自由に動くマウスにおける腸由来微生物代謝物の脳室内送達

要約

腸由来の微生物代謝物は、動物の複雑な行動につながる多面的な影響を及ぼします。私たちは、ガイドカニューレを介した脳室内送達を介して脳内の腸由来微生物代謝物の影響を描写するための段階的な方法を提供することを目指しています。

要約

腸内細菌叢とその代謝産物が宿主の生理学と行動に与える影響は、この10年間で広範囲に調査されてきました。多くの研究により、腸内細菌叢由来の代謝物が宿主の複雑な腸脳経路を介して脳を介した生理学的機能を調節することが明らかになっています。短鎖脂肪酸(SCFA)は、腸内細菌叢による食物繊維発酵中に生成される主要な細菌由来の代謝物です。腸から分泌されたSCFAは、末梢の複数の部位で作用し、SCFA受容体の膨大な分布により、免疫、内分泌、および神経応答に影響を与える可能性があります。したがって、SCFAの経口および腹腔内投与を通じてSCFAの中枢および末梢効果を区別することは困難です。この論文は、自由に動くマウスのガイドカニューレ を介して 脳内のSCFAの機能的役割を調べるビデオベースの方法を提示します。脳内のSCFAの量と種類は、注入量と速度を制御することによって調整できます。この方法は、脳内の腸由来代謝物の役割を理解する方法を科学者に提供することができます。

概要

ヒトの胃腸管には、宿主に影響を与える多様な微生物が宿主を宿している^1,2,3。これらの腸内細菌は、宿主によって消費される食事成分の利用中に腸由来の代謝産物を分泌することができる^4,5。興味深いことに、末梢で代謝されていない腸代謝産物は、循環を介して他の臓器に輸送することができます⁶。注目すべきことに、これらの分泌された代謝産物は、中枢神経系と腸の間の双方向通信として定義される腸脳軸のメディエーターとして機能することができます⁷。以前の研究では、腸由来の代謝物が動物の複雑な行動や感情を調節できることが示されています^8,9,10,11。

短鎖脂肪酸(SCFA)は、食物繊維と難消化性炭水化物の発酵中に腸内細菌叢によって生成される主要な代謝物です⁶。酢酸塩、プロピオン酸塩、および酪酸塩は、腸内で最も豊富なSCFAです¹²。SCFAは、消化管内の細胞のエネルギー源として機能します。腸内の代謝されていないSCFAは、門脈を通って脳に輸送され、脳と行動を調節することができます^6,12。以前の研究では、SCFAが神経精神障害において重要な役割を果たす可能性があることが示唆されています^6,12。例えば、自閉症スペクトラム障害(ASD)の動物モデルであるBTBR T⁺ Itpr3^tf/J(BTBR)マウスへの酪酸の腹腔内注射は、彼らの社会的欠陥を救済しました¹³。うつ病の被験者から微生物叢を投与された抗生物質治療ラットは、不安様行動および糞便SCFAの増加を示した¹⁴。臨床的には、ASD患者では、通常発達中の対照と比較して、糞便SCFAレベルの変化が観察されました^15,16。うつ病の人は、健康な被験者よりも糞便SCFAレベルが低くなっています^17,18。これらの研究は、SCFAがさまざまな経路で動物や人間の行動を変える可能性があることを示唆しています。

微生物代謝産物は、体内の複数の部位に多様な影響を及ぼし、胃腸管、迷走神経、交感神経など、宿主の生理学と行動に影響を与えます^4,19。末梢経路を介して代謝物を投与する場合、脳内の腸由来代謝物の正確な役割を特定することは困難です。.この論文では、自由に動くマウスの脳における腸由来代謝物の影響を調べるためのビデオベースのプロトコルを提示します(図1)。SCFAは行動テスト中にガイドカニューレを介して急性に投与できることを示しました。代謝物の種類、量、注入速度は、目的に応じて変更することができます。カニューレ挿入部位を調整して、特定の脳領域における腸代謝物の影響を調べることができます。私たちは、腸由来の微生物代謝物が脳と行動に与える潜在的な影響を探求する方法を科学者に提供することを目指しています。

プロトコル

すべての実験プロトコルと動物の世話は、国立成功大学(NCKU)の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. 実験動物の準備

