JoVE Logo
저자
연락처

로그인

JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

장 유래 미생물 대사 산물은 동물에서 복잡한 행동으로 이어지는 다면적 효과가 있습니다. 우리는 가이드 캐뉼러를 통한 뇌실 내 전달을 통해 뇌에서 장 유래 미생물 대사 산물의 효과를 설명하는 단계별 방법을 제공하는 것을 목표로합니다.

초록

장내 미생물총과 그 대사 산물이 숙주 생리학 및 행동에 미치는 영향은 지난 10년 동안 광범위하게 조사되었습니다. 수많은 연구에 따르면 장내 미생물총에서 파생된 대사 산물은 숙주의 복잡한 장-뇌 경로를 통해 뇌 매개 생리 기능을 조절합니다. 단쇄 지방산(SCFA)은 장내 마이크로바이옴에 의해 식이 섬유 발효 중에 생성되는 주요 박테리아 유래 대사 산물입니다. 장에서 분비된 SCFA는 말초의 여러 부위에서 작용하여 SCFA 수용체의 광대한 분포로 인해 면역, 내분비 및 신경 반응에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 SCFA의 경구 및 복강 내 투여를 통해 SCFA의 중추 및 말초 효과를 구별하는 것은 어렵습니다. 이 논문은 자유롭게 움직이는 마우스에서 가이드 캐뉼러를 통해 뇌에서 SCFA의 기능적 역할을 조사하는 비디오 기반 방법을 제시합니다. 뇌에서 SCFA의 양과 유형은 주입량과 속도를 조절하여 조정할 수 있습니다. 이 방법은 과학자들에게 뇌에서 장 유래 대사 산물의 역할을 이해하는 방법을 제공 할 수 있습니다.

서문

인간의 위장관에는 숙주 1,2,3에 영향을 미치는 다양한 미생물이 있습니다. 이 장내 박테리아는 숙주 4,5가 소비하는식이 성분을 활용하는 동안 장 유래 대사 산물을 분비 할 수 있습니다. 흥미롭게도, 말초에서 대사되지 않은 장 대사 산물은 순환을 통해 다른 기관으로 운반 될 수 있습니다6. 참고로, 이러한 분비 된 대사 산물은 중추 신경계와 장7 사이의 양방향 통신으로 정의되는 장-뇌 축의 매개체 역할을 할 수 있습니다. 이전 연구에 따르면 장 유래 대사 산물은 동물의 복잡한 행동과 감정을 조절할 수 있습니다 8,9,10,11.

단쇄 지방산 (SCFA)은식이 섬유와 소화되지 않는 탄수화물의 발효 과정에서 장내 미생물에 의해 생성되는 주요 대사 산물입니다6. 아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트는 장12에서 가장 풍부한 SCFA입니다. SCFA는 위장관에서 세포의 에너지 원 역할을합니다. 장에서 대사되지 않은 SCFA는 문맥을 통해 뇌로 운반되어 뇌와 행동을 조절할 수 있습니다 6,12. 이전 연구에서는 SCFA가 신경 정신 장애에서 중요한 역할을 할 수 있다고 제안했습니다 6,12. 예를 들어, 자폐 스펙트럼 장애(ASD)의 동물 모델인 BTBR T+ Itpr3tf/J(BTBR) 마우스에서 부티레이트를 복강 내 주사하여 사회적 결핍을 구제했습니다13. 우울증 피험자로부터 미생물총을 투여받은 항생제 처리된 쥐는 불안과 유사한 행동과 대변 SCFA의 증가를 보였다14. 임상 적으로, 대변 SCFA 수준의 변화는 일반적으로 발달하는 대조군15,16과 비교하여 ASD 환자에서 관찰되었습니다. 우울증이 있는 사람들은 건강한 피험자보다 대변 SCFA 수치가 낮습니다17,18. 이 연구는 SCFA가 다양한 경로를 통해 동물과 인간의 행동을 바꿀 수 있음을 시사했습니다.

미생물 대사 산물은 신체의 여러 부위에 다양한 효과를 발휘하여 위장관, 미주 신경 및 교감 신경을 포함한 숙주 생리학및 행동 4,19에 영향을 미칩니다. 말초 경로를 통해 대사 산물을 투여 할 때 뇌에서 장 유래 대사 산물의 정확한 역할을 정확히 찾아내는 것은 어렵습니다. 이 논문은 자유롭게 움직이는 마우스의 뇌에서 장 유래 대사 산물의 영향을 조사하기위한 비디오 기반 프로토콜을 제시합니다 (그림 1). 우리는 SCFA가 행동 테스트 중에 가이드 캐뉼러를 통해 급격하게 주어질 수 있음을 보여주었습니다. 대사 산물의 유형, 부피 및 주입 속도는 목적에 따라 변형 될 수 있습니다. 캐뉼라이제이션 부위는 특정 뇌 영역에서 장 대사 산물의 영향을 탐색하도록 조정할 수 있습니다. 우리는 과학자들에게 장 유래 미생물 대사 산물이 뇌와 행동에 미치는 잠재적 영향을 탐구 할 수있는 방법을 제공하는 것을 목표로합니다.

