JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Микробные метаболиты, полученные из кишечника, имеют многогранные эффекты, приводящие к сложному поведению у животных. Мы стремимся предоставить пошаговый метод для очерчивания эффектов микробных метаболитов, полученных из кишечника, в мозге через внутрицеребровентрикулярную доставку через направляющую канюлю.

Аннотация

Влияние кишечной микробиоты и их метаболитов на физиологию и поведение хозяина было широко исследовано в этом десятилетии. Многочисленные исследования показали, что метаболиты, полученные из кишечной микробиоты, модулируют физиологические функции, опосредованные мозгом, через сложные пути кишечник-мозг у хозяина. Короткоцепочечные жирные кислоты (SCFA) являются основными метаболитами бактерий, образующимися во время ферментации пищевых волокон микробиомом кишечника. Секретируемые SCFA из кишечника могут действовать в нескольких местах на периферии, влияя на иммунные, эндокринные и нейронные реакции из-за обширного распределения рецепторов SCFA. Поэтому трудно дифференцировать центральные и периферические эффекты SCFA посредством перорального и внутрибрюшинного введения SCFA. В этой статье представлен основанный на видео метод опроса функциональной роли SCFA в мозге с помощью направляющей канюли у свободно движущихся мышей. Количество и тип SCFA в мозге можно регулировать, контролируя объем и скорость инфузии. Этот метод может предоставить ученым способ оценить роль метаболитов, полученных из кишечника, в мозге.

Введение

Желудочно-кишечный тракт человека содержит различные микроорганизмы, воздействующие на хозяина 1,2,3. Эти кишечные бактерии могут секретировать метаболиты, полученные из кишечника, во время использования диетических компонентов, потребляемых хозяином 4,5. Интересно, что метаболиты кишечника, не метаболизируемые на периферии, могут транспортироваться в другие органы посредством циркуляции6. Следует отметить, что эти секретируемые метаболиты могут служить медиаторами для оси кишечник-мозг, определяемой как двунаправленная связь между центральной нервной системой и кишечником7. Предыдущие исследования показали, что метаболиты, полученные из кишечника, могут модулировать сложное поведение и эмоции у животных 8,9,10,11.

Короткоцепочечные жирные кислоты (SCFA) являются основными метаболитами, продуцируемыми кишечной микробиотой во время ферментации пищевых волокон и неперевариваемых углеводов6. Ацетат, пропионат и бутират являются наиболее распространенными SCFA в кишечнике12. SCFA служат источником энергии для клеток желудочно-кишечного тракта. Неметаболизированные SCFA в кишечнике могут транспортироваться в мозг через воротную вену, тем самым модулируя мозг и поведение 6,12. Предыдущие исследования показали, что SCFA могут играть решающую роль в нервно-психических расстройствах 6,12. Например, внутрибрюшинная инъекция бутирата у мышей BTBR T+ Itpr3tf/J (BTBR), животной модели расстройства аутистического спектра (РАС), спасла их социальный дефицит13. Крысы, получавшие антибиотики, получавшие микробиоту от депрессивных субъектов, показали увеличение тревожного поведения и фекальных SCFA14. Клинически изменения в уровнях фекальных SCFAs наблюдались у людей с РАС по сравнению с обычно развивающимися контрольнымигруппами 15,16. Люди с депрессией имеют более низкие уровни ФЕК SCFAs, чем здоровые субъекты17,18. Эти исследования показали, что SCFA могут изменять поведение животных и людей различными путями.

Микробные метаболиты оказывают разнообразное воздействие на несколько участков в организме, влияя на физиологию и поведение хозяина 4,19, включая желудочно-кишечный тракт, блуждающий нерв и симпатический нерв. Трудно точно определить точную роль метаболитов, полученных из кишечника, в головном мозге при введении метаболитов периферическими путями. В этой статье представлен протокол на основе видео для исследования эффектов метаболитов, полученных из кишечника, в мозге свободно движущейся мыши (рисунок 1). Мы показали, что SCFA могут быть остро даны через направляющую канюлю во время поведенческих тестов. Тип, объем и скорость инфузии метаболитов могут быть изменены в зависимости от цели. Место каннулизации может быть скорректировано для изучения влияния метаболитов кишечника на определенную область мозга. Мы стремимся предоставить ученым метод изучения потенциального влияния микробных метаболитов, полученных из кишечника, на мозг и поведение.

протокол

Все экспериментальные протоколы и уход за животными были одобрены Национальным университетом Ченг Кунг (NCKU) Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC).