1. ベンダーから6〜8週齢の野生型C57BL / 6JNarlオスマウスを入手します。
2. 標準的なマウス飼料と滅菌水を 自由に入れた標準的なマウスケージにマウスを収容します。
   注意: NCKUの実験動物センターの収容条件は、温度22±1°C、湿度55%±10%、および13時間/ 11時間の明暗サイクルです。

2.定位固定手術

1. 定位固定装置、手術器具、および関連アイテムを準備および滅菌します。
   注:手術部位に直接接触するすべてのアイテムは、感染を避けるために滅菌する必要があります。
2. マウスを酸素中の1%〜5%イソフルランを含むプレキシグラスケージに入れて麻酔します。
   注意: マウスを注意深く観察して、呼吸数が毎秒約1回の呼吸に維持されていることを確認します。
3. マウスを麻酔室から取り出します。ペットトリマーで手術部位(マウスの頭)を剃ります。マウス切歯を定位固定装置用切歯ホルダーの切歯バーに固定することにより、マウスを定位固定装置フレームに置きます。ノーズコーンマスクで鼻を覆います。
4. 脳定位固定装置手術全体を通して、酸素中の1%〜2.5%イソフルランでマウスを麻酔します。つま先のピンチ反射 を介して マウスの侵害受容を評価し、手術部位を切開する前に一定の呼吸数を確保します。
5. 手術中に体温を維持するために、脳定位固定フレームのマウスの下に加熱パッド(37.0°C)を置きます。あるいは、プログラムされたウォーマーと加熱パッドを接続する直腸サーマルプローブを使用してコア温度を維持します。
6. 粘着テープを使用して頭のトリミングされた毛皮を取り除きます。痛みを和らげるために、鎮痛剤のケトプロフェン(5 mg / kg)をマウスに皮下注射します。.ドライアイを避けるために目の軟膏を塗ります。
7. 先のとがったイヤーバーを外耳道に挿入して頭を固定します。
8. イヤーバーのスケールを調整して、頭を中央に配置します。
9. 切歯ホルダーのノーズクランプを締めて、垂直方向の動きを避けます。頭を軽く押して、頭が固定されていることを確認し、その後の手術中に頭が緩まないようにしてください。
10. 綿棒を使用してクロルヘキシジンの3つの交互のスクラブで頭皮を消毒します。各スクラブを中央から外側に向かって開始します(最も消毒された中央領域から最も消毒されていない領域まで)。
    注:中央から外側へのスクラブの使用は、科学者が毛皮からの感染と汚染を最小限に抑えるのに役立ちます。外側の領域は、まだ大量の毛皮があり、徹底的に消毒することは容易ではない、剃っていない頭の領域に近いです。
11. 外科用ブレードを使用して、頭皮を前方/後方(<1 cm)に切開します。切開部を開き、マイクロ解剖鉗子で保持した綿棒で頭蓋骨を拭きます。
    注意: 微小解剖鉗子、手術用ブレード、綿棒は、手術前にオートクレーブ滅菌する必要があります。手術プロセス中、ガラスビーズ滅菌器(150°C)を使用して、各動物の前後に少なくとも5秒間、すべての手術器具を滅菌します。手術中および動物間で手術用ブレードと鉗子を保持するための滅菌ビーカーを準備します。
12. 頭蓋骨のブレグマとラムダを特定します。ブレグマを参照として使用して、関心領域を特定します。
    1. オプション: 定位固定装置用ドリルホルダーに定位固定装置用ドリルを取り付け、ドリルの先端を使用して Bregma を参照としてポイントします。ガラスビーズ滅菌器(150°C)を使用して、脳定位固定装置ドリルを少なくとも5秒間滅菌します。
13. 平らな頭蓋骨の水平面を左/右および前/後面でブレグマ/ラムダで調整および位置合わせします。
    注意: 正しい水平面にない場合は、マウスを定位固定装置に再度取り付けます。