프로토콜

모든 실험 프로토콜과 동물 관리는 국립 쳉쿵 대학교 (NCKU) 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. 실험동물에 대한 준비

  1. 공급 업체로부터 6-8 주 된 야생형 C57BL / 6JNarl 수컷 마우스를 구하십시오.
  2. 표준 마우스 케이지에 마우스를 수용하고 표준 마우스 차우와 멸균 된 물을 자유롭게 만듭니다.
    참고: NCKU 실험실 동물 센터의 주거 조건은 22 ± 1 ° C 온도, 55 % ± 10 % 습도 및 13 시간 / 11 시간 명암 사이클입니다.

2. 정위 수술

  1. 정위 도구, 수술 도구 및 관련 품목을 준비하고 살균하십시오.
    알림: 수술 부위에 직접 접촉하는 모든 품목은 감염을 피하기 위해 멸균해야합니다.
  2. 마우스를 산소에서 1 % -5 % 이소 플루 란으로 플렉시 글라스 케이지에 넣어 마취하십시오.
    알림: 마우스를 면밀히 관찰하여 호흡 속도가 초당 약 1회 호흡으로 유지되는지 확인하십시오.
  3. 마우스를 마취실에서 꺼냅니다. 애완 동물 트리머로 수술 부위 (마우스 머리)를 면도하십시오. 마우스를 정위 앞니 홀더의 앞니 막대에 마우스 앞니를 고정하여 입체 프레임에 놓습니다. 코 콘 마스크로 코를 가리십시오.
  4. 정위 수술 전반에 걸쳐 산소에서 1%-2.5% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다. 발가락 핀치 반사를 통해 마우스의 통각을 평가하고 수술 부위를 절개하기 전에 일정한 호흡 속도를 확인하십시오.
  5. 수술 중 체온을 유지하기 위해 입체 프레임의 마우스 아래에 가열 패드(37.0°C)를 놓습니다. 또는 프로그래밍된 워머와 가열 패드를 연결하는 직장 열 프로브를 사용하여 코어 온도를 유지하십시오.
  6. 접착 테이프를 사용하여 머리에 손질 된 모피를 제거하십시오. 통증을 완화하기 위해 진통제 케토 프로 펜 (5mg / kg)을 피하 주사하십시오. 안구 건조증을 피하기 위해 눈 연고를 바르십시오.
  7. 뾰족한 이어바를 외이도에 삽입하여 머리를 고정합니다.
  8. 이어 바의 눈금을 조정하여 머리를 중앙에 배치하십시오.
  9. 수직 이동을 피하기 위해 앞니 홀더의 코 클램프를 조입니다. 머리를 부드럽게 눌러 머리가 고정되어 있는지 확인하고 후속 수술 중에 머리가 느슨해지지 않도록하십시오.
  10. 면봉을 사용하여 클로르헥시딘을 세 번 번갈아 가며 문질러 두피를 소독하십시오. 중앙에서 바깥쪽으로(가장 소독된 중앙 영역에서 가장 적게 소독된 영역까지) 각 스크럽을 시작합니다.
    알림: 중간에서 외부로 스크럽을 사용하면 과학자들이 모피의 감염과 오염을 최소화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 바깥 쪽 영역은 면도하지 않은 머리 영역에 가깝고 여전히 많은 양의 털이 있고 철저히 소독하기가 쉽지 않습니다.
  11. 수술용 칼날을 사용하여 전/후방 방식(<1cm)으로 두피를 절개합니다. 절개 부위를 열고 미세 해부 집게로 잡은 면봉으로 두개골을 닦으십시오.
    알림: 미세 해부 집게, 수술용 칼날 및 면봉은 수술 전에 오토클레이빙으로 멸균해야 합니다. 수술 과정 동안, 각 동물 전후 최소 5초 동안 유리 비드 멸균기(150°C)를 사용하여 모든 수술 장비를 멸균한다. 수술 과정과 동물 사이에 수술 칼날과 집게를 고정하기 위해 멸균 된 비커를 준비하십시오.
  12. 두개골에서 브레그마와 람다를 식별합니다. Bregma를 참조로 사용하여 관심 영역을 찾습니다.
    1. 옵션: 정위 드릴 홀더에 정위 드릴을 장착하고 드릴 팁을 사용하여 Bregma를 참조로 지정합니다. 유리 비드 멸균기(150°C)를 사용하여 입체 드릴을 적어도 5초 동안 멸균한다.
  13. Bregma/Lambda를 기준으로 왼쪽/오른쪽 및 전방/후방 평면의 평평한 두개골 수평면을 보정하고 정렬합니다.
    참고: 올바른 수평면에 있지 않은 경우 마우스를 스테레오택시 기기에 다시 장착하십시오.

