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Resumo

A capacidade de marcar permanentemente células-tronco e sua prole com um fluoróforo usando uma linhagem transgênica indutível que traça a linhagem do mouse permite a análise espacial e temporal de ativação, proliferação, migração e/ou diferenciação in vivo. O rastreamento de linhagem pode revelar novas informações sobre o comprometimento da linhagem, a resposta à intervenção e a multipotência.

Resumo

Uma linhagem reversa de transcriptase (Tert) foi desenvolvida para investigar o comportamento e o destino das células-tronco de tecido adulto, cruzando o sistema 'Tet-On' oTet-Cre mouse com um novo transactivador de tetraciclina reversa (rtTA) transgene ligado ao promotor tert, que demonstramos uma nova população de células-tronco cerebrais adultas. Aqui, a administração da doxiciclina derivada de tetraciclina para mTert-rtTA::oTet-Cre marcará indelévelmente uma população de células que expressam um fragmento de 4,4 kb da região promotora do gene Tert. Quando combinados o repórter Rosa-mTmG, mTert-rtTA:::oTet-Cre::Rosa-mTmG ratos expressarão membrana tdTomato (mTomato) até que o tratamento da doxiciclina induz a substituição da expressão mTomato por membrana EGFP (mGFP) em células que também expressam Tert. Portanto, quando esses camundongos de rastreamento de linhagem tripla-transgênica recebem doxiciclina (o período de "pulso" durante o qual as células expressas tert são marcadas), essas células se tornarão indelibavelmente marcadas células mGFP+, que podem ser rastreadas por qualquer quantidade desejável de tempo após a remoção da doxiciclina (o período de "perseguição"), mesmo que a expressão tert seja posteriormente perdida. Os cérebros são então fixos e processados por imunofluorescência e outras aplicações a jusante, a fim de interpretar mudanças na ativação de células-tronco, proliferação, compromisso de linhagem, migração para vários nichos cerebrais e diferenciação para tipos de células maduras. Usando este sistema, qualquer mouse rtTA pode ser acoplado a oTet-Cre e um repórter Rosa para conduzir experimentos de rastreamento de linhagem "pulse-chase" indutíveis de doxiciclina usando marcadores de células-tronco.

Introdução

Valor de uma linhagem de rastreamento de linhagem linha do mouse
A análise das células-tronco in vivo pode ser difícil, já que muitos ensaios que examinam tais células só se concentram em caracterizar essas células no momento da morte do animal, o que representa um instantâneo terminal no tempo. Para entender melhor os processos de proliferação, diferenciação e migração de progenitor, tipos de células intermediárias/transitórias e células maduras ao longo do tempo, é necessária uma abordagem de análise longitudinal. Isso pode ser alcançado com estudos de rastreamento de linhagem pelos quais as células-tronco/progenitoras são marcadas indelévelmente e podem ser seguidas por qualquer período de tempo depoisde 1.

No cérebro adulto de mamíferos, o processo de neurogênese pelo qual os neurônios nascidos em adultos são criados a partir de células-tronco e progenitoras foi primeiro analisado através da retenção de rótulos com timmidina-H3 2,3,4 ou 5-bromo-2'-deoxyuridina (R$ 5,6,7,8 . Nesses estudos, as células proliferativas foram marcadas com o analógico timina, que foi incorporado ao DNA das células durante a replicação e divisão/proliferação celular. A célula marcada, bem como sua descendência, continha, portanto, este analógico, que foram então identificados após a morte. No entanto, enquanto a timmidina-H3 e a BrdU permitiram a marcação de células proliferativas e sua descendência em regiões cerebrais onde as células-tronco eram mal compreendidas, esses estudos foram dificultados pelas desvantagens dessas ferramentas. A thymidine-H3 induz a prisão do ciclo celular, apoptose e a inibição da síntese de DNA dependente de dose9, enquanto brdU marca células em níveis variados dependendo da rota da administração10 e é tomada por células durante o reparo ou apoptose, bem como durante a divisãocelular 11. Métodos de rotulagem mais eficientes têm sido utilizados recentemente, como rotulagem com 5-ethynyl-2'-deoxyuridina (EdU), mas muitos dos mesmos problemas que brdU ainda permanecem12. Essas abordagens também são limitantes na medida em que marcam qualquer célula proliferativa, não apenas células-tronco, e, portanto, a interpretação dos resultados pode ser confundida. Na linhagem neurogênica, todas as células-tronco e progenitoras retêm capacidade mitótica, e apenas neurônios terminais/maduros não são proliferativos. Para os astrócitos e microglia, mas não oligodendrocitos, a proliferação é mantida indefinidamente 13,14,15.

Camundongos transgênicos usados para fazer linhagem apenas células que expressam uma proteína de interesse, como uma confirmada para identificar células-tronco adultas como usamos aqui, tornaram-se, portanto, mais comuns ao investigar células-tronco e sua descendência. Embora difícil de gerar através de abordagens transgênicas de camundongos, linhas de mouse de rastreamento de linhagem permitem o rastreamento de células especificamente marcadas no cérebro, e não dependem apenas da proliferação. No sistema de camundongos transgênicos Tet-On, a administração de tetraciclina ou doxiciclina (um derivado de tetraciclina) induz a expressão cre-recombinase em células que foram projetadas com um transactivador de tetraciclina reversa (rtTA), que é transcrito por um promotor de interesse. A recombinação indutível de Cre indutível de Tet ativará então a expressão de uma proteína fluorescente ou luminescente indelével nas células de interesse, dependendo do rato rosa-repórter empregado. Essas células indelibavelmente marcadas continuam a expressar este repórter após divisão, diferenciação ou migração, permitindo o rastreamento dessas células e sua descendência ao longo do tempo ou após diferentes intervenções16. As vantagens das abordagens transgênicas de rastreamento de linhagem incluem: 1) especificidade do rastreamento a uma determinada linhagem celular ou progenitor/célula-tronco marcada pela tTA, 2) expressão indelével da proteína fluorescente ou luminescente, apesar da rotatividade ou diferenciação celular, 3) baixa toxicidade, 4) ativação condicional durante qualquer ponto do ciclo de vida do animal, e 5) facilidade de uso com ensaios comuns, incluindo imunossaluscência/imunofluorescência16.