3.商業カスタマイズされたガイドカニューレの移植

1. 脳定位固定装置座標に基づいて、右側脳室の位置を特定してラベル付けします:ブレグマまでの距離、前部/後部(A / P):0.26 mm、内側/外側(M / L):-1.0 mm、背側/腹側(D / V):-2.0 mm²⁰。
   注: 座標は、関心領域に基づいて変更できます。側脳室の座標は、体重範囲が26〜30gの成体C57BL/6Jマウスに基づいていた。若いマウスを使用する場合は、ディスカッションを参照してください。
2. 市販のガイドカニューレを移植するための定位固定装置ドリルを使用して、ラベル付けされた部位の頭蓋骨に穴(直径= 1.5 mm)を開けます。
3. ステンレス鋼ネジを取り付けるための定位固定装置ドリルを使用して、頭蓋骨にさらに2〜4つの穴(直径= 1.5 mm)を開けます。
   注:ガラスビーズ滅菌器(150°C)を使用して、各動物の前後に少なくとも5秒間、脳定位固定装置ドリルを滅菌します。
4. 骨くずを拭き、綿棒で出血を止めます。
5. 局所麻酔薬、鎮痒薬、および鎮痛効果のために綿棒を使用してリドカイン(1 mg / kg)で頭蓋骨を拭きます。穴を開けても出血が止まらない場合は、止血のために綿棒を穴にそっと置きます。
6. 穴に2〜4本のステンレスネジを取り付けて、歯科用アクリル用のアンカーを提供します。
7. 市販のガイドカニューレを固定装置用カニューレホルダーに置き、ガラスビーズ滅菌器(150°C)で消毒します。
   注意: 市販のガイドカニューレ、市販のダミー、および市販のインジェクター(図2A)は、 材料の表に示されている仕様でカスタマイズされました。
8. 定位固定装置カニューレホルダーを側脳室用に開けられた穴に移動し、市販のガイドカニューレを希望の深さ(2.5 mm)までゆっくりと穴に挿入します。
   注:背側/腹側の座標は、先端が穴にかろうじて挿入されている場合、市販のガイドカニューレの先端を基準として設定することで定義できます。
9. 10μLのn-ブチルシアノアクリレート接着剤(組織接着剤接着剤)を塗布して、市販のガイドカニューレをドリル穴に固定し、3〜4分間待ちます。市販のガイドカニューレを定位固定装置カニューレホルダーからそっと外し、ホルダーを遠ざけます。
10. 切開した頭皮に歯科用アクリルを塗布して市販のガイドカニューレを固定し、少なくとも5分間待ちます。市販のダミーを市販のガイドカニューレに埋め込んで、血液や体液によるカニューレの詰まりを防ぎます(図2B)。
11. イヤーバーを外耳道から外し、マウスを脳定位固定装置フレームから取り外します。
12. 麻酔からの回復のために、下に加熱パッドがある新しいケージにマウスを置き、マウスが完全に目覚めるまで観察し続けます。
    注意: 胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。手術を受けた動物は、完全に回復するまで他の動物の会社に戻ってはいけません。
13. 施設のIACUCプロトコルと実験デザインに応じて、マウスをシングルハウジングまたはグループハウジングに戻します。グループハウジングの場合は、不要な怪我やカニューレの剥離を最小限に抑えるために、ケージに収容されるマウスの数を減らしてください。
14. イブプロフェン(0.2 mg / mL)を飲料水に少なくとも3日間投与し、少なくとも3日間、痛みや苦痛の兆候がないか1日2回監視します。.
    1. 術後のケア中に、マウスの炎症や感染を防ぐために、皮膚の周りにロキシスロマイシン軟膏を塗布します。
    2. 動物の状態を監視し続け、十分なエネルギーを提供するために5%グルコースおよび/または0.9%塩化ナトリウムのタイムリーな腹腔内注射を行います。
    3. 疼痛、苦痛、または感染の状態が着実に悪化する場合は、_CO2 吸入によりマウスを安楽死させる。
15. マウスがSCFAの脳室内送達と行動検査の準備が整うまで、手術後1週間待ちます。

4. SCFAの準備

1. 酢酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウムを人工脳脊髄液(ACSF)に溶解します( 材料表を参照)。
2. 化学薬品が完全に溶解していることを確認してから、pHを7.4に調整し、SCFA混合物を0.22μmフィルターでろ過して滅菌します。