3. 상업용 맞춤형 가이드 캐뉼라 이식

  1. 정위 좌표를 기반으로 우측 측심실의 위치를 식별하고 레이블을 지정합니다: 브레그마까지의 거리, 전방/후방(A/P): 0.26mm, 내측/외측(M/L): -1.0mm, 등/복부(D/V): -2.0mm20.
    참고: 좌표는 관심 영역에 따라 수정할 수 있습니다. 측뇌실의 좌표는 체중 범위가 26-30g인 성인 C57BL/6J 마우스를 기반으로 했습니다. 어린 마우스를 사용하는 경우 토론을 참조하십시오.
  2. 상업용 가이드 캐뉼러의 이식을 위해 정위 드릴을 사용하여 라벨이 붙은 부위의 두개골을 통해 구멍 (직경 = 1.5mm)을 뚫습니다.
  3. 스테인레스 스틸 나사 장착을위한 입체 드릴을 사용하여 두개골에 2-4 개의 구멍 (직경 = 1.5mm)을 더 뚫습니다.
    알림: 각 동물 전후에 최소 150초 동안 유리 비드 살균기(5°C)를 사용하여 입체 드릴을 소독합니다.
  4. 뼈 조각을 닦고 면봉으로 출혈을 멈추십시오.
  5. 국소 마취, 소양증 및 통증 완화 효과를 위해 면봉을 사용하여 리도카인(1mg/kg)으로 두개골을 닦습니다. 드릴링 후 출혈이 멈추지 않으면 지혈을 위해 구멍에 면봉을 부드럽게 놓습니다.
  6. 구멍에 2-4 개의 스테인리스 나사를 장착하여 치과 용 아크릴 용 앵커를 제공합니다.
  7. 상업용 가이드 캐뉼러를 정위 캐뉼라 홀더에 놓고 유리 비드 멸균기 (150 ° C)로 소독합니다.
    알림: 상업용 가이드 캐뉼라, 상업용 더미 및 상업용 인젝터(그림 2A)는 재료 표에 표시된 사양으로 사용자 정의되었습니다.
  8. 정위 캐뉼러 홀더를 측심실용으로 뚫은 구멍으로 옮기고 원하는 깊이(2.5mm)가 될 때까지 상업용 가이드 캐뉼러를 구멍에 천천히 삽입합니다.
    알림: 등쪽 / 복부 좌표는 팁이 구멍에 거의 삽입되지 않은 경우 상업용 가이드 캐뉼러의 팁을 기준으로 설정하여 정의 할 수 있습니다.
  9. 10μL의 n-부틸 시아노아크릴레이트 접착제(조직 접착제)를 적용하여 드릴된 구멍에 상업용 가이드 캐뉼러를 고정하고 3-4분 동안 기다립니다. 상업용 가이드 캐뉼러를 정위 캐뉼라 홀더에서 부드럽게 풀고 홀더를 멀리 옮깁니다.
  10. 절개된 두피에 치과용 아크릴을 바르고 시판 가이드 캐뉼러를 고정하고 최소 5분 동안 기다립니다. 상업용 더미를 상업용 가이드 캐뉼라에 이식하여 혈액이나 체액에 의한 캐뉼러 막힘을 방지합니다(그림 2B).
  11. 외이도에서 이어 바를 풀고 정위 프레임에서 마우스를 제거합니다.
  12. 마취에서 회복하기 위해 아래에 가열 패드가 있는 새 케이지에 마우스를 넣고 마우스가 완전히 깨어날 때까지 계속 관찰합니다.
    알림: 동물이 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 동물을 방치하지 마십시오. 수술을받은 동물은 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사로 돌아 가지 않아야합니다.
  13. 마우스를 단일 하우징 또는 그룹 하우징으로 되돌립니다., 기관 IACUC 프로토콜 및 실험 설계에 따라. 그룹 주택의 경우 원치 않는 부상이나 캐뉼라의 분리를 최소화하기 위해 케이지에 더 적은 수의 생쥐가 수용되도록하십시오.
  14. 수술 후 관리를 위해 최소 3일 동안 식수에 이부프로펜(0.2mg/mL)을 투여하고 최소 3일 동안 통증과 고통의 징후가 있는지 하루에 두 번 모니터링합니다.
    1. 수술 후 관리 중에 마우스의 염증과 감염을 예방하기 위해 피부 주위에 록시스로 마이신 연고를 바르십시오.
    2. 동물의 상태를 계속 모니터링하고 충분한 에너지를 제공하기 위해 5 % 포도당 및 / 또는 0.9 % 염화나트륨을 적시에 복강 주사하십시오.
    3. 통증, 고통, 또는 감염의 상태가 꾸준히 악화되면, 마우스를CO2 흡입으로 안락사시킨다.
  15. 마우스가 SCFA의 뇌뇌실 내 전달 및 행동 테스트를 위해 준비될 때까지 수술 후 1주일 동안 기다립니다.

4. SCFA의 제조

  1. 아세트산 나트륨, 부티르산 나트륨 및 프로 피오 네이트 나트륨을 인공 뇌척수액 (ACSF)에 녹입니다 ( 재료 표 참조).
  2. 화학 물질이 완전히 용해되었는지 확인한 다음 pH를 7.4로 조정하고 멸균을 위해 0.22μm 필터를 통해 SCFA 혼합물을 여과합니다.

