JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تسمح القدرة على وضع علامة دائمة على الخلايا الجذعية وذريتها باستخدام الفلوروفور باستخدام خط فأر تتبع النسب المعدلة وراثيا القابل للتحريض بإجراء تحليل مكاني وزمني للتنشيط والانتشار والهجرة و / أو التمايز في الجسم الحي. يمكن أن يكشف تتبع النسب عن معلومات جديدة حول الالتزام بالنسب ، والاستجابة للتدخل (التدخلات) ، وتعدد القدرات.

Abstract

تم تطوير خط فأر تتبع النسب التيلوميراز العكسي (Tert) للتحقيق في سلوك ومصير الخلايا الجذعية للأنسجة البالغة ، عن طريق عبور نظام "Tet-On" oTet-Cre mouse مع محول تنشط تتراسيكلين عكسي جديد (rtTA) مرتبط بمروج Tert ، والذي أثبتنا أنه يمثل مجموعة جديدة من الخلايا الجذعية الدماغية البالغة. هنا ، فإن إعطاء الدوكسيسيكلين المشتق من التتراسيكلين إلى mTert-rtTA::oTet-Cre الفئران سيحدد بشكل لا يمحى مجموعة من الخلايا التي تعبر عن جزء 4.4 كيلو بايت من المنطقة المروجة للجين Tert. عند الجمع بين مراسل Rosa-mTmG ، فإن الفئران mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG ستعبر عن غشاء tdTomato (mTomato) حتى يحفز علاج الدوكسيسيكلين على استبدال تعبير mTomato بالغشاء EGFP (mGFP) في الخلايا التي تعبر أيضا عن Tert. لذلك ، عندما تتلقى هذه الفئران التي تتعقب النسب الثلاثي المعدل وراثيا الدوكسيسيكلين (فترة "النبض" التي يتم خلالها وضع علامة على الخلايا المعبرة عن TERT) ، ستصبح هذه الخلايا خلايا mGFP + ذات علامات لا تمحى ، والتي يمكن تتبعها لأي فترة زمنية مرغوب فيها بعد إزالة الدوكسيسيكلين (فترة "المطاردة") ، حتى لو فقد تعبير Tert لاحقا. ثم يتم تثبيت الأدمغة ومعالجتها من أجل التألق المناعي والتطبيقات النهائية الأخرى من أجل تفسير التغييرات في تنشيط الخلايا الجذعية ، والانتشار ، والالتزام بالنسب ، والهجرة إلى منافذ الدماغ المختلفة ، والتمايز إلى أنواع الخلايا الناضجة. باستخدام هذا النظام ، يمكن تزاوج أي فأر rtTA مع oTet-Cre ومراسل Rosa لإجراء تجارب تتبع السلالات "مطاردة النبض" التي يمكن تحريضها بالدوكسيسيكلين باستخدام علامات الخلايا الجذعية.

Introduction

قيمة خط الماوس لتتبع النسب
قد يكون تحليل الخلايا الجذعية في الجسم الحي صعبا لأن العديد من الفحوصات التي تفحص هذه الخلايا تركز فقط على توصيف هذه الخلايا في وقت وفاة الحيوان ، والذي يمثل لقطة نهائية في الوقت المناسب. لفهم أفضل لعمليات انتشار وتمايز وهجرة السلف ، وأنواع الخلايا الوسيطة / الانتقالية ، والخلايا الناضجة بمرور الوقت ، هناك حاجة إلى نهج تحليل طولي. يمكن تحقيق ذلك من خلال دراسات تتبع النسب حيث يتم تمييز الخلايا الجذعية / السلفية بشكل لا يمحى ويمكن متابعتها لأي فترة زمنية بعد1.

في دماغ الثدييات البالغة ، تم تحليل عملية تكوين الخلايا العصبية التي يتم من خلالها إنشاء الخلايا العصبية المولودة في البالغين من الخلايا الجذعية والسلفية لأول مرة عن طريق الاحتفاظ بالتسمية باستخدام thymidine-H 3 2,3,4 أو 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU)5,6,7,8 . في هذه الدراسات ، تم تمييز الخلايا التكاثرية بنظير الثيمين ، الذي تم دمجه في الحمض النووي للخلايا أثناء النسخ المتماثل وانقسام / انتشار الخلايا. وبالتالي فإن الخلية المعلمة ، وكذلك ذريتها ، تحتوي على هذا التناظرية ، والتي تم تحديدها بعد ذلك بعد الوفاة. ومع ذلك ، في حين أن thymidine-H3 و BrdU سمحوا بوضع علامات على الخلايا التكاثرية وذريتها في مناطق الدماغ حيث كانت الخلايا الجذعية غير مفهومة بشكل جيد ، فقد أعاقت هذه الدراسات الجوانب السلبية لهذه الأدوات. يحفز Thymidine-H3 على إيقاف دورة الخلية ، وموت الخلايا المبرمج ، وتثبيط تخليق الحمض النووي المعتمد على الجرعة9 ، في حين أن BrdU يميز الخلايا بمستويات مختلفة اعتمادا على مسار الإدارة10 ويتم تناوله من قبل الخلايا أثناء الإصلاح أو موت الخلايا المبرمج ، وكذلك أثناء انقسام الخلايا11. تم استخدام طرق وضع العلامات الأكثر كفاءة مؤخرا ، مثل وضع العلامات باستخدام 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ، ولكن العديد من المشكلات نفسها مثل BrdU لا تزال12. هذه الأساليب محدودة أيضا من حيث أنها تميز أي خلية تكاثرية ، وليس فقط الخلايا الجذعية ، وبالتالي يمكن الخلط بين تفسير النتائج. في السلالة العصبية ، تحتفظ جميع الخلايا الجذعية والسلفية بالقدرة الانقسامية ، والخلايا العصبية الطرفية / الناضجة فقط ليست تكاثرية. بالنسبة للخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة ، ولكن ليس الخلايا قليلة التغصن ، يتم الحفاظ على الانتشار إلى أجل غير مسمى13،14،15.

الفئران المعدلة وراثيا المستخدمة في النسب تتبع فقط الخلايا التي تعبر عن بروتين مثير للاهتمام ، مثل تلك التي تم تأكيدها لتحديد الخلايا الجذعية البالغة كما نستخدمها هنا ، أصبحت أكثر شيوعا عند التحقيق في الخلايا الجذعية وذريتها. في حين أنه من الصعب توليد من خلال النهج المعدلة وراثيا للفئران ، فإن خطوط الفئران التي تتعقب النسب تسمح بتتبع الخلايا المميزة بشكل خاص في الدماغ ، ولا تعتمد على الانتشار وحده. في نظام الفأر المعدل وراثيا Tet-On ، فإن إعطاء التتراسيكلين أو الدوكسيسيكلين (مشتق من التتراسيكلين) يحفز تعبير Cre-recombinase في الخلايا التي تم هندستها باستخدام منشط التتراسيكلين العكسي (rtTA) ، والذي يتم نسخه من قبل مروج للاهتمام. ثم تقوم عملية إعادة التركيب التي يحركها كري المستحثة بتيت بتنشيط التعبير عن بروتين فلورسنت أو مضيئة لا يمحى في الخلايا ذات الأهمية ، اعتمادا على فأر روزا ريبورتر المستخدم. تستمر هذه الخلايا التي تحمل علامات لا تمحى في التعبير عن هذا المراسل بعد الانقسام أو التمايز أو الهجرة ، مما يسمح بتتبع هذه الخلايا وذريتها بمرور الوقت أو بعد تدخلات مختلفة16. تشمل مزايا نهج تتبع السلالات المعدلة وراثيا ما يلي: 1) خصوصية التتبع إلى سلالة خلية معينة أو سلف / خلية جذعية تتميز ب rtTA ، 2) تعبير لا يمحى عن البروتين الفلوري أو المضيء على الرغم من دوران الخلية أو التمايز ، 3) سمية منخفضة ، 4) تنشيط مشروط خلال أي نقطة في دورة حياة الحيوان ، و 5) سهولة الاستخدام مع الفحوصات الشائعة ، بما في ذلك تلطيخ المناعة / التألق المناعي16.