5.行動テスト中にSCFAの脳室内送達のための注入システムを設定します

1. 天井カメラを取り付けて、動作を記録します。カメラをコンピュータに接続して、ビデオ録画ソフトウェアを制御します(図3)。
2. 10 μLシリンジに蒸留水を入れます。
   注意: マイクロリットルシリンジ内の気泡を避けてください。
3. マイクロインジェクションポンプをマイクロインジェクションコントローラーに接続します。
4. マイクロリットルシリンジをマイクロインジェクションポンプに取り付けます。シリンジを取り付けるには、ボタンを押してclを緩めますamp シリンジを対応する位置に取り付けます。クランプを閉じ、マイクロインジェクションポンプのプランジャー保持ネジを締めます(図4A)。
5. 市販のインジェクターをポリエチレンチューブに挿入します(図2A)。
6. ポリエチレンチューブをテストアリーナの上の天井カメラに掛けます。
7. インスリン注射器を使用してポリエチレンチューブに蒸留水を入れます。マイクロリットルシリンジを吊り下げポリエチレンチューブに接続します。
   注意: ポリエチレンチューブが、マウスがテストアリーナ内を自由に動くのに十分な長さであることを確認してください。

6. マイクロインジェクションコントローラのシステム設定

1. マイクロインジェクションコントローラの電源を入れ、[すべてのチャンネルを表示]を押してコマンド画面にアクセスします(図4C)。[構成]を押して、ボリュームターゲットを9,800 nL、配信速度を100 nL / sに設定します。マイクロリットルシリンジに接続されたポリエチレンチューブから9,800 nLの蒸留水を注入します(方向を押して注入モードに切り替え、実行を押します)(図4Cのコマンド画面の赤い四角を参照)。
2. [構成]を押し、ボリュームターゲットを3,000 nL、配信速度を100 nL/sに設定します。3,000 nLの鉱油を引き出します(方向を押して撤回モードに切り替え、実行を押します)(図4Cのコマンド画面の赤い四角を参照)。
   注意: ポリエチレンチューブで明確な油水相分離を観察する必要があります。
3. ポリエチレンチューブをマイクロリットルシリンジ針から分解します。マイクロリットルのシリンジ針から3,000nLの蒸留水を吐き出します( 方向 を押して インフューズ モードに切り替え、 実行を押します)。
4. マイクロリットルシリンジをポリエチレンチューブに戻します。[構成]を押し、ボリュームターゲットを9,500 nL、配信速度を100 nL/sに設定します。9,500 nLのSCFAを引き出します(方向を押して撤回モードに切り替え、実行を押します)。オイル-SCFA相にラベルを付けて、SCFAが正常に注入されたかどうかを検証します。
5. [構成]を押して、配信レートで目的のボリュームターゲットを7 nL / sに設定します。方向を押して、注入モードに切り替えます(図4Cのコマンド画面の赤い四角を参照)。
   注:注入時間に基づいて容量を決定します。例えば、送達速度が7 nL/sに対して注入時間が3分の場合、目標容量=1,260nLとなります。
6. RUNを押して、市販のインジェクターの前端に液体が出るまでマイクロリットルのシリンジを前方に注入してから、SCFA注射用のカニューレにインジェクターを挿入します。

7.自由に動くマウスの市販ガイドカニューレを介した側脳室へのSCFAの注入

1. マウスを酸素中の1%〜5%イソフルランを含むプレキシグラスケージに入れて麻酔します。
   注意: マウスを注意深く観察して、呼吸数が毎秒約1回の呼吸に維持されていることを確認します。
2. マウスを首筋にし、市販のインジェクターを市販のガイドカニューレに挿入します(図4B)。
   注意: 市販のガイドカニューレが血液や体液で詰まっている場合は、ピンセットでそっと詰まりを取り除きます。
3. 行動テストの前に、ケージ内でマウスが麻酔から15分間回復するのを待ちます。
4. 基本的な移動テストでは、マウスを新しいケージに入れ、35分間自由に探索できるようにします。最初の5分間で、ターゲットボリューム2,100 nLに対して7 nL/sの送達速度を使用してSCFAを注入します(方向を押して注入モードにし、実行を押します)。
   注:新規ケージ内の移動運動は、動物行動ビデオ追跡ソフトウェア^21、22を用いて分析することができる。
5. マウスを麻酔し(ステップ7.1を繰り返し)、市販のインジェクターを市販のガイドカニューレから取り外します。
   注:マウスは、前の注射を洗い流すために適切な時間を与えた後、異なるコントロール/代謝物を繰り返し注射することができます。カニューレがマウスヘッドに固定されている限り、マウスは異なる代謝物で繰り返し試験することができる。