Outros métodos de ferramentas de repórteres temporalmente indutíveis em camundongos incluem o uso de ratos Cre-ERT2, que podem ser emparelhados com ROSA-GFP, ROSA-mTmG ou outros transgenes fluorescentes. Nesses animais, um elemento regulatório específico para células, como um promotor ou região de interesse melhorador, impulsiona a produção de Cre recombinase, que só pode ser ativada através da administração de tamoxifen. Enquanto as linhas de camundongos Cre-ERT2 permitem a indução de Cre em linhas celulares específicas, há uma riqueza de conhecimento detalhando os efeitos do tamoxifen na neurogênese adulta17,18. Além disso, existem muitos genes de repórteres fluorescentes orientados por ROSA que podem ser utilizados em vez de GFP ou mTmG, incluindo YFP ou CFP, o que permitiria rotulagem fluorescente alternativa em outros comprimentos de onda fluorescentes. Estes genes fluorescentes de repórteres podem ser usados com sistemas Tet-On ou Cre-ERT2.

Telomerase reverse transcriptase (TERT) é o componente limitante de taxa da holoenzima telomerase, que trabalha para estender telômeros depois de encurtados durante a divisãocelular 19,20. TERT foi identificado como um marcador de células-tronco de tecido adulto no intestino21,22, medula óssea21, fígado23, adiposo24, endométrio25,26 e osso1. Ainda não se sabe se a expressão TERT nessas células-tronco adultas é unicamente para atividade de extensão de telomerase ou para desempenhar papéis tert nãocanônicos 27. Células-tronco adultas quiescentes (qASCs) que expressam TERT foram identificadas e traçadas em todo o corpo com camundongos de linhagem transgênica para estudar a capacidade de multipotência e autoconexação dessas células-tronco, bem como seu potencial de ativar, proliferar, diferenciar e migrar 1,22,23,28. A criação do transgene Tert-rtTA foi realizada anteriormente1. Neste artigo, descreveremos o uso de uma linhagem traçando linhagem da linhagem tert linha de mouse para estudar TERT + qASCs que identificamos como uma nova população ASC no cérebro de camundongo adulto.

Geração de linhagem transgênica traçando linha do mouse
Para gerar uma linhagem de mouses com rastreamento de linhagem usando o sistema Tet-On, três transgenes devem ser combinados dentro de um único animal através do acasalamento do rato. A primeira é uma rtTA, expressa sob o controle do promotor do gene de interesse (o nosso é TERT-rtTA). Em uma célula que expressa esse gene de interesse, o rtTA será, portanto, expresso. O segundo é um gene oTet-Cre, que contém um elemento de resposta tetraciclina (TRE) que permitirá a transcrição de Cre recombinase na presença de uma transcrição de fusão rtTA e tetraciclina ou doxiciclina. Tetraciclina ou doxiciclina podem ser administradas a um animal através de água potável ou chow29. Finalmente, deve haver um gene que será ativado por Cre recombinase decote. Neste manuscrito, o gene de rotulagem que descreveremos é o gene Rosa26-mTmG, que até a recombinação de Cre transcreverá onipresentemente mTomato (fluorescência vermelha de membrana em todas as células). No entanto, se uma célula expressa a transcrição rtTA e contém tetraciclina ou doxiciclina, a recombinação de cre de um conjunto de locais lox P entre os locais mTomato e mGFP mudará o local R26 e fará com que a célula produza membrana EGFP (mGFP, ou fluorescência verde de membrana) em vez de tomate de membrana. A natureza indelével deste sinal mGFP permitirá a rotulagem in vivo e o rastreamento das células à medida que proliferam, migram e diferenciam. Seguindo o rastreamento, as células podem ser analisadas para expressão de GFP via imunofluorescência em crioseções padrão ou cérebros mais espessos odocendo opticamente.

Neste artigo, descreveremos o uso da linha específica do mouse, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Para criar esta linha de camundongos transgênicos triplos, primeiro acasalamos animais oTet-Cre (The Jackson Lab strain #006234) para animais Rosa-mTmG (The Jackson Lab strain #007676) para criar oTet-Cre::Rosa-mTmG camundongos transgênicos duplos. Estes animais foram genótipados com primers e modelos PCR indicados nas Tabelas Suplementares 1 e 2. os camundongos mTert-rtTA (criados por David Breault1) foram acasalados para animais oTet-Cre::Rosa-mTmG para criar mTert-rtTA:::oTet-Cre::Rosa-mTmG ratos (Figura 1A)1,30. O mecanismo de ação da linha de mouse mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mouse line é ilustrado na Figura 1B.