تشمل الطرق الأخرى لأدوات المراسل المستحثة زمنيا في الفئران استخدام فئران Cre-ERT2 ، والتي يمكن إقرانها ب ROSA-GFP ، ROSA-mTmG ، أو غيرها من الجينات المحورة لمراسل الفلورسنت. في هذه الحيوانات ، يدفع عنصر تنظيمي خاص بالخلية ، مثل منطقة مروج أو محسن ذات أهمية ، إنتاج Cre recombinase ، والذي لا يمكن تنشيطه إلا من خلال إعطاء تاموكسيفين. في حين أن خطوط الفأر Cre-ERT2 تسمح بتحريض Cre في خطوط خلية محددة ، هناك ثروة من المعرفة التي تفصل آثار تاموكسيفين على تكوين الخلايا العصبية للبالغين17,18. بالإضافة إلى ذلك ، هناك العديد من جينات مراسل الفلورسنت التي تحركها ROSA والتي يمكن استخدامها بدلا من GFP أو mTmG ، بما في ذلك YFP أو CFP ، والتي من شأنها أن تسمح بوضع علامات الفلورسنت البديلة في الأطوال الموجية الفلورية الأخرى. يمكن استخدام جينات مراسل الفلورسنت هذه مع أنظمة Tet-On أو Cre-ERT2.

النسخ العكسي للتيلوميراز (TERT) هو المكون المحدد للمعدل في تيلوميراز الهولوإنزيم ، والذي يعمل على تمديد التيلوميرات بعد تقصيرها أثناء انقسام الخلايا19,20. تم تحديد TERT كعلامة على الخلايا الجذعية للأنسجة البالغة في الأمعاء 21,22 ، نخاع العظم 21 ، الكبد 23 ، الدهني 24 ، بطانة الرحم25,26 ، والعظام1. ما إذا كان التعبير عن TERT في هذه الخلايا الجذعية البالغة هو فقط لنشاط تمديد التيلوميراز أو لأداء أدوار TERT غير الأساسية27 لا يزال غير معروف. تم تحديد الخلايا الجذعية البالغة الهادئة المعبرة عن TERT (qASCs) وتتبعها في جميع أنحاء الجسم مع تتبع النسب المعدلة وراثيا لدراسة القدرة المتعددة القدرات والتجديد الذاتي لهذه الخلايا الجذعية ، بالإضافة إلى قدرتها على التنشيط والتكاثر والتمايز والهجرة1،22،23،28. تم إجراء إنشاء الجين المحوري Tert-rtTA سابقا1. في هذه الورقة ، سوف نصف استخدام خط فأر TERT لتتبع النسب لدراسة TERT + qASCs التي حددناها على أنها مجموعة ASC جديدة في دماغ الفأر البالغ.

توليد خط ماوس تتبع النسب المعدلة وراثيا
لإنشاء خط فأر لتتبع النسب باستخدام نظام Tet-On ، يجب دمج ثلاثة جينات معدلة داخل واحد من خلال تزاوج الفئران. الأول هو rtTA ، الذي يتم التعبير عنه تحت سيطرة المروج للجين محل الاهتمام (لدينا هو TERT-rtTA). في الخلية التي تعبر عن هذا الجين المثير للاهتمام ، سيتم التعبير عن rtTA. والثاني هو جين oTet-Cre ، الذي يحتوي على عنصر استجابة التتراسيكلين (TRE) الذي سيسمح بنسخ Cre recombinase في وجود كل من نسخة اندماج rtTA والتتراسيكلين أو الدوكسيسيكلين. يمكن إعطاء التتراسيكلين أو الدوكسيسيكلين للحيوان عن طريق مياه الشرب أو تشاو29. أخيرا ، يجب أن يكون هناك جين سيتم تنشيطه بواسطة انقسام Cre recombinase. في هذه المخطوطة ، فإن جين وضع العلامات الذي سنصفه هو جين Rosa26-mTmG ، والذي حتى إعادة تركيب Cre سوف ينسخ mTomato في كل مكان (التألق الأحمر الغشائي في جميع الخلايا). ومع ذلك ، إذا كانت الخلية تعبر عن نسخة rtTA وتحتوي على التتراسيكلين أو الدوكسيسيكلين ، فإن إعادة تركيب Cre لمجموعة من مواقع lox P بين مواقع mTomato و mGFP ستغير موقع R26 وتتسبب في إنتاج الخلية غشاء EGFP (mGFP ، أو التألق الأخضر الغشائي) بدلا من الطماطم الغشائية. ستسمح الطبيعة التي لا تمحى لإشارة mGFP هذه بوضع العلامات على الخلايا وتتبعها في الجسم الحي أثناء تكاثرها وترحيلها وتمييزها. بعد التتبع ، يمكن تحليل الخلايا للتعبير عن GFP عن طريق التألق المناعي في أقسام التبريد القياسية أو الأدمغة الأكثر سمكا بصريا.

في هذه الورقة ، سنصف استخدام خط الماوس المحدد ، mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. لإنشاء خط الفأر الثلاثي المعدل وراثيا هذا ، قمنا أولا بتزاوج oTet-Cre (سلالة Jackson Lab # 006234) مع Rosa-mTmG (سلالة Jackson Lab # 007676) لإنشاء فئران ثنائية المعدلة وراثيا oTet-Cre::Rosa-mTmG. تم تشكيل هذه الحيوانات وراثيا باستخدام قوالب التمهيدي وتفاعل البوليميراز المتسلسل المشار إليها في الجدولين التكميليين 1 و 2. تم تزاوج الفئران mTert-rtTA (التي أنشأها ديفيد برولت 1) مع oTet-Cre::Rosa-mTmG لإنشاء mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG الفئران (الشكل 1A)1,30. آلية عمل خط الماوس mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG موضحة في الشكل 1B.

تحريض الدوكسيسيكلين وتصميم مطاردة النبض
عند التخطيط للتجارب ، من المهم مراعاة العديد من العوامل التي ستؤثر على نتائج تجارب تتبع النسب ، بما في ذلك عمر الحيوان عند تحريض الدوكسيسيكلين ، وطول فترة إعطاء الدوكسيسيكلين (فترة "النبض") ، وطول الفترة الزمنية بعد إزالة الدوكسيسيكلين قبل جمع الأنسجة (فترة "المطاردة") ، وتوقيت أي تدخلات خلال هذه العمليات. تعتبر اعتبارات تصميم الدراسة هذه ضرورية لفهم الخلايا المصنفة وذريتها في ختام التجربة. الخطوة الأولى في هذه العملية هي تحديد عمر اهتمام الحيوان وطول إدارة الدوكسيسيكلين. ستسمح فترات النبض الأطول بإمكانية التعبير عن المزيد من الخلايا للتعبير عن المروج المرتبط ب rtTA ووضع علامة على المزيد من الخلايا المثيرة للاهتمام بشكل لا يمحى. قد يتطلب نوع الخلايا الذي يظهر تعبيرا عابرا عن الجين محل الاهتمام فترة نبض أطول من الخلايا التي تعبر باستمرار عن الجين محل الاهتمام. ومع ذلك ، إذا كان الهدف من الدراسة هو فهم الآثار قصيرة الأجل للخلية ذات الاهتمام أو التدخل الحاد ، فإن فترة النبض لا يمكن أن تكون طويلة جدا ، لأنه بمجرد وضع علامة على الخلية ، سيتم تتبعها من خلال أي عدد من التغييرات خلال الفترة المتبقية من فترة النبض. في بعض دراساتنا ، تم استخدام نبض 2 يوم بدون فترة مطاردة لتقليد مراسل مباشر ل TERT عن كثب. وذلك لأن الحد الأدنى من الوقت لإعادة تركيب الجين Rosa-mTmG هو 2 أيام31.