8.マイクロインジェクションシステムの復元

1. ポリエチレンチューブをマイクロリットルシリンジから分解します。
2. インスリン注射器を使用してチューブに空気を注入し、ポリエチレンチューブ内の蒸留水を廃棄します。マイクロリットルシリンジを空にします。
3. 設定画面でPosのリセットを押して、シリンジ停止定義画面を開きます(図4C)。
4. ビープ音が鳴るまで Withdraw を押して、マイクロインジェクションポンプを完全に引き出した位置にリセットします(図4C)。
5. コマンド画面に戻り、この画面に**END REACH**記号がある場合は、マイクロインジェクションコントローラーをオフにします(図4C)。

9.オプション:神経トレーサーによる脳室内注射の検証

1. 2,100 nLのニューラルトレーサーに7 nL/sの送達速度で注入し、注入部位を確認します。
   注意: 逆流を防ぐために、インジェクターをガイドカニューレに5分間置いたままにします。
2. 神経トレーサーの注入の30分後に、イソフルラン(5%)の過剰投与によってマウスを麻酔する。
3. 麻酔をかけたマウスの呼吸数と尾/足のピンチ反射を確認します。
   メモ: 次の手順の前に、マウスが応答しないようにする必要があります。
4. 胸郭の下の皮膚、筋肉、腹壁を通して4〜5 cmの切開を行います。
5. 肝臓を横隔膜から慎重に少し離します。
6. 横隔膜を切開してマウスの心臓を露出させます。
7. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)と氷冷した4%パラホルムアルデヒドをPBSで心臓に浸透させます。
8. マウスを断頭し、微小解剖鉗子と微小解剖ハサミで脳を注意深く解剖して脳全体を取り出します²³。脳サンプルを氷冷した4%パラホルムアルデヒドのPBSに3〜4日間入れ、PBSで3 x 5分間洗浄します。
9. マウス脳スライスホルダーの8番目のカット(1 mm /セクション)で、マウス脳スライスホルダーで脳を前方から後方向に2つの部分に切断します。脳を埋め込み型に入れ、脳サンプルを低融点アガロース(PBS溶液4%)に埋め込みます。
10. アガロースに埋め込まれた脳を瞬間接着剤を使用してビブラトームのステージに接着します。ビブラトームを使用して脳を冠状に50μmの脳スライスに切断します。
11. ブロッキングバッファー(1:1,000希釈)で希釈したニューラルトレーサーを標的とする抗体の脳スライスを室温で一晩インキュベートします。
    注:ブロッキングバッファーには、10%の馬血清、0.1%のTriton X-100、および0.02%のアジ化ナトリウムが含まれていました。
12. スライスをPBST(0.1%トリトンX-100を含むPBS)で3 x 5分洗浄します。
13. ブロッキングバッファー(1:500希釈)で希釈した蛍光色素結合二次抗体で脳スライスを室温で2時間インキュベートします。
14. スライスをPBSで3 x 5分洗浄します。
15. 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含む封入剤を使用して、スライド上の脳スライスをマウントします。
16. スライドを顕微鏡カバーガラスで覆います。
17. スライドの端にマニキュアを塗り、封入剤の漏れを防ぎます。
18. 室温で一晩インキュベートした後、光から保護し、蛍光顕微鏡を用いて注入部位の蛍光シグナルを画像化する。

10.オプション:マウスの側脳室にあるカスタマイズされたステンレス鋼ガイドカニューレを介した代謝物の注入

1. プロトコルセクション1〜8に従い、市販のガイドカニューレをステンレス鋼のガイドカニューレに交換して、マウスのステンレス鋼のインジェクターを介して化学物質を注入します。
   注:さまざまな市販およびステンレス鋼のカニューレの長所と短所については、ディスカッションセクションで詳しく説明します。
2. 市販のガイドカニューレをステンレス鋼のガイドカニューレに交換することを忘れないでください(図5B)。
   注意: ステンレス鋼のガイドカニューレ、ステンレス鋼のダミー、およびステンレス鋼のインジェクター(図5A)は、 材料の表に示されている仕様でカスタマイズされました。カスタマイズされたステンレス鋼ガイドカニューレを希望の深さ(2.0 mm)まで穴に挿入します。
3. マイクロインジェクションコントローラーとマイクロインジェクションポンプ(図4B)で構成されるマイクロインジェクションシステムを使用して、ステンレス鋼ガイドカニューレを介してSCFAを注入します(プロトコルセクション4〜7と同じ)。ステンレス鋼ガイドカニューレのステンレス鋼ダミーの場合、反対側の先端がステンレス鋼ガイドカニューレより1mm長くなるまで、ステンレス鋼インジェクターの片側をそっと曲げます。
4. 2,100 nLのニューラルトレーサーをステンレス鋼ガイドカニューレを通してマウスの側脳室に注入します(プロトコルセクション9と同じ)。
5. 神経トレーサー注入後30分間サンプルを収集します(プロトコルセクション9と同じ)。
6. ニューラルトレーサー注入脳スライスで画像取得を実行します(プロトコルセクション9と同じ)。

結果

ガイドカニューレ移植からの回復から1週間後にマウスにSCFAを注入し、新規ケージ内の自発運動を評価した。マウスを新しいケージに入れ、最初の5分間で2,100 nLのSCFAまたはACSFを注入しました(送達速度7 nL / s)脳の側脳室に埋め込まれた市販のガイドカニューレを介して脳に注入します。新規ケージ内の自発運動は、注入後さらに30分間記録されました。.SCFAsとACSFの注入では、新規ケージ内の?...

ディスカッション

腸由来の代謝産物は、体内での複数の結合部位のために、あまり正確なメカニズムなしに脳介在性疾患と関連しています^6,12,24。以前の報告では、SCFAがGタンパク質共役型受容体、エピジェネティック調節因子、および体内の複数の部位でのエネルギー生産の源のリガンドとして機能する可能性があることが示されました

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41	Pfizer	n/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit	ThermoFisher Scientific	A-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal)	Millipore	AB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Sterile	NEST	121921LA01
CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016	ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2%	Phoenix	NDC 57319-611-09
Chlorhexidine solution	Phoenix	NDC 57319-599-09
Commercial dummy	RWD Life Science	62004	Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannul	RWD Life Science	62104	Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm
Commercial injector	RWD Life Science	62204	Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylic	HYGENIC	n/a
Fixing screws	RWD Life Science	62521
Fluoroshield mounting medium with DAPI	Abcam	AB104139
Horse serum	ThermoFisher Scientific	16050130
Insulin syringes	BBraun	XG-LBB-9151133S-1BX	1 mL
Isoflurane	Panion & BF biotech	DG-4900-250D
KCl	Sigma-Aldrich	P3911	ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen	Swiss Pharmaceutical	n/a
Lidocaine	AstraZeneca	n/a
Low melting point agarose	Invitrogen	16520
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slips	MARIENFELD	101242
Microscope slides	ThermoFisher Scientific	4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NF	Macron Fine Chemicals	MA-6358-04
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282	ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue)	3M	1469SB	3M Vetbond
Neural tracer	Santa Cruz	SC-358883	FluoroGold
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Polyethylene tube	RWD Life Science	62329	OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) Ointment	Dechra	12920060
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889	SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium butyrate	Sigma-Aldrich	B5887	SCFAs: 8 mM
Sodium propionate	Sigma-Aldrich	P1880	SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannula	Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD.	n/a	OD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injector	Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD.	n/a	OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
Superglue	Krazy Glue	KG94548R
Triton X-100	Merck	1.08603.1000
Equipment
Cannula holder	RWD Life Science	B485-68217
Ceiling camera	FOSCAM	R2
Digital stereotaxic instruments	Stoelting	51730D
Dissecting microscope	INNOVIEW	SEM-HT/TW
Glass Bead Sterilizer	RWD Life Science	RS1501
Heating pad	Stoelting	53800M
Leica microscope	Leica	DM2500
Micro Dissecting Forceps	ROBOZ	RS-5136	Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length
Micro Dissecting Scissors	ROBOZ	RS-5918	4.5" Angled Sharp
Microinjection controller	World Precision Instruments (WPI)	MICRO2T	SMARTouch Controller
Microinjection syringe pump	World Precision Instruments (WPI)	UMP3T-1	UltraMicroPump3
Microliter syringe	Hamilton	80014	10 µL
Optical Fiber Cold Light with double Fiber	Step	LGY-150	Local vendor
Pet trimmer	WAHL	09962-2018
Vaporiser for Isoflurane	Step	AS-01	Local vendor
Vibratome	Leica	VT1000S
Software
Animal behavior video tracking software	Noldus	EthoVision	Version: 15.0.1416
Leica Application Suite X software	Leica	LASX	Version: 3.7.2.22383