Indução de doxiciclina e design de perseguição de pulso
Ao planejar experimentos, é importante considerar vários fatores que afetarão o resultado de experimentos de rastreamento de linhagem, incluindo a idade do animal na indução de doxiciclina, o tempo de administração da doxiciclina (o período de "pulso"), o tempo após a remoção da doxiciclina antes da coleta de tecidos (o período de "perseguição"), e o tempo de qualquer intervenção durante esses processos. Essas considerações de design do estudo são essenciais para a compreensão das células rotuladas e de sua descendência na conclusão do experimento. O primeiro passo do processo é identificar a idade de interesse do animal e a duração da administração doxiciclina. Períodos de pulso mais longos permitirão que o potencial de mais células expressem que o promotor vinculado ao RTTA seja expresso e mais células de interesse sejam marcadas indelibavelmente. Um tipo de célula que exibe expressão transitória do gene de interesse pode exigir um período de pulso mais longo do que células que expressam continuamente o gene de interesse. No entanto, se o objetivo do estudo é entender os efeitos de curto prazo da célula de interesse ou uma intervenção aguda, o período de pulso não pode ser muito longo, pois uma vez que uma célula é marcada, ela será rastreada através de qualquer número de alterações durante o restante do período de pulso. Em alguns de nossos estudos, um pulso de 2 dias sem período de perseguição foi usado para imitar mais de perto um repórter direto para tert. Isso porque o tempo mínimo de recombinação do gene Rosa-mTmG é de 2 dias31.

O próximo período essencial em um experimento de perseguição de pulso é o comprimento entre a remoção da doxiciclina e a perfusão do animal, também conhecido como a "perseguição". A meia-vida da doxiciclina em camundongos é de aproximadamente 170 minutos, independentemente da rota de administração, permitindo a conclusão de que a indução de doxiciclina provavelmente não ocorre mais várias horas após a remoção32. No entanto, é importante notar que o metabolismo da doxiciclina é mais lento em camundongos idosos, o que pode levar a períodos de "pulso" mais eficazes do que animais jovens33.

Durante o período de perseguição, as células rotuladas continuarão a ser rotuladas, mesmo após a proliferação, diferenciação ou migração. A prole dessas células também será rotulada. O objetivo do estudo moldará o comprimento do paradigma de perseguição de pulso. Se o objetivo do estudo é entender a regeneração de um tecido durante um longo período de tempo com as células de interesse, um longo período de perseguição pode ser necessário. Por fim, deve-se decidir o tempo de quaisquer intervenções ou tratamentos. A administração durante o período de pulso afetará as células que expressam o gene de interesse, bem como qualquer prole criada durante este tempo, enquanto a administração durante o período de perseguição pode afetar principalmente a prole das células de interesse, embora isso dependa da rapidez com que as células rotuladas se dividem ou se diferenciam. Exemplos de projetos experimentais de perseguição de pulso que utilizamos estão descritos na Figura 2A.

Também é importante estar ciente da possibilidade de sinal GFP de fundo devido à expressão vazada. A expressão de vazamento ocorre como resultado do potencial de ligação inerente entre as sequências de TR ET na ausência de doxiciclina e atividade residual do transgene Otet na ausência de tTA (revisado em34). A expressão de vazamento representa uma fraqueza dos sistemas Tet, e embora o vazamento seja muitas vezes uma desvantagem aceitável para o sistema, situações em que a expressão vazada pode levar à toxicidade e mortalidade, como com a toxina de difteria (DTA) em animais Otet-DTA pode limitar o uso desses sistemas35.

Processamento cerebral, secção e imunofluorescência de seções finas para microscopia
Para analisar os cérebros de camundongos após um experimento de rastreamento de linhagem, os camundongos devem primeiro ser perfusados via perfusão transcárrica para remover sangue e CSF que podem levar a alta autofluorescência no cérebro. Existem dois fixativos comumente usados com os seguintes fixadores: Tecido Histochoice Fixativo, fixador glixal (GF), ou 4% paraformaldeído (PFA). Fixações glicoxais permitem um processo de fixação relativamente suave com menos ligação cruzada do que o PFA. Isso reduz a rigidez tecidual, reduz a necessidade de recuperação de antígenos e permite soluções de anticorpos menos concentradas durante a imunossuagem. No entanto, se eles contêm metanol, isso pode servir para aumentar a autofluorescência36. Por outro lado, a PFA muitas vezes permitirá uma fixação mais robusta, e enquanto a recuperação de antígenos será necessária durante a imunostaining, existem anticorpos que só funcionarão com tecidos fixos pfa, e a perfusão com 4% de PFA é necessária para a técnica de compensação óptica descrita posteriormente.

Seguir a perfusão é uma etapa pós-fixação, na qual os cérebros são imersos no mesmo tipo de fixação utilizado durante a perfusão durante a noite. Isso permite que quaisquer regiões cerebrais que possam não ter sido totalmente fixas durante a perfusão continuem a ser consertadas. Em seguida, os cérebros serão incubados em sacarose em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) para remover o máximo de água possível antes da etapa de congelamento para evitar a formação de gelo dentro do tecido ("criopreservação"). Os cérebros podem então ser cortados em qualquer número de seções de tecido sagital, coronal ou transversal para processamento. Tanto para precisão quanto para a reprodutibilidade, os blocos cerebrais calibrados precisam ser usados de forma a garantir cortes consistentes de bregma entre os animais. O fator mais importante que pode afetar a forma como os cérebros são seccionados é a região cerebral de interesse. Por exemplo, enquanto um corte sagital pode permitir que mais regiões cerebrais sejam analisadas em uma seção de tecido, este corte não permitirá a análise de regiões neuro/gliogênicas da zona ventricular-subventricular (V-SVZ) como os lados lateral e medial do ventrículo lateral serão impossíveis de discernir nessa dimensão e são melhor observados no plano coronal. Esta pode ser uma distinção importante a ser vista em estudos de neurogênese adulta, já que o lado lateral do ventrículo lateral contém o V-SVZ neurogênico, enquanto a parede medial do ventrículo lateral é um nicho mais gliogênico37.