الفترة الأساسية التالية في تجربة مطاردة النبض هي الطول بين إزالة الدوكسيسيكلين وتروية الحيوان ، المعروف أيضا باسم "المطاردة". يبلغ عمر النصف للدوكسيسيكلين في الفئران حوالي 170 دقيقة بغض النظر عن مسار الإدارة ، مما يسمح باستنتاج مفاده أن تحريض الدوكسيسيكلين لم يعد يحدث على الأرجح بعد عدة ساعات من الإزالة32. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن استقلاب الدوكسيسيكلين أبطأ في الفئران المسنة ، مما قد يؤدي إلى فترات "نبض" فعالة أطول من الحيوانات الصغيرة33.

خلال فترة المطاردة ، سيستمر تصنيف الخلايا المصنفة ، حتى بعد الانتشار أو التمايز أو الهجرة. سيتم أيضا تسمية ذرية هذه الخلايا. الهدف من الدراسة سيشكل طول نموذج مطاردة النبض. إذا كان الهدف من الدراسة هو فهم تجديد الأنسجة على مدى فترة طويلة من الزمن مع الخلايا ذات الاهتمام ، فقد تكون هناك حاجة إلى فترة مطاردة طويلة. وأخيرا، يجب تحديد توقيت أي تدخلات أو علاجات. ستؤثر الإدارة خلال فترة النبض على الخلايا التي تعبر عن الجين محل الاهتمام وكذلك أي ذرية تم إنشاؤها خلال هذا الوقت ، في حين أن الإدارة خلال فترة المطاردة قد تؤثر في الغالب على ذرية الخلايا ذات الاهتمام ، على الرغم من أن هذا سيعتمد على مدى سرعة انقسام الخلايا المصنفة أو تمايزها. ويرد في الشكل 2 ألف أمثلة على التصاميم التجريبية لمطاردة النبض التي استخدمناها.

من المهم أيضا أن تكون على دراية بإمكانية إشارة GFP الخلفية بسبب التعبير المتسرب. يحدث التعبير المتسرب نتيجة لإمكانات الارتباط المتأصلة بين RTTA وتسلسلات Otet في غياب الدوكسيسيكلين ، والنشاط المتبقي للجين الوراثي Otet في غياب rtTA (تمت مراجعته في34). يمثل التعبير المتسرب نقطة ضعف واحدة في أنظمة Tet ، وعلى الرغم من أن التسرب غالبا ما يكون جانبا سلبيا مقبولا للنظام ، إلا أن الحالات التي يمكن أن يؤدي فيها التعبير المتسرب إلى السمية والوفيات ، مثل توكسين diptheria (DTA) في Otet-DTA يمكن أن تحد من استخدام هذه الأنظمة35.

معالجة الدماغ والتقسيم والتألق المناعي للأقسام الرقيقة للفحص المجهري
لتحليل أدمغة الفئران بعد تجربة تتبع النسب ، يجب أولا اختراق الفئران عن طريق التروية عبر القلب لإزالة الدم والسائل الدماغي الشوكي الذي يمكن أن يؤدي إلى تألق ذاتي عال في الدماغ. هناك نوعان من المثبتات شائعة الاستخدام التي يمكن للحيوان أن يتخلل معها: Histochoice Tissue Fixative، وهو مثبت جليوكسال (GF)، أو 4٪ بارافورمالدهيد (PFA). تسمح مثبتات Glyoxal بعملية تثبيت لطيفة نسبيا مع ربط متقاطع أقل من PFA. هذا يقلل من تصلب الأنسجة ، ويقلل من الحاجة إلى استرجاع المستضدات ، ويسمح بحلول الأجسام المضادة الأقل تركيزا أثناء تلطيخ المناعة. ومع ذلك ، إذا كانت تحتوي على الميثانول ، فقد يعمل ذلك على زيادة التألق الذاتي36. من ناحية أخرى ، غالبا ما يسمح PFA بتثبيت أكثر قوة ، وبينما ستكون هناك حاجة إلى استرجاع المستضد أثناء التلطيخ المناعي ، هناك أجسام مضادة ستعمل فقط مع الأنسجة الثابتة PFA ، والتروية مع PFA 4٪ مطلوبة لتقنية التطهير البصري الموضحة لاحقا.

بعد التروية هو خطوة ما بعد التثبيت ، حيث يتم غمر الأدمغة في نفس النوع من المثبت المستخدم أثناء التروية بين عشية وضحاها. هذا يسمح لأي مناطق في الدماغ ربما لم يتم إصلاحها بالكامل أثناء التروية بالاستمرار في الإصلاح. بعد ذلك ، سيتم احتضان الأدمغة في السكروز في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لإزالة أكبر قدر ممكن من الماء قبل خطوة التجميد لمنع تكوين الجليد داخل الأنسجة ("الحفظ بالتبريد"). يمكن بعد ذلك قطع الأدمغة إلى أي عدد من أقسام الأنسجة السهمية أو الإكليلية أو المستعرضة للمعالجة. من أجل كل من الدقة والتكرار ، يجب استخدام كتل الدماغ المعايرة بطريقة تضمن قطعا متسقة بين الحيوانات. العامل الأكثر أهمية الذي يمكن أن يؤثر على كيفية تقسيم الأدمغة هو منطقة (مناطق) الدماغ ذات الاهتمام. على سبيل المثال ، في حين أن القطع السهمي قد يسمح بتحليل المزيد من مناطق الدماغ في قسم واحد من الأنسجة ، فإن هذا القطع لن يسمح بتحليل المناطق العصبية / الدبقية في المنطقة البطينية تحت البطينية (V-SVZ) لأن الجانبين الجانبي والإنسي للبطين الجانبي سيكون من المستحيل تمييزهما في هذا البعد ويتم ملاحظتهما بشكل أفضل في المستوى الإكليلي. يمكن أن يكون هذا تمييزا مهما في دراسات تكوين الخلايا العصبية للبالغين ، حيث يحتوي الجانب الجانبي من البطين الجانبي على V-SVZ العصبي المنشأ ، في حين أن الجدار الإنسي للبطين الجانبي هو مكانة أكثر دبقية37.

بعد تقسيم الأنسجة إلى أقسام إكليلية أو سهمية أو عرضية ، سيتم تجميدها إلى كتل باستخدام محلول تضمين درجة حرارة التبريد المثلى (OCT). هنا ، يتم تجميد الأدمغة داخل هذه المادة المضمنة ، باستخدام مزيج من الثلج الجاف والإيثانول. إذا كان تحليل المقطع الرفيع مطلوبا ، تقطيع الكتل إلى شرائح على جهاز تبريد ، واعتمادا على التحليل النهائي المطلوب ، يمكن الالتزام بالشرائح الزجاجية المشحونة إيجابيا كمقاطع رقيقة (<20 ميكرومتر). يمكن أيضا استخدام الشرائح الزجاجية غير المشحونة ، ولكن قد يؤدي استخدام الشرائح غير المشحونة إلى فك الأنسجة من الشرائح38. إذا كانت هناك حاجة إلى أقسام الأنسجة العائمة الحرة متوسطة السماكة (>20 ميكرومتر) ، جمع الأنسجة كأقسام عائمة بحرية. إذا كانت هناك حاجة إلى مقاطع سميكة (0.5-4 مم) ، فيجب تقطيع أقسام الدماغ غير المجمدة باستخدام اهتزاز. من المهم ملاحظة اختلافات التخزين بين الأقسام الموجودة على الشرائح ، والتي تتطلب التجميد عند -20 إلى -80 درجة مئوية والأقسام العائمة بحرية ، والتي سيتم تخزينها عند 4 درجات مئوية.

تطهير الدماغ وكامل جبل المجهر البؤري المناعي
إذا كانت هناك حاجة إلى تحليل أوسع نطاقا ، ولكن أقل تفصيلا للخلايا التي تتبع النسب في دماغ الفأر ، فمن الممكن إجراء تحليل شامل للأجزاء الأكثر سمكا من أنسجة المخ باستخدام iDISCO لمسح الدماغ39 متبوعا بالمناعة والمجهر البؤري z-stack المبلط أو المجهر ذي الورقة الضوئية. هنا ، سيتم مسح أجزاء كبيرة من دماغ الفأر بصريا (عملية إزالة الدهون39) ، مما يسمح بشكل أفضل بتصوير إشارة الفلورسنت عبر قسم أنسجة 1 مم. الجوانب السلبية لهذه العملية هي التألق الذاتي العالي وتضاؤل القدرة على الحصول على صور عالية الدقة لمورفولوجيا الخلايا وتحليل مفصل للتلطيخ المشترك بسبب زيادة مسافات العمل المطلوبة عند مقارنتها بالطرق التقليدية (أقسام التبريد الرقيقة أو الأقسام العائمة بحرية). لهذا السبب، نوصي بتطهير الدماغ لتحليل نتائج تتبع النسب على نطاق واسع في جميع أنحاء مناطق الدماغ المتعددة، بدلا من محاولة توصيف أو تحليل الخلايا الفردية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) بجامعة ولاية أوهايو.

1. إنشاء خط فأر Tet-On لتتبع السلالات ، واستراتيجيات التربية ، والتنميط الجيني للفئران الأترابية التجريبية

ملاحظة: هنا ، نوجز إنشاء نظام ماوس Tet-On مع Rosa-mTmG كجين مراسل الفلورسنت الذي يخضع لإعادة تركيب Cre ، ولكن يمكن استخدام العديد من خطوط المراسل الأخرى التي تعتمد على Cre-recombination مع نظام Tet-On أيضا.

  1. قم بإعداد قفص تزاوج من ذكر oTet-Cre (+/-) واحد أو أكثر من الإناث R26 (mTmG) (+/+). انظر الشكل 1 للحصول على نظرة عامة على إعداد تزاوج الماوس التجريبي.
  2. الجراء الناتجة (F1) ستكون oTet-Cre (+/-) أو oTet-Cre (-/-) و R26 (mTmG) (+/-). إجراء التنميط الجيني وفقا للتمهيدي في الجدول التكميلي 1 والبروتوكولات الواردة في الجدول التكميلي 2.
  3. عند الفطام، قم بإجراء اختبار الخط الجرثومي عن طريق أخذ لكمة أذن من كل عملية فطام. افحص لكمة الأذن تحت المجهر فوق الفلوري في طيف GFP / FITC لتحديد ما إذا كان الحيوان قد خضع لإعادة تركيب الخط الجرثومي في التطور. إذا كان الأمر كذلك ، فسوف يعبر الحيوان عن GFP في كل خلية ، وسوف تتألق لكمة الأذن بإشارة mGFP. لا يمكن استخدام هذه الحيوانات للتزاوج أو التجارب.
    ملاحظة: تظهر مقاطع الأذن من الفئران غير الجرثومية فقط التألق الداخلي تحت المجهر (الشكل 1C) ، بينما تظهر الخط الجرثومي إشارة GFP ساطعة (الشكل 1D). يمكن أن تكون آذان التحكم من الفئران التي لا تحتوي على جينات متحولة فلورية. كملاحظة ، تتمتع شعيرات الأذن بتألق داخلي مرتفع ويجب عدم استخدامها كعامل حاسم (الشكل 1C). بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت اختلافات في التألق الداخلي بين الفئران ذات اللون الأبيض مقابل لون المعطف الأسود ، وستحتاج عناصر التحكم من الفئران من نفس لون المعطف مثل الفئران التي يتم اختبارها في هذا التحليل.
  4. تزاوج ذكر واحد oTet-Cre (+/-) × R26 (mTmG) (+/-) مع واحد أو أكثر من الإناث oTet-Cre (-/-) × R26 (mTmG) الفئران.
  5. سيكون الجيل الناتج (F2) 1/4 R26 (mTmG) (+/+) و 1/2 Cre (+/-). اعبر هذه الحيوانات مع mTert-rtTA (+/+) عن طريق تزاوج واحد oTet-Cre (+/-) × R26 (mTmG) (+/+) مع واحد أو أكثر من mTert-rtTA (+/+).
    ملاحظة: استخدمنا mTert-rtTA (+/+) ، ولكن يمكن تنفيذ هذه العملية باستخدام أي خط ماوس rtTA30.
  6. بالنسبة لحيوانات التجارب، قم بإعداد السلالات لتوليد mTert-rtTA (+/+) أو (+/-) x oTet-Cre (+/-) × R26 (mTmG) (+/+) أو (+/-).

2. تحريض الدوكسيسيكلين من كري وتصميم مطاردة النبض

  1. عندما تكون الحيوانات في العمر الصحيح لبدء الدراسة ، استبدل مياه الشرب الخاصة بها بمياه دوكس: مياه الشرب التي تحتوي على 5٪ من السكروز و 2 ملغ / مل من الدوكسيسيكلين هيكلات. استخدم الحيوانات سالبة Cre التي تتلقى نفس مطاردة نبض الدوكسيسيكلين مثل التجارب كمجموعة تحكم لأنماط التعبير الفلوري الناتجة.
    1. بعد التحضير ، قم بتخزين ماء dox عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر. انظر الجدول 1 لمزيد من المعلومات. يمكن إعطاء ماء دوكس للحيوانات في زجاجات الشرب لمدة تصل إلى 5 أيام قبل تغييرها ، حيث يمكن أن يحدث نمو فطري إذا تم ترك ماء دوكس في درجة حرارة الغرفة لفترات أطول من الزمن.
      ملاحظة: مطلوب نبضة دوكسيسيكلين لمدة 2 أيام على الأقل لتحريض إشارة mGFP عند استخدام الجين المحور mTmG (ورقة mTmG الأولية).
      ملاحظة: لم نختبر تركيزات الدوكسيسيكلين بخلاف 2 ملغم/مل. وقد حددت الأدبيات السابقة أن هذا التركيز له أعلى الآثار عند إعطائه من خلال مياه الشرب29. قد تختلف كمية الدوكسيسيكلين التي يتم تسليمها اعتمادا على كمية الشرب التي يقوم بها كل. يمكن أيضا إجراء حقن الدوكسيسيكلين أو gavage من أجل أن تكون متسقة بين الحيوانات40.
  2. بعد انتهاء فترة النبض ، قم بإزالة ماء dox من الأقفاص واستبدله بمياه الشرب العادية. ستكون الحيوانات الآن في فترة "المطاردة" حتى الموت.

3. التروية عبر القلب وتشريح الدماغ

  1. قم بإزالة الماوس من قفصه وكبح جماح الحيوان باستخدام الإبهام الأيسر والسبابة. حقن الحيوان عن طريق الحقن داخل الصفاق (i.p.) بمحلول من 100 ملغم / مل من الكيتامين و 20 ملغ / مل من الزيلازين في محلول ملحي معقم بنسبة 0.9 ٪ للحصول على تركيز نهائي من 200 ملغ / كغ من الكيتامين و 20 ملغ / كغ من الزيلازين. انظر الجدول 1 لمزيد من المعلومات.
    تنبيه: قد تختلف بروتوكولات التخدير حسب البلد. بالإضافة إلى ذلك ، هناك آثار للتخدير على الدماغ بما في ذلك التغيرات في مورفولوجيا الدبقية الدقيقة والعمل ومستويات الكورتيكوستيرون التي يجب فهمها عند إجراء التروية لغرض جمع الدماغ وتحليله41,42.
  2. بعد حوالي 1-2 دقيقة سيفقد الحيوان رد فعله الصحيح. لاختبار ذلك ، ما عليك سوى لف الحيوان على ظهره وإذا لم يتمكن من التراجع على قدميه ، فقد فقد رد فعل التصحيح.
  3. بعد حوالي 5-10 دقائق ، سيفقد الحيوان رد فعل الدواسة. للتحقق من رد فعل الدواسة ، استخدم الإبهام والسبابة لقرصة كل قدم من أقدام الحيوان. إذا لم تكن هناك استجابة ، في شكل قفزة أو تشنج عضلي ، استخدم أظافر الإبهام والسبابة لقرصة كل قدم من أقدام الحيوان. إذا لم تكن هناك استجابة ، فقد الحيوان منعكس الدواسة.
    ملاحظة: إذا استجاب الحيوان لمنعكس الدواسة لأكثر من 15 دقيقة بعد الحقن ، فقد تكون هناك حاجة إلى حقن إضافي قدره 1/2 من حقن الكيتامين / الزيلازين الأولي. قد يؤثر العمر والجنس والنمط الوراثي والنمط الظاهري والعلاج على استجابة الحيوان لهذا الكوكتيل الدوائي.
  4. بعد فقدان ردود الفعل الصحيحة والدواسة ، اختبر منعكس العين عن طريق الاتصال الخفيف بمقلة عين الماوس بإصبع قفاز. يشير عدم الاستجابة إلى فقدان منعكس العين.
  5. قم بتأمين الماوس في وضع ضعيف مع الكفوف المثبتة على سطح عمل قابل للتثبيت.
  6. قم بعمل شق عبر الجلد باستخدام مقص جراحي على طول خط الوسط الصدري على بعد حوالي 1-2 سم تحت عملية الخنازير. قطع متفوقة حتى في عملية خنفساء.
  7. فهم غضروف عملية الخناق مع ملقط. أدخل مقص وقطع من خلال العضلات والقفص الصدري قطريا على طول الجانب الأيمن من الماوس إلى مستوى الترقوة.
    1. ارفع العضلات الصدرية باستخدام ملقط وقطعها عبر الحجاب الحاجز حتى يمكن تصور القلب. ثم قم بعمل قطع قطري متطابق على طول الجانب الأيسر للماوس ، مع التأكد من منع أي اتصال بالقلب. استخدم مرقئ للحفاظ على العضلات الصدرية بعيدا عن التجويف.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، لن يتمكن الماوس من التنفس بعد الآن ، لذا اعمل بسرعة لمنع الموت قبل الخطوات التالية.
  8. قم بتأمين القلب النابض باستخدام ملقط حاد وأدخل إبرة توزيع في البطين الأيسر من خلال قاعدة قوس الأبهر.
  9. قم بتثبيت قاعدة الإبرة على البطين الأيسر فوق موقع الإدخال مباشرة.
  10. قم بعمل شق في الأذين الأيمن ، وعند أول علامة على تدفق الدم ، ابدأ في اختراق الحيوان ب 20 مل من 1x PBS عند 8.11 مل / دقيقة.
  11. بعد أن يقوم 1x PBS بأداء الجسم ، قم بالتبديل إلى المثبت المناسب للتطبيق النهائي وقم بدمج الماوس مع 20 مل من المثبت.
    1. بالنسبة للتقسيم المجمد والتلطيخ المناعي ، قم بدمج الحيوان مع مثبت glyoxal لتطهير الدماغ ، والحيوان perfuse مع 4٪ PFA في 1x PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4).
      ملاحظة: تشمل علامات التروية الناجحة تصلب الحيوانات (تصلب طفيف مع الغليوكسال ، تصلب شديد مع PFA) ونقص الأوعية الدموية المرئية في جميع أنحاء الأنسجة.
  12. قطع رأس الفأر وإزالة الدماغ عن طريق إدخال مقص في جذع الدماغ وقطع على طول خياطة الحرشفية من خلال خياطة الجبهةالفك العلوي على كل جانب. ثم قطع عبر خياطة اليافوخ الأنفية لإزالة غطاء الجمجمة ، مع الحرص على عدم إتلاف المصباح الشمي. من هناك ، اقلب الجمجمة رأسا على عقب ، واستخدم ملقط منحني لإزالة الدماغ ، مع التأكد من قطع العصب البصري.
  13. ضع الدماغ المنصهر في خرطوشة أنسجة وانغمس في المثبت المستخدم لأداء الحيوان بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.

4. علاج الدماغ ، والتقطيع ، والتلطيخ المناعي

  1. علاج الدماغ وتقطيعه إلى شرائح
    1. قم بإزالة خراطيش الدماغ من مثبت الغليوكسال واحتضن 15٪ من السكروز في 1x PBS لمدة يومين عند 4 درجات مئوية أو حتى تغرق الأدمغة.
    2. قم بإزالة خراطيش الدماغ من 15٪ من السكروز واحتضنها في 30٪ من السكروز في 1x PBS لمدة يومين عند 4 درجات مئوية أو حتى تغرق الأدمغة.
      ملاحظة: انظر الجدول 1 للحصول على مزيد من المعلومات.
    3. إزالة الأدمغة من 30٪ السكروز في 1x PBS وفصل الدماغ إلى "كتل" مختلفة باستخدام كتلة الدماغ الإكليلية أو كتلة الدماغ السهمية.
    4. تضمين أقسام الدماغ الإكليلية أو السهمية في مركب OCT عن طريق وضع أقسام الدماغ على مزيج من الثلج الجاف والإيثانول (EtOH). بعد أن يتحول OCT إلى اللون الأبيض ويصبح صلبا ، قم بإزالته من خليط EtOH الجاف من الثلج الجاف وخزنه ملفوفا في بارافيلم ، داخل كيس محكم الإغلاق عند -20 درجة مئوية.
    5. قم بإزالة الكتل المجمدة من الفريزر وضعها داخل كريوستات مع ضبط درجة حرارة داخلية على -20 درجة مئوية. استخدم OCT لتوصيل الكتلة بظرف معدني بحيث يتم ربط الأنسجة بقوة. اسمح ل ~ 5 دقائق حتى يتجمد النسيج إلى تشاك. قم بتقطيع الأنسجة إلى شرائح عند 7 ميكرومتر ، مع وضع كل شريحة نسيج على شريحة زجاجية مشحونة.
    6. اسمح للشرائح بالخبز طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، ثم ضعها عند -20 درجة مئوية حتى تستخدم للتلطيخ المناعي.
  2. تلطيخ مناعي
    1. قم بتسخين الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة (RT) وبعد الإصلاح باستخدام الأسيتون البارد لمدة 15 دقيقة.
    2. اغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في 1x غسول مؤقت (على سبيل المثال، IHC Select TBS Rinse Buffer)، تهتز بسرعة 60 دورة في الدقيقة عند RT بين كل خطوة.
    3. Permeabilize لتلطيخ المستضدات النووية مع 0.3٪ Triton X-100 لمدة 10 دقائق في RT. Permeabilize لتلطيخ المستضدات السيتوبلازمية مع 0.3٪ Tween-20 لمدة 10 دقائق في RT.
    4. قم بإجراء استرجاع المستضد عن طريق شرائح الميكروويف في 50-100 مل من محلول استرجاع مستضد DAKO 1x على مستوى منخفض لمدة 10 دقائق ، مرتين. ثم اشطفيه بمخزن مؤقت للشطف لمدة 5 دقائق في RT.
    5. احتضن الشرائح في 0.3٪ Typogen Black في 70٪ EtOH لمدة 20 دقيقة في RT ثم اغسلها باستخدام المخزن المؤقت للشطف.
    6. ارسم حاجزا مسعورا حول كل نسيج دون السماح للأنسجة بالجفاف. ثم كتلة لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية مع 1 قطرة من كاشف حجب Millipore لكل أنسجة. ثم أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة في الأجسام المضادة المخففة لكل نسيج واحتضنها بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
    7. في اليوم التالي ، احتضان أقسام في الأجسام المضادة الثانوية Alexa Fluor لمدة 10 دقائق في RT. ثم اغسل الشرائح في المخزن المؤقت للشطف.
    8. قم بتغطية أقسام الدماغ في 100 ميكرولتر من 1:500 من الأجسام المضادة المضادة ل GFP المقترنة ب AlexaFluor 488 لتعزيز إشارة GFP الداخلية التي تميز الخلايا المتعقبة وتحضنها بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
    9. في اليوم التالي ، اغسل باستخدام المخزن المؤقت للشطف 2x ، ثم اغسله بالماء DI الجاري لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: تأكد من غسلها بلطف بماء DI ، مع الحرص على تجنب أي مياه جارية على الشرائح نفسها التي يمكن أن تزيل أقسام الدماغ من الشرائح.
    10. مضاد للبقع مع 100 نانوغرام / مل 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) لمدة 5 دقائق. ثم يغسل في الماء DI الجاري لمدة 5 دقائق.
    11. أضف قطرة من وسط التركيب أعلى كل قسم من أقسام الأنسجة وأغلقها بغطاء 22 مم × 22 مم. يوصى بالتصوير في يوم التركيب لضمان الإشارة المثلى.

5. iDISCO تطهير الدماغ (مقتبس من39)

  1. التثبيت والتقسيم
    1. أدمغة ما بعد الإصلاح في 4٪ PFA بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية ثم مرة أخرى لمدة 1 ساعة في RT.
    2. اغسل الأدمغة في 1x PBS لمدة ساعة ، مرتين ، في RT. ثم تقطع إلى أقسام بسماكة 1 مم باستخدام كتلة الدماغ اللازمة وتوضع في أنابيب طرد مركزي دقيق سعة 5 مل تحتوي على 1x PBS.
  2. المعالجة المسبقة للميثانول (بالميثانول)
    ملاحظة: نظرا لإمكانية تأثير الميثانول على تلطيخ مناعي لبعض البروتينات ، يود المؤلفون توجيه القارئ إلى Renier et al. 2014 للحصول على بروتوكول بديل39 لبروتوكول iDISCO خال من الميثانول. انظر الجدول 1 للحصول على مزيد من المعلومات حول الحلول التالية في هذا القسم.
    1. يغسل مع 1x PBS لمدة 1 ساعة مرتين (يهتز) في RT.
    2. يغسل في 50٪ من الميثانول (في PBS) لمدة 1 ساعة (يهتز) في RT.
    3. يغسل في 80 ٪ من الميثانول لمدة 1 ساعة (يهتز) في RT.
    4. يغسل الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 1 ساعة مرتين (يهتز) في RT.
    5. عينات التبييض مع 5٪ بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2) في 20٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) / الميثانول (1 حجم 30٪ H 2 O2/1 حجم DMSO / 4 حجم الميثانول ، الجليد البارد) عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها (يهتز).
    6. بعد التبييض ، اغسل العينات في الميثانول لمدة 1 ساعة مرتين (اهتز) في RT.
    7. يغسل في 20٪ DMSO / الميثانول لمدة 1 ساعة مرتين (يهتز) في RT.
    8. يغسل في 80 ٪ من الميثانول لمدة 1 ساعة (يهتز) في RT.
    9. يغسل في 50٪ من الميثانول لمدة 1 ساعة (يهتز) في RT.
    10. يغسل في PBS لمدة 1 ساعة مرتين (يهتز) في RT.
    11. يغسل في PBS / 0.2٪ Triton X-100 لمدة 1 ساعة مرتين (يهتز) في RT.
  3. التلطيخ المناعي لتطهير الأدمغة
    1. احتضان العينات في 1x PBS / 0.2٪ Triton X-100 / 20٪ DMSO / 0.3 M glycine عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها على شاكر مداري.
    2. كتلة في 1x PBS / 0.2٪ Triton X-100 / 10٪ DMSO / 6٪ مصل الماعز عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام على شاكر مداري.
    3. اغسل العينات في 1x PBS / 0.2٪ Tween-20/10 μg / mL ملح الصوديوم الهيبارين من الغشاء المخاطي للخنزير لمدة 1 ساعة مرتين عند 37 درجة مئوية ، ثم احتضنها في 1x PBS / 0.2٪ Tween-20/10 ميكروغرام / مل الهيبارين / 5٪ DMSO / 3٪ مصل الماعز الذي يحتوي على 1:500 تركيز من الأرانب المضادة ل GFP AlexaFluor 488 عند 37 درجة مئوية على شاكر مداري لمدة يومين.
    4. اغسل العينات في 1x PBS / 0.2٪ Tween-20 مع 10 ميكروغرام / مل من الهيبارين لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية على الاهتزاز المداري ، ثلاث مرات ، ثم مرة واحدة في اليوم لمدة يومين.
    5. احتضان العينات بين عشية وضحاها في 10 مل من 50٪ v / v Tetrahydrofuran (THF) / H2O في أنبوب مخروطي 15 مل.
    6. احتضان العينات لمدة 1 ساعة في 10 مل من 80٪ THF / H2O.
    7. احتضان العينات مرتين لمدة 1 ساعة في THF 100٪.
    8. جفف العينات بمنديل معقم واحتضنها في ثنائي كلورو الميثان حتى تغرق في قاع القارورة (حوالي 40 دقيقة). لا تحتضن >60 دقيقة.
      ملاحظة: تأكد من التعامل مع ثنائي كلورو الميثان تحت غطاء الدخان.
    9. احتضان العينات في 18 مل من إيثر ثنائي البنزيل (DBE) حتى تصبح صافية (>2 ساعة).
    10. قم بتخزين العينات في DBE في RT حتى تصبح جاهزة للتصوير.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، من المهم تصوير العينات في أقرب وقت ممكن بعد اكتمال المسح.

6. تصوير الشرائح الملطخة أو الأدمغة التي تم تطهيرها

  1. لتصوير أقسام الدماغ الملطخة بالمناعة، قم بتحليل الشرائح عبر المجهر البؤري، حيث يمكن تأكيد التعبير المشترك عن الأجسام المضادة المتعددة. نحن نستخدم مجهر Leica Stellaris 5 مع كاشفات HyD S الهجينة ، ولكن أي مجهر بؤري مسحي للنقاط سيعمل. وتشمل الأهداف HC PL APO 10x/0.40 CS2 وHC PL APO 40x/1.30 OIL CS2 وHC PL APO 63x/1.40.
    1. قم بتكوين خطوط الليزر الصحيحة ومرشحات الانبعاثات. تخضع أشعة الليزر المطلوبة وكثافة الليزر المقابلة للمجهر ومجموعات الفلوروفور المستخدمة.
      ملاحظة: نحن نستخدم مزيجا من الصمام الثنائي 405 نانومتر وليزر الضوء الأبيض لضبط أطياف الإثارة والانبعاثات لكل فلوروفور ، أو مجموعات من الفلوروفورات ، التي يتم استخدامها لتقليل المحادثات المتقاطعة والقضاء عليها. يمكن تحقيق نتائج مماثلة باستخدام مجموعات الليزر / المرشحات التقليدية أيضا ولكن مع إيلاء اهتمام وثيق لنزيف القناة من خلالها. يمكن تحديد النزيف من خلال تشغيل خط ليزر واحد بالاقتران مع كل مجموعة من مجموعات مرشحات الانبعاثات المطلوبة لمعرفة القنوات التي تتأثر بكل ليزر محدد. على سبيل المثال ، إذا كان ليزر الصمام الثنائي 405 نانومتر ينتج تألقا مرئيا في مرشح انبعاثات GFP ، فهناك نزيف يحدث. تأكد من تصوير قنوات متعددة بالتتابع إطارا تلو الآخر لتقليل أي نزيف من خلال حدوثه بشكل كبير.
    2. بالنسبة لأدمغة Tet-On الملطخة المشتركة مع مراسل mTmG ، حدد DAPI (على سبيل المثال 405 نانومتر ، em. 450 نانومتر) ، GFP (على سبيل المثال 488 نانومتر ، em. 509 نانومتر) ، tdTomato (على سبيل المثال 555 نانومتر ، em. 582 نانومتر) ، والفلوروفور الأحمر البعيد المقابل لمطابقة الفلوروفور المستخدم في الجسم المضاد الثانوي. نوصي Alexa Fluor 647 (على سبيل المثال 651 نانومتر ، م 667 نانومتر).
    3. قم بإنشاء الإعدادات أولا باستخدام دماغ للتحكم في Cre ملطخ بكل من GFP والفلورسنت الثانوي. سوف تتحكم شرائح الدماغ هذه في التألق في الخلفية من الأجسام المضادة الفلورية ولن تظهر أي إشارة GFP حقيقية.
    4. قم بتحليل كل قسم من أقسام الدماغ من أعلى إلى أسفل ، من اليسار إلى اليمين ، للتحقق من عدم وجود إشارة مفقودة في التحليل. إذا تم تصوير نفس قسم الدماغ في تكبيرات مختلفة ، فمن المستحسن استخدام التكبيرات السفلية أولا ، لأن التكبير الأعلى سيؤدي إلى تبييض إشارة mTomato بسرعة أكبر.
  2. لتصوير الأدمغة التي تم تطهيرها ، استخدم مجهرا بؤريا مقلوبا مع مرحلة آلية ووظيفة تبليط آلية. نحن نستخدم مجهر لايكا ستيلاريس 5. نظرا لأن العينات سميكة جدا (>500 ميكرومتر) ، فهناك حاجة إلى مسافات عمل أكبر تحد من التكبير الذي يمكن تحقيقه بفعالية. نحن نستخدم هدف HC PL APO 10x / 0.40 CS2 لجميع تصوير الدماغ الذي تم مسحه.
    1. ابدأ بوضع قسم دماغي مسطح على طبق زجاجي سفلي وغمره في إيثر ثنائي البنزيل.
      ملاحظة: ثنائي بنزيل الأثير هو تآكل لمعظم العدسات الموضوعية ومعظم البلاستيك. لهذا السبب ، يجب طلاء أي بلاستيك داخلي في الطبق السفلي الزجاجي بمطاط صناعي سيليكون سريع التجفيف.
    2. قم بتكوين خطوط الليزر الصحيحة ومرشحات الانبعاثات. بالنسبة لأدمغة Tet-On الملطخة المشتركة مع مراسل mTmG ، حدد DAPI و GFP و tdTomatoو الفلوروفور الأحمر البعيد المقابل لمطابقة الفلوروفور المستخدم في الجسم المضاد الثانوي. اضبط الدقة المطلوبة ، نوصي بما لا يقل عن 1024 × 1024. اضبط الثقب على 1 وحدة فلكية.
    3. قم بإنشاء كثافة الليزر واكتساب الكاشف أولا باستخدام دماغ للتحكم في Cre ملطخ بكل من GFP والفلورسنت الثانوي. سوف تتحكم شرائح الدماغ هذه في التألق في الخلفية من الأجسام المضادة الفلورية ولن تظهر أي إشارة GFP حقيقية.
    4. بمجرد تحسين كثافة الليزر واكتساب الكاشف ، قم بتخطيط الدماغ للتصوير. ابدأ بتحديد محيط قسم الدماغ بالكامل لتعيين محور X و Y لاكتساب الصورة. بعد ذلك ، حدد محور Z عن طريق تعيين النقطة البؤرية إلى عمق مركز الأنسجة تقريبا ، واستخدم عناصر التحكم في تحديد موضع Z لتحديد موقع النقطة "الأعلى" للنسيج (قيمة Z الأكثر إيجابية). قم بمسح مناطق مختلفة من الأنسجة لزيادة الحد الأقصى لارتفاع المحور Z حسب الضرورة.
      1. كرر ذلك للحصول على النقطة "الأدنى" (الأكثر سلبية قيمة Z) المطلوبة للحصول على سمك الأنسجة بالكامل. يبلغ الحد الأقصى ل Stellaris 5 ± 250 um من النقطة البؤرية. هذا يحد من المقاطع البصرية إلى 500 ميكرومتر في المحور Z. منطقة 3D من قسم الدماغ معروفة الآن.
    5. اضبط حجم الخطوة Z على 6 ميكرومتر وابدأ في الحصول على الصورة. يعتمد وقت الاكتساب على عدة عوامل ويمكن أن يتراوح من ساعات إلى أيام اعتمادا على المعلمات المطلوبة. لتقليل وقت الحصول على الصورة، حاول تقليل الدقة أو زيادة سرعة المسح الضوئي بالليزر أو زيادة حجم الخطوة.
    6. بمجرد التقاط الصورة المبلطة لقسم الدماغ الذي تم مسحه بالكامل ، قم بتحليلها حسب الرغبة.

النتائج

في حين أن إشارة الفلورسنت الناتجة عن نظام Tet-On مع مراسل الفلورسنت ستختلف اعتمادا على المروج للاهتمام والفلوروفور (الفلوروفور) المستخدم ، سنصف كيف تم تحليل النتائج مع mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. أدى تحليل أدمغة البالغين بعد مطاردة النبض إلى خلايا غشائية تعبر عن GFP في جميع أنحاء المنافذ التشريحية الم?...

Discussion

يتم وصف طريقة لإنشاء واستخدام وتحليل خط الفأر الثلاثي المعدل وراثيا الذي يتتبع خط الفئران الذي يميز الخلايا الجذعية داخل دماغ الفأر البالغ في الجسم الحي. عندما يقترن ذلك بالتلطيخ المناعي أو تطهير الدماغ ، يمكن تحقيق تحديد وتوصيف الخلايا الفلورية المتعقبة عبر الدماغ. توفر هذه التقني?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا الدكتورة ديانا كارلون (مستشفى بوسطن للأطفال، كلية الطب بجامعة هارفارد) والدكتور ماثيو لينز (مركز جوسلين للسكري. معهد أبحاث مركز مين الطبي) للإرشاد باستخدام mTert-rtTA.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibody diluentAgilentS080983-2
Antigen Retrieval SolutionAgilentS2367
anti-GFP antibodyInvitrogenA2311Use at 1:500-1:000
AcetoneFisher ScientificA18-4
B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/JThe Jackson LaboratoryJAX:006234
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/JThe Jackson LaboratoryJAX:007676
Blocking Solution (IHC)Millipore Sigma20773
Blunt needleBSTEANX0012SYHIV
Coronal brain blockBraintreeBS-2000C
Cover slipCorning2850-22
CryostatLeicaCM1900
DAPISigma-AldrichD564
Dibenzyl etherMillipore Sigma33630
DichloromethaneSigma-Aldrich270997
Dimethyl SulfoxideSigma-AldrichD8418
Donkey SerumSigma-AldrichD9663
Doxycycline HyclateSigma-AldrichD9891
GlycineBio-Rad161-0718
Heparin Sodium Salt from Porcine MucosaSigma-AldrichH3393
Histochoice Molecular Biology Tissue FixativeAmrescoH120This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)
Hydrogen Peroxide SolutionSigma-Aldrich516813
IHC Select TBS Rinse BufferMillipore Sigma20845
KetamineWestward0143-95095-10This product requires a DEA license for storage and use.
MethanolFisher ScientificA452-4
Microscope SlidesFisherbrand12-550-15
Milipore BlockMillipore20773
Mounting mediumMillipore Sigma5013
Optimal Cutting Temperature SolutionSakura4583
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
PBS Solution (10X)TeknovaP0496
Sagittal brain blockBraintreeRBM-2000S
SalineBraunS8004-5264
SucroseSigma-AldrichS7903
Sudan (Typogen) BlackMillipore Sigma199664
TetrahydrofuranSigma-Aldrich186562
Tissue cartridgeSimportM512
Triton X-100Bio-Rad1610407
Tween-20Millipore Sigma655205
XylazineAnaSedsc-362950Rx

References

  1. Carlone, D. L., et al. Telomerase expression marks transitional growth-associated skeletal progenitor/stem cells. Stem Cells. 39 (3), 296-305 (2021).
  2. Altman, J., Das, G. D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. Journal of Comparative Neurology. 124 (3), 319-335 (1965).
  3. Cameron, H. A., Gould, E. Adult neurogenesis is regulated by adrenal steroids in the dentate gyrus. Neuroscience. 61 (2), 203-209 (1994).
  4. Kaplan, M. S., Hinds, J. W. Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs. Science. 197 (4308), 1092-1094 (1977).
  5. Gould, E., et al. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult tree shrew is regulated by psychosocial stress and NMDA receptor activation. Journal of Neuroscience. 17 (7), 2492-2498 (1997).
  6. Eriksson, P. S., et al. Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nature Medicine. 4 (11), 1313-1317 (1998).
  7. Gould, E., et al. Neurogenesis in adulthood: a possible role in learning. Trends in Cognitive Science. 3 (5), 186-192 (1999).
  8. Hastings, N. B., Gould, E. Rapid extension of axons into the CA3 region by adult-generated granule cells. Journal of Comparative Neurology. 413 (1), 146-154 (1999).
  9. Hu, V. W., et al. 3H-thymidine is a defective tool with which to measure rates of DNA synthesis. The FASEB Journal. 16 (11), 1456-1457 (2002).
  10. Cifuentes, M., et al. A comparative analysis of intraperitoneal versus intracerebroventricular administration of bromodeoxyuridine for the study of cell proliferation in the adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 201 (2), 307-314 (2011).
  11. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
  12. Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
  13. Guizzetti, M., Kavanagh, T. J., Costa, L. G. Measurements of astrocyte proliferation. Methods in Molecular Biology. 758, 349-359 (2011).
  14. Gomez-Nicola, D., et al. Regulation of microglial proliferation during chronic neurodegeneration. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2481-2493 (2013).
  15. Bradl, M., Lassmann, H. Oligodendrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 37-53 (2010).
  16. Das, A. T., Tenenbaum, L., Berkhout, B. Tet-On systems for doxycycline-inducible gene expression. Current Gene Therapy. 16 (3), 156-167 (2016).
  17. Lee, C. M., et al. Single-cell RNA-seq analysis revealed long-lasting adverse effects of tamoxifen on neurogenesis in prenatal and adult brains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (32), 19578-19589 (2020).
  18. Smith, B. M., et al. Oral and injected tamoxifen alter adult hippocampal neurogenesis in female and male mice. eNeuro. 9 (2), (2022).
  19. Greenberg, R. A., et al. Expression of mouse telomerase reverse transcriptase during development, differentiation and proliferation. Oncogene. 16 (13), 1723-1730 (1998).
  20. Cong, Y. S., Wright, W. E., Shay, J. W. Human telomerase and its regulation. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (3), 407-425 (2002).
  21. Breault, D. T., et al. Generation of mTert-GFP mice as a model to identify and study tissue progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (30), 10420-10425 (2008).
  22. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 179-184 (2011).
  23. Lin, S., et al. Distributed hepatocytes expressing telomerase repopulate the liver in homeostasis and injury. Nature. 556 (7700), 244-248 (2018).
  24. Lynes, M. D., et al. Telomerase reverse transcriptase expression marks a population of rare adipose tissue stem cells. Stem Cells. 40 (1), 102-111 (2022).
  25. Cousins, F. L., et al. Telomerase reverse transcriptase expression in mouse endometrium during reepithelialization and regeneration in a menses-like model. Stem Cells and Development. 28 (1), 1-12 (2019).
  26. Deane, J. A., et al. The mouse endometrium contains epithelial, endothelial and leucocyte populations expressing the stem cell marker telomerase reverse transcriptase. Molecular Human Reproduction. 22 (4), 272-284 (2016).
  27. Thompson, C. A. H., Wong, J. M. Y. Non-canonical functions of telomerase reverse transcriptase: emerging roles and biological relevance. Current Topics in Medicinal Chemistry. 20 (6), 498-507 (2020).
  28. Lynes, M. D., et al. Telomerase reverse transcriptase expression marks a population of rare adipose tissue stem cells. Stem Cells. , (2021).
  29. Redelsperger, I. M., et al. Stability of doxycycline in feed and water and minimal effective doses in tetracycline-inducible systems. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (4), 467-474 (2016).
  30. Jensen, G. J., et al. Telomerase reverse transcriptase (TERT)-expressing cells mark a novel stem cell population in the adult mouse brain. Peer Review. , (2022).
  31. Muzumdar, M. D., et al. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  32. Bocker, R., et al. Comparison of distribution of doxycycline in mice after oral and intravenous application measured by a high-performance liquid chromatographic method. Arzneimittelforschung. 31 (12), 2116-2117 (1981).
  33. Lucchetti, J., et al. Plasma and brain concentrations of doxycycline after single and repeated doses in wild-type and APP23 mice. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 368 (1), 32-40 (2019).
  34. Sun, Y., Chen, X., Xiao, D. Tetracycline-inducible expression systems: new strategies and practices in the transgenic mouse modeling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 39 (4), 235-246 (2007).
  35. Lee, P., et al. Conditional lineage ablation to model human diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (19), 11371-11376 (1998).
  36. Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as "gold standard" for immunohistochemistry. American Journal of Clinical Pathology. 129 (3), 358-366 (2008).
  37. Delgado, A. C., et al. Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain. Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).
  38. Bratthauer, G. L. Preparation of frozen sections for analysis. Immunocytochemical Methods and Protocols. , 67-73 (2010).
  39. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  40. Cawthorne, C., et al. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. Journal of Biomolecular Techniques. 18 (2), 120-123 (2007).
  41. Hristovska, I., et al. Ketamine/xylazine and barbiturates modulate microglial morphology and motility differently in a mouse model. PLoS One. 15 (8), 0236594 (2020).
  42. Pereira, G. C., et al. Anesthesia can alter the levels of corticosterone and the phosphorylation of signaling molecules. BMC Research Notes. 14 (1), 363 (2021).
  43. Markakis, E. A., Gage, F. H. Adult-generated neurons in the dentate gyrus send axonal projections to field CA3 and are surrounded by synaptic vesicles. Journal of Comparative Neurology. 406 (4), 449-460 (1999).
  44. Magavi, S. S., Leavitt, B. R., Macklis, J. D. Induction of neurogenesis in the neocortex of adult mice. Nature. 405 (6789), 951-955 (2000).
  45. Evans, J., et al. Characterization of mitotic neurons derived from adult rat hypothalamus and brain stem. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 1076-1085 (2002).
  46. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Neurogenesis in the hypothalamus of adult mice: potential role in energy balance. Science. 310 (5748), 679-683 (2005).
  47. Parent, A., Cicchetti, F., Beach, T. G. Calretinin-immunoreactive neurons in the human striatum. Brain Research. 674 (2), 347-351 (1995).
  48. Rich, E. L., Shapiro, M. Rat prefrontal cortical neurons selectively code strategy switches. Journal of Neuroscience. 29 (22), 7208-7219 (2009).
  49. Suzuki, S. O., Goldman, J. E. Multiple cell populations in the early postnatal subventricular zone take distinct migratory pathways: a dynamic study of glial and neuronal progenitor migration. Journal of Neuroscience. 23 (10), 4240-4250 (2003).
  50. Figueres-Onate, M., Sanchez-Gonzalez, R. -., Lopez-Mascaraque, L. -. Deciphering neural heterogeneity through cell lineage tracing. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (5), 1971-1982 (2021).
  51. Hammelrath, L., et al. Morphological maturation of the mouse brain: An in vivo MRI and histology investigation. Neuroimage. 125, 144-152 (2016).
  52. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70 (4), 687-702 (2011).
  53. Sanchez-Gonzalez, R., Bribian, A., Lopez-Mascaraque, L. Cell fate potential of NG2 progenitors. Scientific Reports. 10 (1), 9876 (2020).
  54. Suzuki, T., et al. Cells of NG2 lineage increase in glomeruli of mice following podocyte depletion. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 315 (5), 1449-1464 (2018).
  55. Chou, Y. H., et al. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
  56. Hendrickson, M. L., et al. Expression of nestin by neural cells in the adult rat and human brain. PLoS One. 6 (4), 18535 (2011).
  57. Bifari, F., et al. Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 383 (2015).
  58. Doetsch, F., et al. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97 (6), 703-716 (1999).
  59. Seri, B., et al. Astrocytes give rise to new neurons in the adult mammalian hippocampus. Journal of Neuroscience. 21 (18), 7153-7160 (2001).
  60. DeCarolis, N. A., et al. In vivo contribution of nestin- and GLAST-lineage cells to adult hippocampal neurogenesis. Hippocampus. 23 (8), 708-719 (2013).
  61. Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. Cells in the astroglial lineage are neural stem cells. Cell and Tissue Research. 331 (1), 179-191 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved