD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injector	Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD.	n/a	OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
Superglue	Krazy Glue	KG94548R
Triton X-100	Merck	1.08603.1000
Equipment
Cannula holder	RWD Life Science	B485-68217
Ceiling camera	FOSCAM	R2
Digital stereotaxic instruments	Stoelting	51730D
Dissecting microscope	INNOVIEW	SEM-HT/TW
Glass Bead Sterilizer	RWD Life Science	RS1501
Heating pad	Stoelting	53800M
Leica microscope	Leica	DM2500
Micro Dissecting Forceps	ROBOZ	RS-5136	Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length
Micro Dissecting Scissors	ROBOZ	RS-5918	4.5" Angled Sharp
Microinjection controller	World Precision Instruments (WPI)	MICRO2T	SMARTouch Controller
Microinjection syringe pump	World Precision Instruments (WPI)	UMP3T-1	UltraMicroPump3
Microliter syringe	Hamilton	80014	10 µL
Optical Fiber Cold Light with double Fiber	Step	LGY-150	Local vendor
Pet trimmer	WAHL	09962-2018
Vaporiser for Isoflurane	Step	AS-01	Local vendor
Vibratome	Leica	VT1000S
Software
Animal behavior video tracking software	Noldus	EthoVision	Version: 15.0.1416
Leica Application Suite X software	Leica	LASX	Version: 3.7.2.22383