5. 행동 테스트 중 SCFA의 뇌실 내 전달을 위한 주입 시스템 설정

  1. 천장 카메라를 장착하여 동작을 기록합니다. 카메라를 컴퓨터에 연결하여 비디오 녹화 소프트웨어를 제어합니다(그림 3).
  2. 10μL 주사기에 증류수를 채웁니다.
    알림: 마이크로리터 주사기에 기포가 생기지 않도록 하십시오.
  3. 마이크로 주입 펌프를 마이크로 주입 컨트롤러와 연결하십시오.
  4. 마이크로 주입 펌프에 마이크로 리터 주사기를 장착하십시오. 주사기를 설치하려면 버튼을 눌러 cl을 푸십시오.amp 해당 위치에 주사기를 설치하십시오. 클램프를 닫고 마이크로 주입 펌프의 플런저 고정 나사를 조입니다(그림 4A).
  5. 상업용 인젝터를 폴리에틸렌 튜브에 삽입합니다(그림 2A).
  6. 테스트 경기장 위의 천장 카메라에 폴리에틸렌 튜브를 걸어 놓습니다.
  7. 인슐린 주사기를 사용하여 폴리에틸렌 튜브를 증류수로 채 웁니다. 마이크로 리터 주사기를 매달린 폴리에틸렌 튜브에 연결하십시오.
    알림: 폴리에틸렌 튜브가 마우스가 테스트 경기장 전체에서 자유롭게 움직일 수 있을 만큼 충분히 길어야 합니다.

6. 미세 주입 컨트롤러의 시스템 설정

  1. 미세 주입 컨트롤러를 켜고 모든 채널 표시를 눌러 명령 화면에 액세스합니다(그림 4C). 구성을 누르고 볼륨 목표를 9,800nL로, 전달 속도를 100nL/s로 설정합니다. 마이크로리터 주사기에 연결된 폴리에틸렌 튜브에서 9,800nL의 증류수를 주입합니다(방향을 눌러 주입 모드로 전환하고 RUN을 누름)(그림 4C의 명령 화면에서 빨간색 사각형 참조).
  2. 구성을 누르고 볼륨 목표를 3,000nL로, 전달 속도를 100nL/s로 설정합니다. 3,000nL의 광유를 인출합니다(방향을 눌러 인출 모드로 전환하고 RUN을 누름)(그림 4C의 명령 화면에서 빨간색 사각형 참조).
    알림: 폴리에틸렌 튜브에서 명확한 오일-물 상 분리가 관찰되어야 합니다.
  3. 마이크로 리터 주사기 바늘에서 폴리에틸렌 튜브를 분해하십시오. 마이크로리터 주사기 바늘에서 3,000nL의 증류수를 뱉어냅니다( 방향을 눌러 주입 모드로 전환하고 RUN을 누름).
  4. 마이크로리터 주사기를 폴리에틸렌 튜브에 다시 삽입합니다. 구성을 누르고 볼륨 목표를 9,500nL로, 전달 속도를 100nL/s로 설정합니다. 9,500nL의 SCFA를 인출합니다(방향을 눌러 인출 모드로 전환하고 RUN을 누름). 오일-SCFA 단계에 라벨을 부착하여 SCFA가 성공적으로 주입되었는지 확인합니다.
  5. 구성을 누르고 전달 속도로 원하는 볼륨 목표를 7nL/s로 설정합니다. 방향을 눌러 주입 모드로 전환합니다(그림 4C의 명령 화면에 있는 빨간색 사각형 참조).
    알림: 주입 시간을 기준으로 볼륨을 결정하십시오. 예를 들어, 주입 시간이 7nL/s의 전달 속도에 대해 3분인 경우 목표 부피 = 1,260nL입니다.
  6. SCFA 주입을 위해 캐뉼러에 주입기를 삽입하기 전에 상업용 인젝터의 앞쪽 끝에서 액체가 나올 때까지 RUN 을 눌러 마이크로리터 주사기를 앞으로 주입합니다.

7. 자유롭게 움직이는 마우스의 상업용 가이드 캐뉼러를 통해 SCFA를 측심실에 주입

  1. 마우스를 산소에서 1 % -5 % 이소 플루 란으로 플렉시 글라스 케이지에 넣어 마취하십시오.
    알림: 마우스를 면밀히 관찰하여 호흡 속도가 초당 약 1회 호흡으로 유지되는지 확인하십시오.
  2. 마우스를 긁고 상업용 인젝터를 상업용 가이드 캐뉼러에 삽입합니다(그림 4B).
    알림: 상업용 가이드 캐뉼러가 혈액이나 체액으로 막힌 경우 핀셋으로 부드럽게 막으십시오.
  3. 행동 테스트 전에 케이지에서 15분 동안 마우스가 마취에서 회복되도록 합니다.
  4. 기본 운동 테스트의 경우 마우스를 새로운 케이지에 넣고 35분 동안 자유롭게 탐색할 수 있도록 합니다. 처음 5분 동안 목표 부피 2,100nL에 대해 7nL/s의 전달 속도를 사용하여 SCFA를 주입합니다(주입 모드로 방향을 누르고 RUN을 누름).
    참고: 신규 케이지 내의 이동은 동물 행동 비디오 추적 소프트웨어(21, 22)를 사용하여 분석될 수 있다.
  5. 마우스를 마취하고(7.1단계 반복) 상업용 가이드 캐뉼라에서 상업용 인젝터를 제거합니다.
    알림: 마우스는 이전 주사를 씻어 내기 위해 적절한 시간을 준 후 다른 대조군 / 대사 산물을 반복적으로 주사 할 수 있습니다. 캐뉼러가 마우스 머리에 고정되어있는 한, 마우스는 다른 대사 산물로 반복적으로 테스트 될 수 있습니다.