Depois que os tecidos forem divididos em seções coronais, sagiais ou transversais, eles serão congelados em blocos usando a solução de incorporação da Temperatura de Resfriamento Ideal (OCT). Aqui, os cérebros são congelados dentro deste material de incorporação, com o uso de uma mistura de gelo seco e etanol. Se for necessária uma análise fina da seção, os blocos serão cortados em um criostat e, dependendo da análise a jusante necessária, podem ser aderidos a lâminas de vidro carregadas positivamente como seções finas (<20 μm). Slides de vidro que não são carregados também podem ser usados, mas o uso de lâminas não carregadas pode resultar em tecidos se desprenderem dos slides38. Se forem necessárias seções de tecido flutuante de média espessura (>20 μm), os tecidos serão coletados como seções flutuantes livres. Se forem necessárias seções grossas (0,5-4 mm), é necessário cortar seções cerebrais não congeladas com vibratome. É importante observar as diferenças de armazenamento entre as seções em slides, que requerem congelamento de -20 a -80 °C e seções flutuantes livres, que serão armazenadas a 4 °C.

Limpeza cerebral e microscopia confocal de montagem completa
Se uma análise mais ampla, mas menos detalhada das células traçadas de linhagem no cérebro do camundongo for desejada, uma análise abrangente de segmentos mais espessos do tecido cerebral é possível com o esclarecimento cerebral iDISCO39 seguido de microscopia confocal de imunostaining e tiled z-stack ou microscopia de folha de luz. Aqui, grandes seções do cérebro do rato serão apagadas opticamente (um processo de delipidação39), o que permite melhor a imagem de sinal fluorescente em uma seção de tecido de 1 mm. As desvantagens desse processo são a alta autofluorescência e a diminuição da capacidade de obter imagens de alta resolução da morfologia celular e análise detalhada de co-coloração devido ao aumento das distâncias de trabalho necessárias quando comparadas aos métodos mais tradicionais (crioseções finas ou seções flutuantes livres). Por essa razão, recomendamos a limpeza cerebral para analisar os resultados de rastreamento de linhagem em larga escala em várias áreas cerebrais, em vez de tentar caracterizar ou analisar células individuais.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Estadual de Ohio.

1. Criação de uma linhagem traçando linhagem Tet-On linha de camundongos, estratégias de reprodução e genotipagem para camundongos de coorte experimental

NOTA: Aqui, descrevemos a criação de um sistema de mouse Tet-On com Rosa-mTmG como o gene repórter fluorescente que sofre recombinação da Cre, no entanto várias outras linhas de repórter orientadas à recombinação de Cre também podem ser utilizadas com o sistema Tet-On.

  1. Configure uma gaiola de acasalamento de um macho oTet-Cre (+/-) masculino com uma ou mais fêmeas R26 (mTmG) (+/+). Consulte a Figura 1 para obter uma visão geral da configuração experimental de acasalamento do mouse.
  2. Os filhotes resultantes (F1) serão oTet-Cre (+/-) ou oTet-Cre (-/-) e R26 (mTmG) (+/-). Realizar genotipagem de acordo com os primers na Tabela Suplementar 1 e protocolos na Tabela Suplementar 2.
  3. No desmamar, realize testes de germes tomando um soco de orelha de cada desmamar. Examine o soco do ouvido sob um microscópio epifluorescente no espectro GFP/FITC para determinar se o animal havia sofrido uma recombinação germinal em desenvolvimento. Se assim for, o animal expressará GFP em todas as células, e o soco no ouvido irá fluorescer com sinal mGFP. Esses animais não podem ser usados para acasalamentos ou experimentos.
    NOTA: Clipes de ouvido de camundongos que não são germinos mostram apenas fluorescência endógena sob o microscópio (Figura 1C), enquanto animais germinados mostram um sinal GFP brilhante (Figura 1D). As orelhas de controle podem ser de camundongos que não contêm transgenes fluorescentes. Como nota, os pelos de ouvido têm fluorescência endógena alta e não devem ser usados como fator determinante (Figura 1C). Além disso, diferenças na fluorescência endógena são observadas entre ratos de cor de white vs. preto casaco, e os controles de camundongos da mesma cor de casaco que os ratos que estão sendo testados precisarão ser usados nesta análise.
  4. Mate um macho oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/-) com um ou mais camundongos oTet-Cre (-/-) x R26 (mTmG).
  5. A geração resultante (F2) será de 1/4 R26 (mTmG) (+/+) e 1/2 Cre (+/-). Cruze esses animais com animais mTert-rtTA (+/+) acasalando um animais oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) com um ou mais animais mTert-rtTA (+/+).
    NOTA: Usamos animais mTert-rtTA (+/+), mas esse processo pode ser realizado com qualquer linha de mouse rtTA30.
  6. Para animais experimentais, configure criações para gerar mTert-rtTA (+/+) ou (+/-) x oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) ou (+/-).

2. Indução de doxiciclina da Cre e design de perseguição de pulso

  1. Quando os animais estiverem na idade correta para o início do estudo, substitua sua água potável por água dox: água potável contendo 5% de sacarose e 2 mg/mL de doxilalina. Use animais Cre-negativos que recebem o mesmo pulso-perseguição doxiciclina como animais experimentais como um grupo de controle para os padrões de expressão fluorescentes resultantes.
    1. Após a preparação, armazene água dox a 4 °C por até 1 mês. Consulte a Tabela 1 para obter mais informações. A água dox pode ser administrada aos animais em garrafas de bebida por até 5 dias antes de ser alterada, pois o crescimento fúngico pode ocorrer se a água dox for deixada de fora em temperatura ambiente por períodos mais longos de tempo.
      NOTA: É necessário um pulso de doxiciclina de pelo menos 2 dias para a indução do sinal mGFP ao utilizar o transgene mTmG (papel mTmG inicial).
      NOTA: Não testamos concentrações de doxiciclina que não sejam 2 mg/mL. A literatura anterior identificou que essa concentração tem os maiores efeitos quando administrada através da água potável29. A quantidade de doxiciclina entregue pode diferir dependendo da quantidade de bebida feita por cada animal. A injeção de doxiciclina ou gavage também pode ser feita para ser consistente entre os animais40.
  2. Após o término do período de pulso, remova a água dox das gaiolas e substitua com água potável normal. Os animais estarão agora no período de "perseguição" até a morte.

3. Perfusão transcárvia e dissecção cerebral

  1. Remova um rato de sua gaiola e contenha o animal usando o polegar esquerdo e o dedo indicador. Injete o animal através de injeção intraperitoneal (i.p.) com uma solução de 100 mg/mL de cetamina e 20 mg/mL de xilazina em soro fisiológico 0,9% estéril para uma concentração final de 200 mg/kg de cetamina e 20 mg/kg de xilazina. Consulte a Tabela 1 para obter mais informações.
    ATENÇÃO: Os protocolos para anestesia podem diferir dependendo do país. Além disso, há efeitos de anestésicos no cérebro, incluindo alterações na morfologia e ação microglial e níveis de corticosterona que devem ser entendidos ao realizar perfusões para fins de coleta e análise cerebral41,42.
  2. Após aproximadamente 1-2 min, o animal perderá seu reflexo de direito. Para testar isso, basta rolar o animal de costas e se ele não puder voltar para seus pés, ele perdeu o reflexo de direita.
  3. Depois de aproximadamente 5-10 min o animal perderá seu reflexo do pedal. Para verificar o reflexo do pedal, use o polegar e o dedo indicador para beliscar cada um dos pés do animal. Se não houver resposta, na forma de um salto ou espasmo muscular, use as unhas do polegar e do dedo indicador para beliscar cada um dos pés do animal. Se não houver resposta, o animal perdeu o reflexo do pedal.
    NOTA: Se o animal responder ao reflexo do pedal por mais de 15 minutos após a injeção, pode ser necessária uma injeção adicional de 1/2 da injeção inicial de cetamina/xilazina. Idade, sexo, genótipo, fenótipo e tratamento podem afetar a resposta do animal a este coquetel de drogas.
  4. Após a perda do direito e do pedal, teste o reflexo ocular entrando em contato levemente com o globo ocular do rato com um dedo enluvado. A falta de resposta indica que o reflexo ocular foi perdido.
  5. Fixar o mouse em uma posição supina com patas presas a uma superfície de trabalho pinável.
  6. Faça uma incisão através da pele com uma tesoura cirúrgica ao longo da linha média torácica aproximadamente 1-2 cm abaixo do processo xifoide. Corte superior até no processo xiphoide.
  7. Segure a cartilagem do processo xifoide com fórceps. Insira a tesoura e corte através da musculatura e da caixa torácica diagonalmente ao longo do lado direito do mouse ao nível das clavículas.
    1. Levante a musculatura torácica com fórceps e corte o diafragma até que o coração possa ser visualizado. Em seguida, faça um corte diagonal idêntico ao longo do lado esquerdo do mouse, certificando-se de evitar qualquer contato com o coração. Use um hemostat para manter a musculatura torácica longe da cavidade.
      NOTA: Neste momento, o mouse não será capaz de respirar por mais tempo, por isso trabalhe rapidamente para evitar a morte antes dos próximos passos.
  8. Fixar o coração batendo com fórceps contundentes e inserir uma agulha de distribuição no ventrículo esquerdo através da base do arco aórtico.
  9. Fixar a base da agulha no ventrículo esquerdo logo acima do local de inserção.
  10. Faça uma incisão no átrio direito, e ao primeiro sinal de fluxo sanguíneo, comece a perfundar o animal com 20 mL de 1x PBS a 8,11 mL/minuto.
  11. Depois que o PBS 1x tiver perfundido o corpo, mude para o fixador apropriado para a aplicação a jusante e perfunda o mouse com 20 mL de fixação.
    1. Para secção congelada e imunostenção, perfunde animal com o fixador glixal para limpeza cerebral, perfuse animal com 4% PFA em 1x PBS (pH 7.4).
      NOTA: Os sinais de uma perfusão bem sucedida incluem rigidez animal (leve rigidez com glicoxal, rigidez intensa com PFA) e falta de vasos sanguíneos visíveis em todos os tecidos.
  12. Decapite o rato e remova o cérebro inserindo tesouras no tronco cerebral e cortando ao longo da sutura escamosa até a sutura frontomaxilar de cada lado. Em seguida, corte a sutura fontonasal para remover a tampa do crânio, tomando cuidado para não danificar a lâmpada olfativa. A partir daí, vire o crânio de cabeça para baixo, e use fórceps curvos para remover o cérebro, certificando-se de cortar o nervo óptico.
  13. Coloque o cérebro perfumado em um cartucho de tecido e mergulhe no fixador usado para perfumar o animal durante a noite a 4 °C.

4. Tratamento cerebral, corte e imunossamento

  1. Tratamento cerebral e corte de cérebros
    1. Remova os cartuchos cerebrais do fixador glixal e incubar em 15% de sacarose em 1x PBS por 2 dias a 4 °C ou até que os cérebros afundem.
    2. Remova os cartuchos cerebrais de 15% de sacarose e incubar em 30% de sacarose em 1x PBS por 2 dias a 4 °C ou até que os cérebros afundem.
      NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter mais informações.
    3. Remova cérebros de 30% de sacarose em 1x PBS e separe o cérebro em vários "blocos" usando um bloco cerebral coronal ou bloqueio cerebral sagital.
    4. Incorpore seções cerebrais coronais ou sagiais em compostos oct, colocando seções cerebrais em uma mistura de gelo seco e etanol (EtOH). Depois que o OCT ficar branco e ficar sólido, retire da mistura de gelo seco-EtOH e armazene embrulhado em parafilm, dentro de um saco de ar apertado a -20 °C.
    5. Retire os blocos congelados do congelador e coloque dentro de um criostat com uma temperatura interna definida para -20 °C. Use o OCT para fixar o bloco a um mandril de metal para que o tecido esteja solidamente preso. Deixe ~5 min para o tecido congelar até o mandril. Corte o tecido a 7 μm, colocando cada fatia de tecido em uma lâmina de vidro carregada.
    6. Deixe os slides assarem durante a noite a 37 °C e, em seguida, coloque a -20 °C até que seja usado para imunostaining.
  2. Imunostaining
    1. Slides quentes para temperatura ambiente (RT) e pós-fixação com acetona gelada por 15 minutos.
    2. Lave os slides por 5 min em 1x de tampão de lavagem (por exemplo, IHC Select TBS Rinse Buffer), tremendo a 60 rpm no RT entre cada etapa.
    3. Permeabilize para coloração de antígenos nucleares com Triton X-100 de 0,3% por 10 min na RT. Permeabilize para coloração de antígenos citoplasmados com 0,3% Tween-20 por 10 min na RT.
    4. Realize a recuperação de antígenos por slides de micro-ondas em 50-100 mL de 1x SOLUÇÃO DE Recuperação de Antígeno DAKO em baixo por 10 minutos, duas vezes. Em seguida, enxágue com tampão de lavagem por 5 min no RT.
    5. Incubar slides em 0,3% Typogen Black em 70% EtOH por 20 min na RT e depois lavar com tampão de enxágue.
    6. Desenhe uma barreira hidrofóbica ao redor de cada tecido sem permitir que os tecidos sequem. Em seguida, bloqueie por 20 minutos a 37 °C com 1 gota de Reagente de Bloqueio de Millipore por tecido. Em seguida, adicione 100 μL de anticorpo primário diluído em anticorpos diluídos a cada tecido e incubar durante a noite a 4 °C.
    7. No dia seguinte, incubar seções em anticorpos secundários Alexa Fluor por 10 minutos na RT. Em seguida, lave slides no tampão de enxágue.
    8. Cubra seções cerebrais em 100 μL de 1:500 anticorpo anti-GFP conjugado ao AlexaFluor 488 para aumentar a marcação de sinal cionógeno GFP e incubar durante a noite a 4 °C.
    9. No dia seguinte, lave com o tampão de lavagem 2x e depois lave em água DI corrente por 5 minutos.
      NOTA: Certifique-se de lavar suavemente com água DI, tomando cuidado para evitar qualquer água corrente em slides que possam remover seções cerebrais de lâminas.
    10. Contra-retenção com 100 ng/mL 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) por 5 min. Em seguida, lave em água DI corrente por 5 minutos.
    11. Adicione uma gota de meio de montagem em cima de cada seção de tecido e sele com uma tampa de 22 mm x 22 mm. A imagem é recomendada no dia da montagem para garantir o sinal ideal.

5. limpeza cerebral iDISCO (adaptada a partir de39)

  1. Fixação e secção
    1. Cérebros pós-correção em 4% PFA durante a noite a 4 °C e depois novamente por 1 h no RT.
    2. Lave cérebros em 1x PBS por uma hora, duas vezes, na RT. Em seguida, corte em seções de 1 mm de espessura usando o bloco cerebral necessário e coloque em tubos de microcentrifuuge de 5 mL contendo 1x PBS.
  2. Pré-tratamento de metanol (com metanol)
    NOTA: Devido à possibilidade de o metanol impactar a imunossuagem de certas proteínas, os autores gostariam de apontar o leitor para Renier et al. 2014 para um protocolo para uma alternativa de protocolo iDISCO livre de metanol39. Consulte a Tabela 1 para obter mais informações sobre as seguintes soluções nesta seção.
    1. Lave com 1x PBS por 1h duas vezes (tremendo) no RT.
    2. Lave em 50% de metanol (em PBS) por 1h (tremendo) no RT.
    3. Lave em 80% de metanol por 1 h (tremendo) no RT.
    4. Lave em 100% de metanol por 1h duas vezes (tremendo) no RT.
    5. Amostras de alvejante com peróxido de hidrogênio de 5% (H2O2) em 20% de sulfóxido de dimetila (DMSO)/metanol (1 volume 30% H2O2/1 volume DMSO/4 volume metanol, gelo frio) a 4 °C durante a noite (agitação).
    6. Após o branqueamento, lave amostras em metanol por 1h duas vezes (tremendo) no RT.
    7. Lave em 20% DMSO/metanol por 1 h duas vezes (tremendo) no RT.
    8. Lave em 80% de metanol por 1 h (tremendo) no RT.
    9. Lave em 50% de metanol por 1h (tremendo) no RT.
    10. Lave em PBS por 1h duas vezes (tremendo) no RT.
    11. Lave em PBS/0,2% Triton X-100 por 1h duas vezes (tremendo) na RT.
  3. Imunostaining de cérebros limpos
    1. Incubar amostras em 1x PBS/0,2% Triton X-100/20% DMSO/0,3 M de glycina a 37 °C durante a noite em um agitador orbital.
    2. Bloco em 1x PBS/0,2% Triton X-100/10% soro de cabra a 37 °C por 3 dias em um agitador orbital.
    3. Lave amostras em 1x PBS/0,2% Tween-20/10 μg/mL heparin sal de sódio da mucosa suína por 1 h duas vezes a 37 °C, e, em seguida, incubar em 1x PBS/0,2% Tween-20/10 μg/mL heparina/5% soro de cabra contendo 1:500 concentração de coelho anti-GFP AlexaFluor 488 a 37 °C em um agitador orbital por 2 dias.
    4. Lave amostras em 1x PBS/0,2% Tween-20 com heparina de 10 μg/mL por 1 h a 37 °C no agitador orbital, três vezes, e depois uma vez por dia durante 2 dias.
    5. Incubar amostras durante a noite em 10 mL de 50% v/v Tetrahidrofuran (THF)/H2O em um tubo cônico de 15 mL.
    6. Incubar amostras por 1 h em 10 mL de 80% THF/H2O.
    7. Incubar amostras duas vezes por 1 h em 100% THF.
    8. Seque amostras com um lenço estéril e incubar em diclorometano até afundar até afundar no fundo do frasco (aproximadamente 40 min). Não incubar > 60 min.
      NOTA: Certifique-se de manusear diclorometano sob um capô de fumaça.
    9. Incubar amostras em 18 mL de éter dibenzyl (DBE) até limpar (>2 h).
    10. Armazene amostras em DBE na RT até ficar pronto para a imagem.
      NOTA: Para obter melhores resultados, é importante que as amostras de imagem sejam as amostras o mais rápido possível após a limpeza estar concluída.

6. Imagem de lâminas manchadas ou cérebros limpos

  1. Para imagem de seções cerebrais imunossutives, analise slides via microscopia confocal, onde a co-expressão de múltiplos anticorpos pode ser confirmada. Usamos um microscópio Leica Stellaris 5 com detectores híbridos HyD S, mas qualquer ponto de varredura do microscópio confocal funcionará. Os objetivos incluem o HC PL APO 10x/0,40 CS2, HC PL APO 40x/1,30 OIL CS2 e HC PL APO 63x/1.40.
    1. Configure as linhas laser corretas e filtros de emissão. Os lasers necessários e as intensidades de laser correspondentes estão sujeitos às combinações de microscópio e fluorforeiros que estão sendo usadas.
      NOTA: Utilizamos uma combinação de lasers de luz branca de diodo de 405 nm e branco para ajustar a excitação e os espectros de emissão para cada fluoróforo, ou grupos de fluoroforos, sendo usados para reduzir e eliminar o crosstalk. Resultados semelhantes podem ser alcançados usando combinações tradicionais de laser/filtro, mas prestem muita atenção ao sangramento do canal. O sangramento pode ser identificado ligando uma única linha laser em conjunto com cada uma das combinações desejadas de filtro de emissão para ver quais canais são impactados por cada laser específico. Por exemplo, se o laser de diodo de 405 nm está produzindo fluorescência visível no filtro de emissão de GFP, há sangramento através do ocorrido. Certifique-se de que vários canais sejam imagens sequencialmente quadro a quadro para reduzir consideravelmente qualquer sangramento através da ocorrência.
    2. Para cérebros Tet-On co-manchados com um repórter mTmG, selecionar DAPI (ex. 405 nm, em. 450 nm), GFP (ex. 488 nm, em. 509 nm), tdTomato (ex. 555 nm, em. 582 nm) e o fluorophore vermelho correspondente para combinar com o fluorophore usado no anticorpo secundário. Recomendamos Alexa Fluor 647 (ex. 651 nm, em. 667 nm).
    3. Estabeleça as configurações primeiro com um cérebro de controle cre manchado com gfp e o secundário fluorescente. Essas fatias cerebrais controlarão a fluorescência de fundo dos anticorpos fluorescentes e não mostrarão nenhum sinal GFP real.
    4. Analise cada seção cerebral de cima para baixo, da esquerda para a direita, para verificar se nenhum sinal foi perdido na análise. Se a imagem da mesma seção cerebral em várias ampliações, recomenda-se que as ampliações mais baixas sejam utilizadas primeiro, pois a ampliação mais alta irá branquear mais rapidamente o sinal mTomato.
  2. Para cérebros limpos de imagem, use um microscópio confocal invertido com um estágio automatizado e função de revestimento automatizado. Usamos o microscópio Leica Stellaris 5. Como as amostras são tão grossas (>500 μm), são necessárias maiores distâncias de trabalho que limitam a ampliação que pode ser efetivamente alcançada. Utilizamos o hc PL APO 10x/0.40 CS2 objetivo para todas as imagens cerebrais liberadas.
    1. Comece colocando uma seção cerebral limpa plana contra um prato de fundo de vidro e submerse em éter dibenzyl.
      NOTA: O éter dibenzyl é corrosivo para a maioria das lentes objetivas e da maioria dos plásticos. Por essa razão, qualquer plástico interior na placa de fundo de vidro precisa ser revestido com elastômero de silicone de secagem rápida.
    2. Configure as linhas laser corretas e filtros de emissão. Para cérebros Tet-On co-manchados com um repórter mTmG, selecione DAPI, GFP, tdTomato, e o fluoróforo vermelho correspondente para combinar com o fluorophore usado no anticorpo secundário. Defina a resolução desejada, recomendamos pelo menos 1024 x 1024. Coloque pinhole para 1 UA.
    3. Estabeleça a intensidade do laser e o ganho do detector primeiro com um cérebro de controle cre manchado com gfp e o secundário fluorescente. Essas fatias cerebrais controlarão a fluorescência de fundo dos anticorpos fluorescentes e não mostrarão nenhum sinal GFP real.
    4. Uma vez que as intensidades de laser e o ganho do detector tenham sido otimizados, mapeie o cérebro para imagens. Comece localizando todo o perímetro da seção cerebral para definir o eixo X e Y da aquisição da imagem. Em seguida, identifique o eixo Z definindo o ponto focal para aproximadamente a profundidade central do tecido e use controles de posicionamento Z para localizar o ponto "mais alto" do tecido (valor Z mais positivo). Escaneie várias regiões do tecido aumentando a altura máxima do eixo Z conforme necessário.
      1. Repita para o ponto "mais baixo" (mais negativo de valor Z) necessário para obter toda a espessura do tecido. O Stellaris 5 tem um limite de ± 250 um do ponto focal. Isso limita as seções ópticas a 500 μm de espessura no eixo Z. A área 3D da seção cerebral agora é conhecida.
    5. Defina o tamanho da etapa Z para 6 μm e comece a adquirir a imagem. O tempo de aquisição depende de vários fatores e pode variar de horas a dias, dependendo dos parâmetros desejados. Para diminuir o tempo de aquisição de imagens, tente diminuir as resoluções, aumentando a velocidade de varredura a laser ou aumentando o tamanho do passo.
    6. Uma vez que a imagem de azulejo de toda a seção cerebral limpa tenha sido capturada, analise como desejado.

Resultados

Embora o sinal fluorescente resultante de um sistema Tet-On com um repórter fluorescente varie dependendo do promotor de interesse e fluoróforo(s) usado, descreveremos como os achados foram analisados com animais mTert-rtTA:::oTet-Cre::Rosa-mTmG animais. A análise dos cérebros adultos após uma perseguição de pulso resultou em células expressas por GFP de membrana em vários nichos anatômicos. Deve-se notar a diferença na intensidade fluorescente entre vários tipos de células. Uma variável em relação à int...

Discussão

Um método para a criação, utilização e análise de uma linhagem transgênica tripla traçando células-tronco de marcação de camundongos dentro do cérebro de camundongo adulto in vivo é descrito. Quando combinado com imunostaining ou limpeza cerebral, a identificação e caracterização de células fluorescentes rastreadas em todo o cérebro podem ser realizadas. Esta técnica oferece a capacidade de entender o potencial plástico/regenerativo/remodelação das células-tronco rotuladas à medida que a...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores desejam agradecer à Dra. Diana Carlone (Hospital Infantil de Boston, Harvard Medical School) e Dr. Matthew Lynes (Joslin Diabetes Center; Instituto de Pesquisa do Centro Médico do Maine) para orientação utilizando animais mTert-rtTA.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibody diluentAgilentS080983-2
Antigen Retrieval SolutionAgilentS2367
anti-GFP antibodyInvitrogenA2311Use at 1:500-1:000
AcetoneFisher ScientificA18-4
B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/JThe Jackson LaboratoryJAX:006234
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/JThe Jackson LaboratoryJAX:007676
Blocking Solution (IHC)Millipore Sigma20773
Blunt needleBSTEANX0012SYHIV
Coronal brain blockBraintreeBS-2000C
Cover slipCorning2850-22
CryostatLeicaCM1900
DAPISigma-AldrichD564
Dibenzyl etherMillipore Sigma33630
DichloromethaneSigma-Aldrich270997
Dimethyl SulfoxideSigma-AldrichD8418
Donkey SerumSigma-AldrichD9663
Doxycycline HyclateSigma-AldrichD9891
GlycineBio-Rad161-0718
Heparin Sodium Salt from Porcine MucosaSigma-AldrichH3393
Histochoice Molecular Biology Tissue FixativeAmrescoH120This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)
Hydrogen Peroxide SolutionSigma-Aldrich516813
IHC Select TBS Rinse BufferMillipore Sigma20845
KetamineWestward0143-95095-10This product requires a DEA license for storage and use.
MethanolFisher ScientificA452-4
Microscope SlidesFisherbrand12-550-15
Milipore BlockMillipore20773
Mounting mediumMillipore Sigma5013
Optimal Cutting Temperature SolutionSakura4583
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
PBS Solution (10X)TeknovaP0496
Sagittal brain blockBraintreeRBM-2000S
SalineBraunS8004-5264
SucroseSigma-AldrichS7903
Sudan (Typogen) BlackMillipore Sigma199664
TetrahydrofuranSigma-Aldrich186562
Tissue cartridgeSimportM512
Triton X-100Bio-Rad1610407
Tween-20Millipore Sigma655205
XylazineAnaSedsc-362950Rx

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