Rastreo de linaje de células madre inducibles marcadas fluorescentemente en el cerebro de ratón adulto

Resumen

La capacidad de marcar permanentemente las células madre y su progenie con un fluoróforo utilizando una línea de ratón de rastreo de linaje transgénico inducible permite el análisis espacial y temporal de la activación, proliferación, migración y / o diferenciación in vivo. El rastreo de linaje puede revelar información novedosa sobre el compromiso del linaje, la respuesta a las intervenciones y la multipotencia.

Resumen

Se desarrolló una línea de ratón de rastreo de linaje de transcriptasa inversa (Tert) para investigar el comportamiento y el destino de las células madre de tejidos adultos, cruzando el sistema 'Tet-On' del ratón oTet-Cre con un nuevo transgén transactivador de tetraciclina inversa (rtTA) vinculado al promotor Tert, que hemos demostrado que marca una nueva población de células madre cerebrales adultas. Aquí, la administración del derivado de la tetraciclina doxiciclina a ratones mTert-rtTA::oTet-Cre marcará indeleblemente una población de células que expresan un fragmento de 4,4 kb de la región promotora del gen Tert. Cuando se combina el reportero Rosa-mTmG, los ratones mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG expresarán tdTomato de membrana (mTomato) hasta que el tratamiento con doxiciclina induzca el reemplazo de la expresión de mTomato con EGFP de membrana (mGFP) en células que también expresan Tert. Por lo tanto, cuando estos ratones de rastreo de linaje triple transgénico reciben doxiciclina (el período de "pulso" durante el cual se marcan las células que expresan TERT), estas células se convertirán en células mGFP + marcadas indeleblemente, que se pueden rastrear durante cualquier cantidad de tiempo deseable después de la eliminación de doxiciclina (el período de "persecución"), incluso si la expresión de Tert se pierde posteriormente. Los cerebros se fijan y procesan para la inmunofluorescencia y otras aplicaciones posteriores con el fin de interpretar los cambios en la activación de las células madre, la proliferación, el compromiso de linaje, la migración a varios nichos cerebrales y la diferenciación a tipos de células maduras. Usando este sistema, cualquier ratón rtTA se puede acoplar a oTet-Cre y un reportero Rosa para llevar a cabo experimentos de rastreo de linaje de "persecución de pulso" inducibles por doxiciclina utilizando marcadores de células madre.

Introducción

Valor de una línea de ratón de seguimiento de linaje
El análisis de células madre in vivo puede ser difícil ya que muchos ensayos que examinan dichas células solo se centran en caracterizar estas células en el momento de la muerte del animal, lo que representa una instantánea terminal en el tiempo. Para comprender mejor los procesos de proliferación, diferenciación y migración de progenitores, tipos de células intermedias /de transición y células maduras a lo largo del tiempo, se requiere un enfoque de análisis longitudinal. Esto se puede lograr con estudios de rastreo de linaje en los que las células madre/progenitoras se marcan indeleble....

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de Ohio.

1. Creación de una línea de ratón Tet-On de rastreo de linaje, estrategias de reproducción y genotipado para ratones de cohorte experimentales

NOTA: Aquí, describimos la creación de un sistema de ratón Tet-On con Rosa-mTmG como el gen reportero fluorescente que se somete a la recombinación Cre, sin embargo, varias otras líneas reporteras impulsadas por la recombinación Cre también se pueden utilizar con el sistema Tet-On.

1. Establezca una ....

Resultados

Si bien la señal fluorescente resultante de un sistema Tet-On con un reportero fluorescente variará dependiendo del promotor de interés y los fluoróforos utilizados, describiremos cómo se analizaron los hallazgos con animales mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. El análisis de cerebros adultos después de una persecución de pulsos dio como resultado células que expresan GFP de membrana en varios nichos anatómicos. Se debe tener en cuenta la diferencia en la intensidad fluorescente entre varios tipos de células. Una.......

Discusión

Se describe un método para la creación, utilización y análisis de una línea de ratón de rastreo de linaje transgénico triple que marca las células madre dentro del cerebro del ratón adulto in vivo. Cuando se combina con la inmunotinción o la limpieza cerebral, se puede lograr la identificación y caracterización de células fluorescentes trazadas en todo el cerebro. Esta técnica ofrece la capacidad de comprender el potencial plástico / regenerativo / remodelante de las células madre marcadas a medi.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody diluent	Agilent	S080983-2
Antigen Retrieval Solution	Agilent	S2367
anti-GFP antibody	Invitrogen	A2311	Use at 1:500-1:000
Acetone	Fisher Scientific	A18-4
B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J	The Jackson Laboratory	JAX:006234
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J	The Jackson Laboratory	JAX:007676
Blocking Solution (IHC)	Millipore Sigma	20773
Blunt needle	BSTEAN	X0012SYHIV
Coronal brain block	Braintree	BS-2000C
Cover slip	Corning	2850-22
Cryostat	Leica	CM1900
DAPI	Sigma-Aldrich	D564
Dibenzyl ether	Millipore Sigma	33630
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
Donkey Serum	Sigma-Aldrich	D9663
Doxycycline Hyclate	Sigma-Aldrich	D9891
Glycine	Bio-Rad	161-0718
Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa	Sigma-Aldrich	H3393
Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative	Amresco	H120	This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)
Hydrogen Peroxide Solution	Sigma-Aldrich	516813
IHC Select TBS Rinse Buffer	Millipore Sigma	20845
Ketamine	Westward	0143-95095-10	This product requires a DEA license for storage and use.
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Milipore Block	Millipore	20773
Mounting medium	Millipore Sigma	5013
Optimal Cutting Temperature Solution	Sakura	4583
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
PBS Solution (10X)	Teknova	P0496
Sagittal brain block	Braintree	RBM-2000S
Saline	Braun	S8004-5264
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Sudan (Typogen) Black	Millipore Sigma	199664
Tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	186562
Tissue cartridge	Simport	M512
Triton X-100	Bio-Rad	1610407
Tween-20	Millipore Sigma	655205
Xylazine	AnaSed	sc-362950Rx