1. Подготовка к подопытному животному

  1. Приобретите 6-8-недельных самцов мышей C57BL/6JNarl дикого типа у поставщика.
  2. Поместите мышей в стандартную клетку для мышей со стандартным мышиным чау и стерилизованной водой ad libitum.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Жилищные условия для Центра лабораторных животных NCKU составляют 22 ± температурой 1 ° C, 55% ± 10% влажности и циклом 13 ч / 11 ч света / темноты.

2. Стереотаксическая хирургия

  1. Подготовьте и стерилизуйте стереотаксический инструмент, хирургические инструменты и связанные с ними предметы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все предметы, которые будут напрямую контактировать с местом операции, должны быть стерилизованы, чтобы избежать инфекции.
  2. Обезболивают мышь, помещая ее в клетку из оргстекла с 1%-5% изофлурана в кислороде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внимательно наблюдайте за мышью, чтобы убедиться, что частота дыхания поддерживается на уровне около одного вдоха в секунду.
  3. Выньте мышь из анестезиологической камеры. Побрить место операции (голову мыши) триммером для домашних животных. Поместите мышь на стереотаксическую рамку, закрепив резцы мыши на резце в держателе стереотаксического резца. Накройте нос маской с носовым конусом.
  4. Анестезируйте мышь 1%-2,5% изофлурана в кислороде на протяжении всей стереотаксической хирургии. Оцените ноцицепцию мыши с помощью рефлекса защемления пальца ноги и обеспечьте постоянную частоту дыхания перед вырезанием места операции.
  5. Поместите грелку (37,0 °C) под мышь на стереотаксическую рамку для поддержания температуры тела во время операции. В качестве альтернативы можно поддерживать температуру ядра с помощью ректального термозонда, соединяющего программируемый нагреватель и грелку.
  6. Снимите обрезанный мех на голове с помощью скотча. Введите мышам анальгетик Кетопрофен (5 мг/кг) подкожно, чтобы облегчить боль. Нанесите глазную мазь, чтобы избежать сухости глаз.
  7. Вставьте заостренную ушную балку в ушной канал, чтобы зафиксировать голову.
  8. Центрируйте голову, регулируя шкалу ушной балки.
  9. Затяните зажим носа на держателе резца, чтобы избежать вертикального движения. Осторожно надавите на голову, чтобы убедиться, что голова фиксирована, и избежать ослабления головы во время последующей операции.
  10. Продезинфицируйте кожу головы тремя чередующимися скрабами хлоргексидина с помощью ватного тампона. Начинайте каждый скраб с середины к внешней стороне (от наиболее дезинфицированной центральной области до наименее дезинфицируемой области).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование скрабов от середины до внешней стороны может помочь ученым свести к минимуму инфекцию и загрязнение от меха. Внешняя область находится близко к небритой области головы, которая все еще имеет большое количество меха и ее нелегко тщательно дезинфицировать.
  11. Разрезайте кожу головы передним/задним способом (<1 см) с помощью хирургического лезвия. Откройте разрез и протрите череп ватным тампоном, удерживаемым микрорассекающими щипцами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микрорассекающие щипцы, хирургическое лезвие и ватные палочки должны быть стерилизованы путем автоклавирования перед операцией. Во время хирургического процесса стерилизуйте все хирургическое оборудование с помощью стерилизатора из стеклянных шариков (150 °C) в течение не менее 5 с до и после каждого животного. Подготовьте стерилизованный стакан для удержания хирургического лезвия и щипцов во время хирургического процесса и между животными.
  12. Определите Брегму и Лямбду на черепе. Используйте Bregma в качестве ссылки, чтобы найти интересующий регион.
    1. Дополнительно: Установите стереотаксическую дрель на держатель стереотаксического сверла и используйте наконечник сверла, чтобы указать Брегму в качестве ориентира. Стерилизуйте стереотаксическую дрель с помощью стерилизатора стеклянных шариков (150 °C) в течение не менее 5 с.
  13. Откалибруйте и выровняйте горизонтальную плоскость плоского черепа в левой/правой и передней/задней плоскостях с помощью Bregma/Lambda.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если мышь не находится в правильной горизонтальной плоскости, перемонтируйте мышь на стереотаксический инструмент.

3. Коммерческое индивидуальное руководство по имплантации канюли

  1. Определите и обозначьте положение правого бокового желудочка на основе стереотаксических координат: Расстояние до Брегмы, переднее/заднее (A/P): 0,26 мм, медиальное/латеральное (M/L): -1,0 мм, дорсальное/вентральное (D/V): -2,0 мм20.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Координаты могут быть изменены в зависимости от интересующего региона. Координаты бокового желудочка были основаны на взрослых мышах C57BL/6J с диапазоном веса 26-30 г. Если используются более молодые мыши, обратитесь к обсуждению.
  2. Просверлите отверстие (диаметр = 1,5 мм) через череп на маркированном участке с помощью стереотаксического сверла для имплантации коммерческой направляющей канюли.
  3. Просверлите еще два-четыре отверстия (диаметр = 1,5 мм) на черепе с помощью стереотаксического сверла для крепления винтов из нержавеющей стали.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизуйте стереотаксическую дрель с помощью стерилизатора из стеклянных шариков (150 °C) в течение не менее 5 с до и после каждого животного.
  4. Протрите костные обрывки и остановите кровотечение ватным тампоном.
  5. Протрите череп лидокаином (1 мг/кг) ватным тампоном для местного обезболивающего, противозудного и обезболивающего действия. Если кровотечение не останавливается после сверления, аккуратно поместите ватный тампон на отверстие для гемостаза.
  6. Установите от двух до четырех нержавеющих винтов на отверстия, чтобы обеспечить анкеры для зубного акрила.
  7. Поместите канюлю коммерческого гида на держатель стереотаксической канюли и продезинфицируйте стерилизатором из стеклянных шариков (150 °C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческий направляющий канюля, коммерческий манекен и коммерческий инжектор (рисунок 2А) были настроены в соответствии со спецификациями, приведенными в Таблице материалов.
  8. Переместите держатель стереотаксической канюли в отверстие, просверленное для бокового желудочка, и медленно вставьте коммерческую направляющую канюлю в отверстие до нужной глубины (2,5 мм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Координату дорсальной/вентральной артерии можно определить, установив наконечник канюли коммерческого направляющего в качестве эталона, когда наконечник едва вставлен в отверстие.
  9. Нанесите 10 мкл н-бутилцианоакрилатного клея (тканевого адгезивного клея) для фиксации коммерческой направляющей канюли в просверленном отверстии и подождите 3-4 мин. Осторожно отпустите канюлю коммерческого гида от держателя стереотаксической канюли и отодвиньте держатель.
  10. Нанесите зубной акрил на разрезанную кожу головы, чтобы зафиксировать канюлю коммерческого гида, и подождите не менее 5 минут. Имплантируйте коммерческий манекен в канюлю коммерческого гида, чтобы избежать засорения канюли кровью или жидкостью организма (рисунок 2B).
  11. Отпустите ушную перекладину от ушного канала и извлеките мышь из стереотаксической рамки.
  12. Поместите мышь в новую клетку с грелкой под ней для восстановления после анестезии и непрерывно наблюдайте, пока мышь полностью не проснется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в достаточное сознание для поддержания грудинного покоя. Животное, перенесшее операцию, не должно возвращаться в компанию других животных до полного выздоровления.
  13. Верните мышь в одиночное или групповое жилье, в зависимости от институционального протокола IACUC и экспериментальной конструкции. Для группового жилья убедитесь, что меньше мышей размещено в клетке, чтобы свести к минимуму нежелательные травмы или отслоение канюли.
  14. Вводите ибупрофен (0,2 мг / мл) в питьевую воду в течение не менее 3 дней для послеоперационного ухода и контролируйте два раза в день признаки боли и дистресса в течение не менее 3 дней.
    1. Во время послеоперационного ухода наносите рокситромициновую мазь вокруг кожи, чтобы предотвратить воспаление и инфекцию у мышей.
    2. Продолжайте следить за состоянием животного и своевременно вводите внутрибрюшинную инъекцию 5% глюкозы и / или 0,9% хлорида натрия, чтобы обеспечить достаточное количество энергии.
    3. Если состояние боли, дистресса или инфекции неуклонно ухудшается, усыплите мышь путем вдыхания CO2 .
  15. Подождите 1 неделю после операции, чтобы мышь была готова к внутрицеребровентрикулярной доставке SCFA и поведенческому тестированию.

4. Подготовка SCFA

  1. Растворите ацетат натрия, бутират натрия и пропионат натрия в искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) (см. Таблицу материалов).
  2. Убедитесь, что химические вещества полностью растворены, затем отрегулируйте рН до 7,4 и отфильтруйте смесь SCFA через фильтр 0,22 мкм для стерилизации.

5. Настройка инфузионной системы для внутрицеребровентрикулярной доставки SCFA во время поведенческого тестирования

  1. Установите потолочную камеру для записи поведения. Подключите камеру к компьютеру для управления программным обеспечением для записи видео (рисунок 3).
  2. Наполните шприц объемом 10 мкл дистиллированной водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте пузырьков воздуха в микролитровом шприце.
  3. Подключите микроинъекционный насос к контроллеру микроинъекции.
  4. Установите микролитровый шприц на микроинъекционный насос. Чтобы установить шприц, нажмите кнопку, чтобы ослабить зажим и установить шприц в соответствующее положение. Закройте зажим и затяните плунжерно-удерживающий винт на микроинжекционном насосе (рисунок 4А).
  5. Вставьте коммерческий инжектор в полиэтиленовую трубку (рисунок 2А).
  6. Повесьте полиэтиленовую трубку на потолочную камеру над испытательной ареной.
  7. Наполните полиэтиленовую трубку дистиллированной водой с помощью инсулинового шприца. Подключите микролитровый шприц к подвесной полиэтиленовой трубке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что полиэтиленовая трубка достаточно длинна, чтобы мышь могла свободно перемещаться по всей арене тестирования.

6. Системные настройки контроллера микроинъекции

  1. Включите контроллер микроинъекции и нажмите Display All Channels для доступа к экрану Command (рисунок 4C). Нажмите Конфигурация и установите для параметра Volume Target значение 9 800 нЛ со скоростью доставки 100 нЛ/с. Влить 9 800 нл дистиллированной воды из полиэтиленовой трубки, подключенной к микролитровому шприцу (нажмите Направление, чтобы переключиться в режим infuse и нажать RUN) (см. красные квадраты на экране Команды на рисунке 4C).
  2. Нажмите Конфигурация и установите для параметра Volume Target значение 3 000 нЛ со скоростью доставки 100 нЛ/с. Извлеките 3 000 нл минерального масла (нажмите Direction, чтобы переключиться в режим Вывода и нажмите RUN) (см. красные квадраты на экране Command на рисунке 4C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: На полиэтиленовой трубке должно наблюдаться четкое разделение фаз масла и воды.
  3. Разберите полиэтиленовую трубку из микролитровой шприцевой иглы. Выплюньте 3000 нл дистиллированной воды из микролитровой шприцевой иглы (нажмите Направление , чтобы переключиться в режим infuse и нажмите RUN).
  4. Вставьте микролитровый шприц обратно в полиэтиленовую трубку. Нажмите Конфигурация и установите для параметра Volume Target значение 9 500 nL со скоростью доставки 100 nL/s. Вывести 9 500 нЛ SCFA (нажмите Направление, чтобы переключиться в режим Вывода, и нажмите RUN). Обозначьте фазу масляных SCFA, чтобы проверить, успешно ли введены SCFA.
  5. Нажмите Конфигурация и установите требуемый целевой том со скоростью доставки 7 нл/с. Нажмите Направление, чтобы переключиться в режим Infuse (см. красные квадраты на экране Команды на рисунке 4C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Определите объем на основе времени инфузии. Например, если время инфузии составляет 3 мин при скорости доставки 7 нл/с, целевой объем = 1 260 нЛ.
  6. Нажмите RUN , чтобы влить шприц микролитра вперед, пока жидкость не выйдет на переднем конце коммерческого инжектора перед введением инжектора в канюлю для инъекции SCFA.

7. Вливание SCFA в боковой желудочек через канюлю коммерческого гида в свободно движущейся мыши

  1. Обезболивают мышь, помещая ее в клетку из оргстекла с 1%-5% изофлурана в кислороде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внимательно наблюдайте за мышью, чтобы убедиться, что частота дыхания поддерживается на уровне около одного вдоха в секунду.
  2. Подержите мышь и вставьте коммерческий инжектор в канюлю коммерческого гида (рисунок 4B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если канюля коммерческого гида закупорена кровью или жидкостью организма, аккуратно очистите ее пинцетом.
  3. Дайте мыши восстановиться после анестезии в течение 15 минут в клетке перед поведенческим тестированием.
  4. Для базового теста на передвижение поместите мышь в новую клетку и дайте ей свободно исследовать в течение 35 минут. Вливайте SCFA, используя скорость доставки 7 нл/с для целевого объема 2 100 нЛ в первые 5 мин (нажмите Направление в режим infuse и нажмите RUN).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Локомоция в новой клетке может быть проанализирована с помощью программного обеспечения для видеослежения поведения животных21,22.
  5. Обезболить мышь (повторяя шаг 7.1) и удалить коммерческий инжектор из коммерческой направляющей канюли.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мышам можно многократно вводить различные контрольные элементы/метаболиты после предоставления соответствующего периода времени для промывания предыдущей инъекции. До тех пор, пока канюля закреплена на голове мыши, мышь может быть многократно протестирована с различными метаболитами.

8. Восстановление системы микроинъекций

  1. Разберите полиэтиленовую трубку из микролитрового шприца.
  2. Впрыскивайте воздух в трубку с помощью инсулинового шприца, чтобы выбросить дистиллированную воду в полиэтиленовую трубку. Опорожните микролитровый шприц.
  3. Нажмите Reset Pos на экране Конфигурация , чтобы открыть экран Определение остановки шприца (рисунок 4C).
  4. Нажимайте «Вынимать » до тех пор, пока не раздастся звуковой сигнал, чтобы сбросить микроинжекционный насос в полностью снятое положение (рисунок 4C).
  5. Вернитесь на экран Command и выключите контроллер микроинъекции, если на этом экране есть знак **END REACHED** (рисунок 4C).

9. Необязательно: Валидация интрацеребровентрикулярной инъекции нейронным индикатором

  1. Вливайте 2 100 нЛ нейронного индикатора со скоростью доставки 7 нЛ/с для проверки места инфузии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте инжектор в направляющей канюле на 5 минут, чтобы предотвратить обратный поток.
  2. Обезболивают мышь передозировкой изофлурана (5%) через 30 мин после инфузии нейротрейзера.
  3. Проверьте частоту дыхания и рефлекс защемления хвоста / лапы у анестезируемой мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши не должны отвечать на следующий шаг.
  4. Сделайте разрез 4-5 см через кожу, мышцы и брюшную стенку ниже грудной клетки.
  5. Осторожно слегка отодвиньте печень от диафрагмы.
  6. Разрезайте диафрагму, чтобы обнажить сердце мыши.
  7. Перфьюзируйте мышь через сердце фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) и ледяным 4% параформальдегидом в PBS.
  8. Обезглавите мышь и тщательно рассекните мозг с помощью микрорассекающих щипцов и микрорассекающих ножниц, чтобы удалить весь мозг23. Поместите образцы мозга в ледяной 4% параформальдегид в PBS на 3-4 дня и промыть их 3 х 5 мин PBS.
  9. Разрежьте мозг на две части в держателе среза мозга мыши на восьмом срезе держателя среза мозга мыши (1 мм / секция) от переднего до заднего направления. Поместите мозг во встраиваемую форму и встройте образцы мозга в агарозу с низкой температурой плавления (4% в PBS).
  10. Приклейте мозг, встроенный в агарозу, на стадию вибратома с помощью суперклея. Разделите мозг коронально на 50 мкм срезов мозга с помощью вибратома.
  11. Инкубируйте срезы мозга в антителе, нацеленное на нейронный индикатор, разбавленный в блокирующем буфере (разбавление 1: 1000) в течение ночи при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Блокирующий буфер содержал 10% лошадиной сыворотки, 0,1% тритона X-100 и 0,02% азида натрия.
  12. Ломтики промыть 3 х 5 мин ПБСТ (ПБС с 0,1% тритоном Х-100).
  13. Инкубируют срезы мозга в флуоресцентно-красителе конъюгированном вторичном антителе, разведенном в блокирующем буфере (разведение 1:500) в течение 2 ч при комнатной температуре.
  14. Вымойте ломтики 3 х 5 мин с PBS.
  15. Установите срезы мозга на слайд с монтажной средой, содержащей 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI).
  16. Накройте слайд крышкой микроскопа.
  17. Нанесите лак для ногтей на край скольжения, чтобы избежать утечки монтажной среды.
  18. После ночной инкубации при комнатной температуре, защищенной от света, визуализируйте флуоресцентный сигнал в месте инфузии с помощью флуоресцентного микроскопа.

10. Опционально: Инфузия метаболитов через специальную направляющую канюлю из нержавеющей стали в боковом желудочке у мышей

  1. Следуйте разделам протокола 1-8 и замените коммерческую направляющую канюлю направляющей канюлей из нержавеющей стали, чтобы вливать химические вещества через инжектор из нержавеющей стали в мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плюсы и минусы различных коммерческих канюль и канюль из нержавеющей стали подробно рассматриваются в разделе обсуждения.
  2. Выполняйте хирургический протокол так же, как описано в разделах протокола 2 и 3, за исключением замены коммерческой направляющей канюли направляющей канюлей из нержавеющей стали (рисунок 5B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Направляющая канюля из нержавеющей стали, манекен из нержавеющей стали и инжектор из нержавеющей стали (рисунок 5A) были настроены в соответствии со спецификациями, указанными в Таблице материалов. Вставьте индивидуальную направляющую канюлю из нержавеющей стали в отверстие до желаемой глубины (2,0 мм).
  3. Вливать SCFA через направляющую канюлю из нержавеющей стали с помощью системы микроинъекции, состоящей из контроллера микроинъекции и микроинъекционного насоса (рисунок 4B) (аналогично разделам протокола 4-7). Для манекена из нержавеющей стали направляющей канюли из нержавеющей стали осторожно согните одну сторону инжектора из нержавеющей стали, пока наконечник другой стороны не станет на 1 мм длиннее, чем направляющая канюля из нержавеющей стали.
  4. Вливайте 2 100 нЛ нейронного индикатора через направляющую канюлю из нержавеющей стали в боковой желудочек у мышей (то же самое, что и раздел протокола 9).
  5. Соберите образец в течение 30 минут после инфузии нейронного индикатора (аналогично протоколу раздела 9).
  6. Выполняйте получение изображений в нейронных индикаторных срезах мозга (то же самое, что и в разделе протокола 9).

Результаты

Мыше вводили SCFA через 1 неделю после восстановления после имплантации направляющей канюли для оценки двигательной активности в новой клетке. Мышь помещали в новую клетку и вводили 2 100 нЛ SCFA или ACSF в течение первых 5 минут (скорость доставки 7 нл/с) в мозг через коммерческую направляющую к?...

Обсуждение

Метаболиты, полученные из кишечника, были связаны с заболеваниями, опосредованными мозгом, без особого точного механизма, частично из-за их множественных сайтов связывания в организме 6,12,24. В предыдущих отчетах указывалось, что SCFA могу...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, связанного с данной работой.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников Центра лабораторных животных в Национальном университете Ченг Кунг (NCKU) за уход за животными. Эта работа была поддержана стипендией Образовательного фонда профессора Кун-Йен Хуана Медицинского фонда CHENG-HSING для C.-W.L.; средства Министерства науки и технологий (MOST) Тайваня: (Undergraduate Research MOST 109-2813-C-006-095-B) до T.-H.Y.; (МОСТ 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) на W.-L.W.; и проект «Ростки высшего образования», Министерство образования, при Штаб-квартире по развитию университетов в НККУ в W.-L.W.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41Pfizern/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbitThermoFisher ScientificA-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal)MilliporeAB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, SterileNEST121921LA01
CaCl2 Sigma-AldrichC1016ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2%PhoenixNDC 57319-611-09
Chlorhexidine solutionPhoenixNDC 57319-599-09
Commercial dummyRWD Life Science62004Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannulRWD Life Science62104Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injectorRWD Life Science62204Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylicHYGENICn/a
Fixing screwsRWD Life Science62521
Fluoroshield mounting medium with DAPIAbcamAB104139
Horse serumThermoFisher Scientific16050130
Insulin syringesBBraunXG-LBB-9151133S-1BX1 mL
Isoflurane Panion & BF biotechDG-4900-250D
KCl Sigma-AldrichP3911ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen Swiss Pharmaceuticaln/a
Lidocaine AstraZenecan/a
Low melting point agaroseInvitrogen16520
MgCl2 Sigma-AldrichM8266ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slipsMARIENFELD101242
Microscope slidesThermoFisher Scientific4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NFMacron Fine ChemicalsMA-6358-04
NaCl Sigma-AldrichS9888ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4 Sigma-AldrichS8282ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3 Sigma-AldrichS5761ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue)3M1469SB3M Vetbond
Neural tracer Santa CruzSC-358883FluoroGold
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Polyethylene tubeRWD Life Science62329OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) OintmentDechra 12920060
Sodium acetate Sigma-AldrichS2889SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide Sigma-AldrichS2002
Sodium butyrate Sigma-AldrichB5887SCFAs: 8 mM
Sodium propionate Sigma-AldrichP1880SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannulaChun Ta stainless steel enterprise CO., LTD.n/aOD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injectorChun Ta stainless steel enterprise CO., LTD.n/aOD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
SuperglueKrazy GlueKG94548R
Triton X-100Merck1.08603.1000
Equipment
Cannula holderRWD Life ScienceB485-68217
Ceiling cameraFOSCAMR2
Digital stereotaxic instrumentsStoelting51730D
Dissecting microscopeINNOVIEWSEM-HT/TW
Glass Bead SterilizerRWD Life ScienceRS1501
Heating padStoelting53800M
Leica microscope LeicaDM2500
Micro Dissecting ForcepsROBOZRS-5136Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting ScissorsROBOZRS-59184.5" Angled Sharp
Microinjection controllerWorld Precision Instruments (WPI)MICRO2TSMARTouch Controller
Microinjection syringe pumpWorld Precision Instruments (WPI)UMP3T-1UltraMicroPump3  
Microliter syringeHamilton8001410 µL
Optical Fiber Cold Light with double FiberStepLGY-150Local vendor
Pet trimmerWAHL09962-2018
Vaporiser for IsofluraneStepAS-01Local vendor
VibratomeLeicaVT1000S
Software
Animal behavior video tracking softwareNoldusEthoVisionVersion: 15.0.1416
Leica Application Suite X softwareLeicaLASXVersion: 3.7.2.22383