8. 미세 주입 시스템의 복원

  1. 마이크로 리터 주사기에서 폴리에틸렌 튜브를 분해하십시오.
  2. 인슐린 주사기를 사용하여 튜브에 공기를 주입하여 폴리에틸렌 튜브의 증류수를 버립니다. 마이크로리터 주사기를 비우십시오.
  3. 구성 화면에서 Reset Pos를 눌러 주사기 중지 정의 화면을 엽니다(그림 4C).
  4. 신호음이 날 때까지 Withdrawal을 눌러 미세 주입 펌프를 완전히 빼낸 위치로 재설정합니다(그림 4C).
  5. 명령 화면으로 돌아가서 이 화면에 **END REACH** 기호가 있는 경우 마이크로 주입 컨트롤러를 끕니다(그림 4C).

9. 선택 사항 : 신경 추적자에 의한 뇌실 내 주사 검증

  1. 2,100nL의 신경 추적기에 7nL/s의 전달 속도를 주입하여 주입 부위를 확인합니다.
    알림: 역류를 방지하기 위해 인젝터를 가이드 캐뉼러에 5분 동안 그대로 두십시오.
  2. 신경 추적자 주입 후 30 분 후에 이소 플루 란 (5 %)의 과다 복용으로 마우스를 마취하십시오.
  3. 마취된 마우스의 호흡률과 꼬리/발 핀치 반사를 확인합니다.
    참고: 마우스는 다음 단계 전에 응답하지 않아야 합니다.
  4. 흉곽 아래의 피부, 근육 및 복벽을 통해 4-5cm 절개를하십시오.
  5. 간을 횡격막에서 조심스럽게 약간 움직입니다.
  6. 다이어프램을 절개하여 마우스의 심장을 노출시킵니다.
  7. 인산염 완충 식염수(PBS)와 PBS의 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드로 심장을 통해 마우스를 관류합니다.
  8. 마우스를 참수하고 미세 해부 집게와 미세 해부 가위로 뇌를 조심스럽게 해부하여 전체 뇌를 꺼냅니다23. 뇌 샘플을 PBS의 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드에 3-4일 동안 넣고 PBS로 3 x 5분 동안 세척합니다.
  9. 마우스 뇌 슬라이스 홀더의 여덟 번째 컷(1mm/섹션)에서 마우스 뇌 슬라이스 홀더의 뇌를 앞쪽에서 뒤쪽 방향으로 두 부분으로 자릅니다. 뇌를 임베딩 몰드에 넣고 뇌 샘플을 저융점 아가로스(PBS에서 4%)에 삽입합니다.
  10. 아가로스에 내장된 뇌를 초강력 접착제를 사용하여 비브라톰 무대에 붙입니다. 비브라톰을 사용하여 뇌를 관상으로 50μm 뇌 조각으로 나눕니다.
  11. 차단 완충액(1:1,000 희석)에 희석된 신경 추적자를 표적으로 하는 항체의 뇌 절편을 실온에서 밤새 배양합니다.
    참고: 블로킹 버퍼에는 10% 말 혈청, 0.1% 트리톤 X-100 및 0.02% 아지드화 나트륨이 포함되어 있습니다.
  12. 슬라이스를 PBST(0.1% 트리톤 X-100이 있는 PBS)로 3 x 5분 동안 세척합니다.
  13. 뇌 절편을 블로킹 완충액(1:500 희석)에 희석된 형광염료 접합 2차 항체에 실온에서 2시간 동안 인큐베이션합니다.
  14. PBS로 슬라이스를 3 x 5분 동안 세척합니다.
  15. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)이 포함된 장착 매체를 사용하여 뇌 조각을 슬라이드에 장착합니다.
  16. 현미경 커버 슬립으로 슬라이드를 덮으십시오.
  17. 장착 매체의 누출을 방지하기 위해 슬라이드 가장자리에 매니큐어를 바르십시오.
  18. 빛으로부터 보호되는 실온에서 밤새 배양한 후, 형광 현미경을 사용하여 주입 부위의 형광 신호를 이미지화한다.

10. 선택: 쥐에 있는 측심실에 있는 주문을 받아서 만들어진 스테인리스 가이드 캐뉼러를 통해서 대사 산물의 주입

  1. 프로토콜 섹션 1-8을 따르고 상업용 가이드 캐뉼러를 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼러로 교체하여 마우스의 스테인리스 스틸 주입기를 통해 화학 물질을 주입합니다.
    참고: 다양한 상업용 및 스테인리스 스틸 캐뉼러의 장단점은 토론 섹션에서 자세히 설명합니다.
  2. 상용 가이드 캐뉼러를 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼러로 교체하는 것을 제외하고는 프로토콜 섹션 2 및 3에 설명된 것과 동일한 방식으로 수술 프로토콜을 수행합니다(그림 5B).
    알림: 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼라, 스테인리스 스틸 더미 및 스테인리스 스틸 인젝터(그림 5A)는 재료 표에 표시된 사양으로 사용자 정의되었습니다. 맞춤형 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼러를 원하는 깊이(2.0mm)가 될 때까지 구멍에 삽입합니다.
  3. 마이크로주입 컨트롤러와 마이크로주입 펌프(그림 4B)로 구성된 마이크로주입 시스템을 사용하여 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼러를 통해 SCFA를 주입합니다(프로토콜 섹션 4-7과 동일). 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼러의 스테인리스 스틸 더미의 경우 다른 쪽의 끝이 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼라보다 1mm 더 길어질 때까지 스테인리스 스틸 인젝터의 한쪽을 부드럽게 구부립니다.
  4. 2,100nL의 신경 추적자를 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼러를 통해 마우스의 측심실에 주입합니다(프로토콜 섹션 9와 동일).
  5. 신경 추적자 주입 후 30분 동안 샘플을 수집합니다(프로토콜 섹션 9와 동일).
  6. 신경 추적기 주입 뇌 조각에서 이미지 획득을 수행합니다(프로토콜 섹션 9와 동일).

결과

마우스를 가이드 캐뉼라 이식으로부터 회복된 지 1주일 후에 SCFA를 주입하여 신규한 케이지에서 운동 활성을 평가하였다. 마우스를 새로운 케이지에 넣고 뇌의 측면 심실에 이식 된 상업용 가이드 캐뉼라를 통해 처음 5 분 동안 2,100nL의 SCFA 또는 ACSF (7nL / s의 전달 속도)를 뇌에 주입했습니다. 새로운 케이지에서의 운동 활동은 주입 후 추가로 30 분 동안 기록되었습니다. SCFAs와 ACSF의 주입 사이의 신...

토론

장 유래 대사 산물은부분적으로 신체의 여러 결합 부위 6,12,24로 인해 많은 정확한 메커니즘없이 뇌 매개 질환과 관련이 있습니다. 이전 보고서에 따르면 SCFA는 G 단백질 결합 수용체, 후성 유전 조절자 및 신체의 여러 부위에서 에너지 생산 원을위한 리간드 역할을 할 수 있습니다 6,12

공개

저자는이 작업과 관련하여 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

우리는 동물을 돌보는 국립 쳉쿵 대학교 (NCKU)의 실험실 동물 센터 직원을 인정합니다. 이 작업은 CHENG-HSING 의료 재단의 Kun-Yen Huang 교수 교육 기금에서 C.-WL에 대한 장학금으로 지원되었습니다. 대만 과학 기술부 (MOST)의 기금 : (학부 연구 MOST 109-2813-C-006-095-B) TO T.-H.Y.; (대부분 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3)에서 W.-L.W.로; 그리고 고등 교육 새싹 프로젝트, 교육부에서 NCKU에서 W.-L.W까지의 대학 진흥 본부에

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41Pfizern/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbitThermoFisher ScientificA-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal)MilliporeAB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, SterileNEST121921LA01
CaCl2 Sigma-AldrichC1016ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2%PhoenixNDC 57319-611-09
Chlorhexidine solutionPhoenixNDC 57319-599-09
Commercial dummyRWD Life Science62004Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannulRWD Life Science62104Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injectorRWD Life Science62204Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylicHYGENICn/a
Fixing screwsRWD Life Science62521
Fluoroshield mounting medium with DAPIAbcamAB104139
Horse serumThermoFisher Scientific16050130
Insulin syringesBBraunXG-LBB-9151133S-1BX1 mL
Isoflurane Panion & BF biotechDG-4900-250D
KCl Sigma-AldrichP3911ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen Swiss Pharmaceuticaln/a
Lidocaine AstraZenecan/a
Low melting point agaroseInvitrogen16520
MgCl2 Sigma-AldrichM8266ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slipsMARIENFELD101242
Microscope slidesThermoFisher Scientific4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NFMacron Fine ChemicalsMA-6358-04
NaCl Sigma-AldrichS9888ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4 Sigma-AldrichS8282ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3 Sigma-AldrichS5761ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue)3M1469SB3M Vetbond
Neural tracer Santa CruzSC-358883FluoroGold
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Polyethylene tubeRWD Life Science62329OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) OintmentDechra 12920060
Sodium acetate Sigma-AldrichS2889SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide Sigma-AldrichS2002
Sodium butyrate Sigma-AldrichB5887SCFAs: 8 mM
Sodium propionate Sigma-AldrichP1880SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannulaChun Ta stainless steel enterprise CO., LTD.n/aOD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injectorChun Ta stainless steel enterprise CO., LTD.n/aOD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
SuperglueKrazy GlueKG94548R
Triton X-100Merck1.08603.1000
Equipment
Cannula holderRWD Life ScienceB485-68217
Ceiling cameraFOSCAMR2
Digital stereotaxic instrumentsStoelting51730D
Dissecting microscopeINNOVIEWSEM-HT/TW
Glass Bead SterilizerRWD Life ScienceRS1501
Heating padStoelting53800M
Leica microscope LeicaDM2500
Micro Dissecting ForcepsROBOZRS-5136Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting ScissorsROBOZRS-59184.5" Angled Sharp
Microinjection controllerWorld Precision Instruments (WPI)MICRO2TSMARTouch Controller
Microinjection syringe pumpWorld Precision Instruments (WPI)UMP3T-1UltraMicroPump3  
Microliter syringeHamilton8001410 µL
Optical Fiber Cold Light with double FiberStepLGY-150Local vendor
Pet trimmerWAHL09962-2018
Vaporiser for IsofluraneStepAS-01Local vendor
VibratomeLeicaVT1000S
Software
Animal behavior video tracking softwareNoldusEthoVisionVersion: 15.0.1416
Leica Application Suite X softwareLeicaLASXVersion: 3.7.2.22383

참고문헌

  1. Lynch, J. B., Hsiao, E. Y. Microbiomes as sources of emergent host phenotypes. Science. 365 (6460), 1405-1409 (2019).
  2. Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome-gut-brain axis in health and disease. Gastroenterology Clinics of North America. 46 (1), 77-89 (2017).
  3. Sharon, G., Sampson, T. R., Geschwind, D. H., Mazmanian, S. K. The central nervous system and the gut microbiome. Cell. 167 (4), 915-932 (2016).
  4. Krautkramer, K. A., Fan, J., Backhed, F. Gut microbial metabolites as multi-kingdom intermediates. Nature Reviews: Microbiology. 19 (2), 77-94 (2021).
  5. Lavelle, A., Sokol, H. Gut microbiota-derived metabolites as key actors in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 223-237 (2020).
  6. Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. The role of short-chain fatty acids in microbiota-gut-brain communication. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 16 (8), 461-478 (2019).
  7. Morais, L. H., Schreiber, H. L. T., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews: Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  8. Sharon, G., et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).
  9. St Laurent, R., O'Brien, L. M., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
  10. Govindarajan, N., Agis-Balboa, R. C., Walter, J., Sananbenesi, F., Fischer, A. Sodium butyrate improves memory function in an Alzheimer's disease mouse model when administered at an advanced stage of disease progression. Journal of Alzheimer's Disease. 26 (1), 187-197 (2011).
  11. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  12. Silva, Y. P., Bernardi, A., Frozza, R. L. The role of short-chain fatty acids from gut microbiota in gut-brain communication. Frontiers in Endocrinology. 11, 25 (2020).
  13. Kratsman, N., Getselter, D., Elliott, E. Sodium butyrate attenuates social behavior deficits and modifies the transcription of inhibitory/excitatory genes in the frontal cortex of an autism model. Neuropharmacology. 102, 136-145 (2016).
  14. Kelly, J. R., et al. Transferring the blues: Depression-associated gut microbiota induces neurobehavioural changes in the rat. Journal of Psychiatric Research. 82, 109-118 (2016).
  15. Wang, L., et al. Elevated fecal short chain fatty acid and ammonia concentrations in children with autism spectrum disorder. Digestive Diseases and Sciences. 57 (8), 2096-2102 (2012).
  16. Adams, J. B., Johansen, L. J., Powell, L. D., Quig, D., Rubin, R. A. Gastrointestinal flora and gastrointestinal status in children with autism--comparisons to typical children and correlation with autism severity. BMC Gastroenterology. 11, 22 (2011).
  17. Skonieczna-Zydecka, K., et al. Faecal short chain fatty acids profile is changed in Polish depressive women. Nutrients. 10 (12), 1939 (2018).
  18. Szczesniak, O., Hestad, K. A., Hanssen, J. F., Rudi, K. Isovaleric acid in stool correlates with human depression. Nutritional Neuroscience. 19 (7), 279-283 (2016).
  19. Martin, A. M., Sun, E. W., Rogers, G. B., Keating, D. J. The influence of the gut microbiome on host metabolism through the regulation of gut hormone release. Frontiers in Physiology. 10, 428 (2019).
  20. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . Paxinos and Franklin's The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).
  21. York, J. M., Blevins, N. A., McNeil, L. K., Freund, G. G. Mouse short- and long-term locomotor activity analyzed by video tracking software. Journal of Visualized Experiments. (76), e50252 (2013).
  22. Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice. Journal of Visualized Experiments. (164), e61023 (2020).
  23. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments. (168), e61941 (2021).
  24. Needham, B. D., Kaddurah-Daouk, R., Mazmanian, S. K. Gut microbial molecules in behavioural and neurodegenerative conditions. Nature Reviews: Neuroscience. 21 (12), 717-731 (2020).
  25. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
  26. Xiaoguang, W., et al. Establishment of a valuable mimic of Alzheimer's disease in rat animal model by intracerebroventricular injection of composited amyloid beta protein. Journal of Visualized Experiments. (137), e56157 (2018).
  27. Venniro, M., Shaham, Y. An operant social self-administration and choice model in rats. Nature Protocols. 15 (4), 1542-1559 (2020).
  28. Ucal, M., et al. Rat model of widespread cerebral cortical demyelination induced by an intracerebral injection of pro-inflammatory cytokines. Journal of Visualized Experiments. (175), e57879 (2021).
  29. Oberrauch, S., et al. Intraventricular drug delivery and sampling for pharmacokinetics and pharmacodynamics study. Journal of Visualized Experiments. (181), e63540 (2022).
  30. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injections of the enteric bacterial metabolic product propionic acid impair cognition and sensorimotor ability in the Long-Evans rat: further development of a rodent model of autism. Behavioural Brain Research. 200 (1), 33-41 (2009).
  31. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injection of propionic acid, an enteric metabolite implicated in autism, induces social abnormalities that do not differ between seizure-prone (FAST) and seizure-resistant (SLOW) rats. Behavioural Brain Research. 278, 542-548 (2015).
  32. Perry, R. J., et al. Acetate mediates a microbiome-brain-beta-cell axis to promote metabolic syndrome. Nature. 534 (7606), 213-217 (2016).
  33. Muller, P. A., et al. Microbiota modulate sympathetic neurons via a gut-brain circuit. Nature. 583 (7816), 441-446 (2020).
  34. Pardridge, W. M. CSF, blood-brain barrier, and brain drug delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 13 (7), 963-975 (2016).
  35. Wu, J. -. T., et al. Oral short-chain fatty acids administration regulates innate anxiety in adult microbiome-depleted mice. Neuropharmacology. , (2022).
  36. Lee, J., et al. Gut microbiota-derived short-chain fatty acids promote poststroke recovery in aged mice. Circulation Research. 127 (4), 453-465 (2020).
  37. Chiu, C., et al. Temporal course of cerebrospinal fluid dynamics and amyloid accumulation in the aging rat brain from three to thirty months. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 3 (2012).
  38. Schuler, B., Rettich, A., Vogel, J., Gassmann, M., Arras, M. Optimized surgical techniques and postoperative care improve survival rates and permit accurate telemetric recording in exercising mice. BMC Veterinary Research. 5, 28 (2009).
  39. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  40. Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
  41. de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
  42. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
  43. Wolter, J. M., et al. Cas9 gene therapy for Angelman syndrome traps Ube3a-ATS long non-coding RNA. Nature. 587 (7833), 281-284 (2020).
  44. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses for combinatorial cell-subclass-specific labeling. Neuron. 109 (9), 1449-1464 (2021).
  45. Xie, M., et al. TREM2 interacts with TDP-43 and mediates microglial neuroprotection against TDP-43-related neurodegeneration. Nature Neuroscience. 25 (1), 26-38 (2022).
  46. Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
  47. Bermudez-Martin, P., et al. The microbial metabolite p-Cresol induces autistic-like behaviors in mice by remodeling the gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 157 (2021).
  48. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  49. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).
  50. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  51. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  52. Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  53. Kaelberer, M. M., et al. A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction. Science. 361 (6408), (2018).
  54. Needham, B. D., Tang, W., Wu, W. L. Searching for the gut microbial contributing factors to social behavior in rodent models of autism spectrum disorder. Developmental Neurobiology. 78 (5), 474-499 (2018).
  55. Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
  56. Chu, C., et al. The microbiota regulate neuronal function and fear extinction learning. Nature. 574 (7779), 543-548 (2019).
  57. Wu, W. L., et al. Microbiota regulate social behaviour via stress response neurons in the brain. Nature. 595 (7867), 409-414 (2021).
  58. Buchanan, K. L., et al. The preference for sugar over sweetener depends on a gut sensor cell. Nature Neuroscience. 25 (2), 191-200 (2022).
  59. Han, W., et al. A neural circuit for gut-induced reward. Cell. 175 (3), 665-678 (2018).
  60. Yamawaki, Y., et al. Antidepressant-like effect of sodium butyrate (HDAC inhibitor) and its molecular mechanism of action in the rat hippocampus. World Journal of Biological Psychiatry. 13 (6), 458-467 (2012).
  61. Ho, L., et al. Protective roles of intestinal microbiota derived short chain fatty acids in Alzheimer's disease-type beta-amyloid neuropathological mechanisms. Expert Review of Neurotherapeutics. 18 (1), 83-90 (2018).
  62. Liu, J., et al. Anti-neuroinflammatory effect of short-chain fatty acid acetate against Alzheimer's disease via upregulating GPR41 and inhibiting ERK/JNK/NF-kappaB. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (27), 7152-7161 (2020).
  63. van de Wouw, M., et al. Short-chain fatty acids: microbial metabolites that alleviate stress-induced brain-gut axis alterations. Jounal of Physiology. 596 (20), 4923-4944 (2018).
  64. Olson, C. A., et al. The gut microbiota mediates the anti-seizure effects of the ketogenic diet. Cell. 173 (7), 1728-1741 (2018).
  65. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유