Ссылки

  1. Lynch, J. B., Hsiao, E. Y. Microbiomes as sources of emergent host phenotypes. Science. 365 (6460), 1405-1409 (2019).
  2. Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome-gut-brain axis in health and disease. Gastroenterology Clinics of North America. 46 (1), 77-89 (2017).
  3. Sharon, G., Sampson, T. R., Geschwind, D. H., Mazmanian, S. K. The central nervous system and the gut microbiome. Cell. 167 (4), 915-932 (2016).
  4. Krautkramer, K. A., Fan, J., Backhed, F. Gut microbial metabolites as multi-kingdom intermediates. Nature Reviews: Microbiology. 19 (2), 77-94 (2021).
  5. Lavelle, A., Sokol, H. Gut microbiota-derived metabolites as key actors in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 223-237 (2020).
  6. Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. The role of short-chain fatty acids in microbiota-gut-brain communication. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 16 (8), 461-478 (2019).
  7. Morais, L. H., Schreiber, H. L. T., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews: Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  8. Sharon, G., et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).
  9. St Laurent, R., O'Brien, L. M., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
  10. Govindarajan, N., Agis-Balboa, R. C., Walter, J., Sananbenesi, F., Fischer, A. Sodium butyrate improves memory function in an Alzheimer's disease mouse model when administered at an advanced stage of disease progression. Journal of Alzheimer's Disease. 26 (1), 187-197 (2011).
  11. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  12. Silva, Y. P., Bernardi, A., Frozza, R. L. The role of short-chain fatty acids from gut microbiota in gut-brain communication. Frontiers in Endocrinology. 11, 25 (2020).
  13. Kratsman, N., Getselter, D., Elliott, E. Sodium butyrate attenuates social behavior deficits and modifies the transcription of inhibitory/excitatory genes in the frontal cortex of an autism model. Neuropharmacology. 102, 136-145 (2016).
  14. Kelly, J. R., et al. Transferring the blues: Depression-associated gut microbiota induces neurobehavioural changes in the rat. Journal of Psychiatric Research. 82, 109-118 (2016).
  15. Wang, L., et al. Elevated fecal short chain fatty acid and ammonia concentrations in children with autism spectrum disorder. Digestive Diseases and Sciences. 57 (8), 2096-2102 (2012).
  16. Adams, J. B., Johansen, L. J., Powell, L. D., Quig, D., Rubin, R. A. Gastrointestinal flora and gastrointestinal status in children with autism--comparisons to typical children and correlation with autism severity. BMC Gastroenterology. 11, 22 (2011).
  17. Skonieczna-Zydecka, K., et al. Faecal short chain fatty acids profile is changed in Polish depressive women. Nutrients. 10 (12), 1939 (2018).
  18. Szczesniak, O., Hestad, K. A., Hanssen, J. F., Rudi, K. Isovaleric acid in stool correlates with human depression. Nutritional Neuroscience. 19 (7), 279-283 (2016).
  19. Martin, A. M., Sun, E. W., Rogers, G. B., Keating, D. J. The influence of the gut microbiome on host metabolism through the regulation of gut hormone release. Frontiers in Physiology. 10, 428 (2019).
  20. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . Paxinos and Franklin's The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).
  21. York, J. M., Blevins, N. A., McNeil, L. K., Freund, G. G. Mouse short- and long-term locomotor activity analyzed by video tracking software. Journal of Visualized Experiments. (76), e50252 (2013).
  22. Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice. Journal of Visualized Experiments. (164), e61023 (2020).
  23. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments. (168), e61941 (2021).
  24. Needham, B. D., Kaddurah-Daouk, R., Mazmanian, S. K. Gut microbial molecules in behavioural and neurodegenerative conditions. Nature Reviews: Neuroscience. 21 (12), 717-731 (2020).
  25. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
  26. Xiaoguang, W., et al. Establishment of a valuable mimic of Alzheimer's disease in rat animal model by intracerebroventricular injection of composited amyloid beta protein. Journal of Visualized Experiments. (137), e56157 (2018).
  27. Venniro, M., Shaham, Y. An operant social self-administration and choice model in rats. Nature Protocols. 15 (4), 1542-1559 (2020).
  28. Ucal, M., et al. Rat model of widespread cerebral cortical demyelination induced by an intracerebral injection of pro-inflammatory cytokines. Journal of Visualized Experiments. (175), e57879 (2021).
  29. Oberrauch, S., et al. Intraventricular drug delivery and sampling for pharmacokinetics and pharmacodynamics study. Journal of Visualized Experiments. (181), e63540 (2022).
  30. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injections of the enteric bacterial metabolic product propionic acid impair cognition and sensorimotor ability in the Long-Evans rat: further development of a rodent model of autism. Behavioural Brain Research. 200 (1), 33-41 (2009).
  31. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injection of propionic acid, an enteric metabolite implicated in autism, induces social abnormalities that do not differ between seizure-prone (FAST) and seizure-resistant (SLOW) rats. Behavioural Brain Research. 278, 542-548 (2015).
  32. Perry, R. J., et al. Acetate mediates a microbiome-brain-beta-cell axis to promote metabolic syndrome. Nature. 534 (7606), 213-217 (2016).
  33. Muller, P. A., et al. Microbiota modulate sympathetic neurons via a gut-brain circuit. Nature. 583 (7816), 441-446 (2020).
  34. Pardridge, W. M. CSF, blood-brain barrier, and brain drug delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 13 (7), 963-975 (2016).
  35. Wu, J. -. T., et al. Oral short-chain fatty acids administration regulates innate anxiety in adult microbiome-depleted mice. Neuropharmacology. , (2022).
  36. Lee, J., et al. Gut microbiota-derived short-chain fatty acids promote poststroke recovery in aged mice. Circulation Research. 127 (4), 453-465 (2020).
  37. Chiu, C., et al. Temporal course of cerebrospinal fluid dynamics and amyloid accumulation in the aging rat brain from three to thirty months. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 3 (2012).
  38. Schuler, B., Rettich, A., Vogel, J., Gassmann, M., Arras, M. Optimized surgical techniques and postoperative care improve survival rates and permit accurate telemetric recording in exercising mice. BMC Veterinary Research. 5, 28 (2009).
  39. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  40. Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
  41. de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
  42. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
  43. Wolter, J. M., et al. Cas9 gene therapy for Angelman syndrome traps Ube3a-ATS long non-coding RNA. Nature. 587 (7833), 281-284 (2020).
  44. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses for combinatorial cell-subclass-specific labeling. Neuron. 109 (9), 1449-1464 (2021).
  45. Xie, M., et al. TREM2 interacts with TDP-43 and mediates microglial neuroprotection against TDP-43-related neurodegeneration. Nature Neuroscience. 25 (1), 26-38 (2022).
  46. Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
  47. Bermudez-Martin, P., et al. The microbial metabolite p-Cresol induces autistic-like behaviors in mice by remodeling the gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 157 (2021).
  48. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  49. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).
  50. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  51. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  52. Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  53. Kaelberer, M. M., et al. A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction. Science. 361 (6408), (2018).
  54. Needham, B. D., Tang, W., Wu, W. L. Searching for the gut microbial contributing factors to social behavior in rodent models of autism spectrum disorder. Developmental Neurobiology. 78 (5), 474-499 (2018).
  55. Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
  56. Chu, C., et al. The microbiota regulate neuronal function and fear extinction learning. Nature. 574 (7779), 543-548 (2019).
  57. Wu, W. L., et al. Microbiota regulate social behaviour via stress response neurons in the brain. Nature. 595 (7867), 409-414 (2021).
  58. Buchanan, K. L., et al. The preference for sugar over sweetener depends on a gut sensor cell. Nature Neuroscience. 25 (2), 191-200 (2022).
  59. Han, W., et al. A neural circuit for gut-induced reward. Cell. 175 (3), 665-678 (2018).
  60. Yamawaki, Y., et al. Antidepressant-like effect of sodium butyrate (HDAC inhibitor) and its molecular mechanism of action in the rat hippocampus. World Journal of Biological Psychiatry. 13 (6), 458-467 (2012).
  61. Ho, L., et al. Protective roles of intestinal microbiota derived short chain fatty acids in Alzheimer's disease-type beta-amyloid neuropathological mechanisms. Expert Review of Neurotherapeutics. 18 (1), 83-90 (2018).
  62. Liu, J., et al. Anti-neuroinflammatory effect of short-chain fatty acid acetate against Alzheimer's disease via upregulating GPR41 and inhibiting ERK/JNK/NF-kappaB. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (27), 7152-7161 (2020).
  63. van de Wouw, M., et al. Short-chain fatty acids: microbial metabolites that alleviate stress-induced brain-gut axis alterations. Jounal of Physiology. 596 (20), 4923-4944 (2018).
  64. Olson, C. A., et al. The gut microbiota mediates the anti-seizure effects of the ketogenic diet. Cell. 173 (7), 1728-1741 (2018).
  65. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены