АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Способность постоянно маркировать стволовые клетки и их потомство флуорофором с использованием индуцируемой трансгенной линии, прослеживающей линию мыши, позволяет проводить пространственный и временной анализ активации, пролиферации, миграции и / или дифференцировки in vivo. Трассировка родословной может выявить новую информацию о приверженности линии, реакции на вмешательство (вмешательства) и мультипотентности.

Аннотация

Линия обратной транскриптазы теломеразы (Tert) была разработана для исследования поведения и судьбы взрослых тканевых стволовых клеток путем пересечения системы «Tet-On» oTet-Cre мыши с новым трансгеном обратного тетрациклинового трансактиватора (rtTA), связанным с промотором Трета, который, как мы продемонстрировали, отмечает новую популяцию взрослых стволовых клеток мозга. Здесь введение тетрациклинового производного доксициклина мышам mTert-rtTA::oTet-Cre позволит неизгладимо отметить популяцию клеток, экспрессирующих 4,4 кб фрагмента промоторной области гена Tert. При объединении репортера Rosa-mTmG мыши mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG будут экспрессировать мембранный tdTomato (mTomato) до тех пор, пока лечение доксициклином не вызовет замену экспрессии mTomato мембраной EGFP (mGFP) в клетках, которые также экспрессируют Tert. Поэтому, когда эти мыши с тройной трансгенной линией, отслеживающие линию, получают доксициклин («импульсный» период, в течение которого отмечаются TERT-экспрессирующие клетки), эти клетки станут неизгладимо маркированными клетками mGFP+, которые можно отслеживать в течение любого желаемого периода времени после удаления доксициклина («период погони»), даже если экспрессия Tert впоследствии теряется. Затем мозг фиксируется перфузией и обрабатывается для иммунофлуоресценции и других последующих применений, чтобы интерпретировать изменения в активации стволовых клеток, пролиферации, приверженности родословной, миграции в различные ниши мозга и дифференцировки к зрелым типам клеток. Используя эту систему, любая мышь rtTA может быть соединена с oTet-Cre и репортером Rosa для проведения экспериментов по отслеживанию линий с использованием маркеров стволовых клеток, индуцируемых доксициклином.

Введение

Значение линии мыши трассировки линии
Анализ стволовых клеток in vivo может быть затруднен, поскольку многие анализы, которые исследуют такие клетки, сосредоточены только на характеристике этих клеток в момент смерти животного, что представляет собой конечный снимок во времени. Чтобы лучше понять процессы пролиферации, дифференцировки и миграции предшественников, промежуточных / переходных типов клеток и зрелых клеток с течением времени, требуется подход продольного анализа. Это может быть достигнуто с помощью исследований трассировки линии, в результате которых стволовые /прогениторные клетки маркируются неизгладимо и могут отслеживаться в течение любого периода времени после1.

В мозге взрослых млекопитающих процесс нейрогенеза, посредством которого взрослые нейроны создаются из стволовых и прогениторных клеток, был впервые проанализирован путем удержания меток тимидином-Н3 2,3,4 или 5-бром-2'-дезоксиуридином (BrdU)5,6,7,8 . В этих исследованиях пролиферативные клетки были отмечены аналогом тимина, который был включен в ДНК клеток во время репликации и деления/пролиферации клеток. Отмеченные клетки, а также их потомство, следовательно, содержали этот аналог, который затем был идентифицирован посмертно. Однако, в то время как тимидин-Н3 и BrdU позволяли маркировать пролиферативные клетки и их потомство в областях мозга, где стволовые клетки были плохо изучены, этим исследованиям препятствовали недостатки этих инструментов. Тимидин-Н3 индуцирует остановку клеточного цикла, апоптоз и дозозависимое ингибирование синтеза ДНК9, в то время как BrdU маркирует клетки на различных уровнях в зависимости от пути введения10 и поглощается клетками во время репарации или апоптоза, а также во время деления клеток11. В последнее время используются более эффективные методы маркировки, такие как маркировка 5-этинил-2'-дезоксиуридином (EdU), но многие из тех же проблем, что и BrdU, все еще остаются12. Эти подходы также ограничиваются тем, что они отмечают любую пролиферативную клетку, а не только стволовые клетки, и, таким образом, интерпретация результатов может быть сбита с толку. В нейрогенной линии все стволовые и прогениторные клетки сохраняют митотическую способность, и только терминальные/зрелые нейроны не являются пролиферативными. Для астроцитов и микроглии, но не олигодендроцитов, пролиферация сохраняется неопределеннодолго 13,14,15.

Трансгенные мыши, используемые для отслеживания только клеток, которые экспрессируют интересующий белок, например, подтвержденный для идентификации взрослых стволовых клеток, как мы используем здесь, поэтому стали более распространенными при исследовании стволовых клеток и их потомства. Несмотря на то, что их трудно генерировать с помощью мышиных трансгенных подходов, линии отслеживания линий мыши позволяют отслеживать специфически отмеченные клетки в мозге и не полагаются только на пролиферацию. В трансгенной мышиной системе Tet-On введение тетрациклина или доксициклина (производного тетрациклина) индуцирует экспрессию cre-рекомбиназы в клетках, которые были спроектированы с помощью обратного тетрациклинового трансактиватора (rtTA), который транскрибируется интересующим промотором. Тет-индуцируемая Cre-управляемая рекомбинация затем активирует экспрессию несмываемого флуоресцентного или люминесцентного белка в интересующих клетках, в зависимости от используемой мыши Rosa-reporter. Эти неизгладимо отмеченные клетки продолжают экспрессировать этот репортер после деления, дифференцировки или миграции, что позволяет отслеживать эти клетки и их потомство с течением времени или после различных вмешательств16. Преимущества трансгенных подходов к отслеживанию линий включают: 1) специфичность отслеживания конкретной клеточной линии или предшественника/стволовой клетки, отмеченной rtTA, 2) несмываемую экспрессию флуоресцентного или люминесцентного белка, несмотря на клеточный оборот или дифференцировку, 3) низкую токсичность, 4) условную активацию в любой точке жизненного цикла животного и 5) простоту использования с общими анализами, включая иммуноокрашивание/иммунофлуоресценцию16.

Другие методы индуцируемых во времени репортерных инструментов у мышей включают использование мышей Cre-ERT2, которые могут быть сопряжены с ROSA-GFP, ROSA-mTmG или другими флуоресцентными репортерными трансгенами. У этих животных клеточно-специфический регуляторный элемент, такой как интересующая промоторная или энхансерная область, стимулирует выработку рекомбиназы Cre, которая может быть активирована только путем введения тамоксифена. В то время как мышиные линии Cre-ERT2 позволяют индукцию Cre в определенных клеточных линиях, существует множество знаний, подробно описывающих влияние тамоксифена на нейрогенез взрослых17,18. Кроме того, существует много управляемых ROSA флуоресцентных репортерных генов, которые могут быть использованы вместо GFP или mTmG, включая YFP или CFP, что позволит использовать альтернативную флуоресцентную маркировку в других флуоресцентных длинах волн. Эти флуоресцентные репортерные гены могут быть использованы с системами Tet-On или Cre-ERT2.

Теломеразная обратная транскриптаза (TERT) является ограничивающим скорость компонентом голофермента теломеразы, который работает для расширения теломер после их укорочения во время деления клеток19,20. TERT был идентифицирован как маркер взрослых тканевых стволовых клеток в кишечнике21,22, костном мозге21, печени23, жировойкислоте 24, эндометрии25,26 и кости 1. Является ли экспрессия TERT в этих взрослых стволовых клетках исключительно для активности, расширяющей теломеразу, или для выполнения неканонических ролейTERT 27, до сих пор неизвестно. TERT-экспрессирующие покоя взрослые стволовые клетки (qASCs) были идентифицированы и прослежены по всему телу с трансгенной линией, отслеживающей мышей, для изучения мультипотентности и самообновляющейся способности этих стволовых клеток, а также их способности активировать, пролиферировать, дифференцировать и мигрировать 1,22,23,28. Создание трансгена Tert-rtTA было выполнено ранее1. В этой статье мы опишем использование линии трассировки линии мыши TERT для изучения TERT + qASCs, которую мы идентифицировали как новую популяцию ASC в мозге взрослой мыши.

Генерация линии мыши трансгенной трассировки линий
Чтобы создать линию мыши с трассировкой линий с помощью системы Tet-On, три трансгена должны быть объединены в одно животное посредством спаривания мыши. Первый — ртТА, экспрессируемый под контролем промотора интересующего гена (наш — TERT-rtTA). Таким образом, в клетке, которая экспрессирует этот интересующий ген, rtTA будет экспрессироваться. Вторым является ген oTet-Cre, который содержит элемент ответа тетрациклина (TRE), который позволит транскрипцию рекомбиназы Cre в присутствии как транскрипта слияния rtTA, так и тетрациклина или доксициклина. Тетрациклин или доксициклин можно вводить животному через питьевую воду или чау29. Наконец, должен быть ген, который будет активирован расщеплением cre recombinase. В этой рукописи геном маркировки, который мы опишем, является ген Rosa26-mTmG, который до рекомбинации Cre будет повсеместно транскрибировать mTomato (мембранная красная флуоресценция во всех клетках). Однако, если клетка экспрессирует транскрипт rtTA и содержит тетрациклин или доксициклин, рекомбинация Cre набора участков lox P между сайтами mTomato и mGFP изменит сайт R26 и заставит клетку продуцировать мембранный EGFP (mGFP или мембранную зеленую флуоресценцию) вместо мембранного томата. Неизгладимый характер этого сигнала mGFP позволит in vivo маркировать и отслеживать клетки по мере их пролиферации, миграции и дифференцировки. Следуя следу, клетки могут быть проанализированы на экспрессию GFP посредством иммунофлуоресценции в стандартных криосекциях или более толстых оптически очищенных мозгах.

В этой статье мы опишем использование конкретной линии мыши mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Чтобы создать эту тройную трансгенную линию мышей, мы сначала спарили животных oTet-Cre (штамм The Jackson Lab #006234) с животными Rosa-mTmG (штамм The Jackson Lab #007676), чтобы создать двойных трансгенных мышей oTet-Cre::Rosa-mTmG. Эти животные были генотипированы с праймерами и шаблонами ПЦР, указанными в дополнительных таблицах 1 и 2. Мышей mTert-rtTA (созданных Дэвидом Бро1) спаривали с животными oTet-Cre::Rosa-mTmG для создания мышей mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG (рисунок 1A)1,30. Механизм действия линии мыши mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG проиллюстрирован на рисунке 1B.

Конструкция индукции доксициклина и импульсной погони
При планировании экспериментов важно учитывать несколько факторов, которые будут влиять на исход экспериментов по отслеживанию родословной, в том числе возраст животного при индукции доксициклина, продолжительность введения доксициклина («импульсный» период), продолжительность времени после удаления доксициклина до сбора тканей («период погони») и сроки любых вмешательств во время этих процессов. Эти соображения дизайна исследования необходимы для понимания меченых клеток и их потомства в конце эксперимента. Первым шагом в процессе является определение возраста интереса животного и продолжительности введения доксициклина. Более длительные периоды импульса позволят большему количеству клеток экспрессировать промотор, связанный с rtTA, и большему количеству клеток, представляющих интерес, быть неизгладимо отмеченными. Тип клеток, который демонстрирует преходящую экспрессию интересующего гена, может потребовать более длительного импульсного периода, чем клетки, которые непрерывно экспрессируют интересующий ген. Однако, если целью исследования является понимание краткосрочных эффектов интересующей клетки или острого вмешательства, импульсный период не может быть слишком длинным, так как как только клетка отмечена, она будет прослежена через любое количество изменений в течение оставшейся части импульсного периода. В некоторых из наших исследований 2-дневный пульс без периода погони использовался для более точной имитации прямого репортера для TERT. Это связано с тем, что минимальная продолжительность времени для рекомбинации гена Rosa-mTmG составляет 2 дня31.

Следующим существенным периодом в эксперименте по погоне за пульсом является длина между удалением доксициклина и перфузией животного, также известная как «погоня». Период полувыведения доксициклина у мышей составляет примерно 170 минут независимо от пути введения, что позволяет сделать вывод о том, что индукция доксициклина, вероятно, больше не происходит через несколько часов после удаления32. Тем не менее, важно отметить, что метаболизм доксициклина медленнее у пожилых мышей, что может привести к более длительным эффективным «импульсным» периодам, чем у молодых животных33.

В течение периода погони меченые клетки будут по-прежнему маркироваться, даже после пролиферации, дифференцировки или миграции. Потомство этих клеток также будет помечено. Цель исследования будет определять длину парадигмы погони за пульсом. Если цель исследования состоит в том, чтобы понять регенерацию ткани в течение длительного периода времени с интересующими клетками, может потребоваться длительный период погони. Наконец, должны быть определены сроки любых вмешательств или лечения. Введение в течение импульсного периода будет влиять на клетки, экспрессирующие интересующий ген, а также на любое потомство, созданное в течение этого времени, тогда как введение в период погони может повлиять в основном на потомство интересующих клеток, хотя это будет зависеть от того, как быстро меченые клетки делятся или дифференцируются. Примеры экспериментальных конструкций с импульсным преследованием, которые мы использовали, описаны на рисунке 2А.

Также важно знать о возможности фонового сигнала GFP из-за протекающей экспрессии. Протекающая экспрессия возникает в результате присущего ей потенциала связывания между rtTA и последовательностями Otet в отсутствие доксициклина и остаточной активности трансгена Otet в отсутствие rtTA (рассмотрено в34). Протекающая экспрессия представляет собой одну из слабостей систем Тета, и хотя утечка часто является приемлемым недостатком системы, ситуации, когда протекающая экспрессия может привести к токсичности и смертности, например, при дифтерийном токсине (ДТА) у животных Otet-DTA, могут ограничить использование этих систем35.

Обработка мозга, сечение и иммунофлуоресценция тонких срезов для микроскопии
Чтобы проанализировать мозг мышей после эксперимента по отслеживанию родословной, мышей необходимо сначала перфузировать с помощью транскардиальной перфузии для удаления крови и ликвора, которые могут привести к высокой автофлуоресценции в мозге. Есть два широко используемых фиксатора, с помощью которых животное может быть перфузировано: Histochoice Tissue Fixative, глиоксальный фиксатор (GF) или 4% параформальдегид (PFA). Глиоксальные фиксаторы обеспечивают относительно мягкий процесс фиксации с меньшим количеством сшивок, чем PFA. Это уменьшает жесткость тканей, уменьшает потребность в извлечении антигена и позволяет использовать менее концентрированные растворы антител во время иммуноокрашивания. Однако, если они содержат метанол, это может служить для увеличения автофлуоресценции36. С другой стороны, PFA часто обеспечивает более надежную фиксацию, и хотя извлечение антигена потребуется во время иммуноокрашивания, существуют антитела, которые будут работать только с фиксированными тканями PFA, и перфузия с 4% PFA требуется для метода оптической очистки, описанного ниже.

Следующая перфузия является этапом пост-фиксации, на котором мозг погружается в тот же тип фиксатора, который используется во время перфузии в течение ночи. Это позволяет любым областям мозга, которые, возможно, не были полностью зафиксированы во время перфузии, продолжать фиксироваться. Затем мозг будет инкубирован в сахарозе в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS), чтобы удалить как можно больше воды перед стадией замораживания, чтобы предотвратить образование льда в ткани («крио-сохранение»). Затем мозг может быть разрезан на любое количество сагиттальных, корональных или поперечных участков ткани для обработки. Как для точности, так и для воспроизводимости, калиброванные мозговые блоки должны использоваться таким образом, чтобы обеспечить последовательные порезы брегмы между животными. Наиболее важным фактором, который может повлиять на то, как разделен мозг, является область (области) мозга, представляющая интерес. Например, в то время как сагиттальный разрез может позволить анализировать больше областей мозга в одном участке ткани, этот разрез не позволит проанализировать нейро/глиогенные области желудочково-субвентрикулярной зоны (V-SVZ), поскольку боковые и медиальные стороны бокового желудочка будет невозможно различить в этом измерении и лучше наблюдать в корональной плоскости. Это может быть важным различием в исследованиях нейрогенеза взрослых, поскольку боковая сторона бокового желудочка содержит нейрогенный V-SVZ, в то время как медиальная стенка бокового желудочка является более глиогенной нишей37.

После того, как ткани были разделены на корональный, сагиттальный или поперечный срезы, они будут заморожены в блоки с использованием раствора для встраивания с оптимальной температурой охлаждения (OCT). Здесь мозг замораживается в этом встраиваемом материале с использованием смеси сухого льда и этанола. Если требуется анализ тонкого сечения, блоки будут нарезаны на криостате и, в зависимости от требуемого последующего анализа, могут быть прикреплены к положительно заряженным стеклянным слайдам в виде тонких срезов (<20 мкм). Стеклянные слайды, которые не заряжены, также могут быть использованы, но использование незаряженных слайдов может привести к тому, что ткани отклеятся от слайдов38. Если требуются свободно плавающие участки тканей средней толщины (>20 мкм), ткани будут собраны в виде свободно плавающих секций. Если требуются толстые срезы (0,5-4 мм), требуется нарезка незамороженных участков мозга вибратомом. Важно отметить различия в хранении между секциями на слайдах, которые требуют замораживания при -20 - -80 °C и свободно плавающими секциями, которые будут храниться при 4 °C.

Очистка мозга и цельная иммунофлуоресцентная конфокальная микроскопия
Если требуется более широкий, но менее подробный анализ клеток с прослеживаемой линией в мозге мыши, возможен комплексный анализ более толстых сегментов ткани мозга с очисткой мозга iDISCO39 с последующим иммуноокрашиванием и мозаичной конфокальной микроскопией z-стека или световой микроскопией. Здесь большие участки мозга мыши будут оптически очищены (процесс делипидации39), что лучше позволяет получать флуоресцентную визуализацию сигнала на участке ткани 1 мм. Недостатками этого процесса являются высокая автофлуоресценция и уменьшенная способность получать изображения морфологии клеток с высоким разрешением и подробный анализ совместного окрашивания из-за увеличения рабочих расстояний, требуемых по сравнению с более традиционными методами (тонкие криосекции или свободно плавающие участки). По этой причине мы рекомендуем очищать мозг для анализа крупномасштабных результатов отслеживания линий в нескольких областях мозга, вместо того, чтобы пытаться охарактеризовать или проанализировать отдельные клетки.

протокол

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета штата Огайо.

1. Создание линии прослеживания линии мыши Тет-Он, стратегии размножения и генотипирования для экспериментальной когорты мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы описываем создание мышиной системы Tet-On с Rosa-mTmG в качестве флуоресцентного репортерного гена, который подвергается рекомбинации Cre, однако различные другие рекомбинационные репортерные линии также могут быть использованы с системой Tet-On.

  1. Установите клетку для спаривания одного самца oTet-Cre (+/-) с одной или несколькими самками R26 (mTmG) (+/+). Обзор экспериментальной настройки сопряжения мыши см. на рисунке 1 .
  2. Результирующие щенки (F1) будут oTet-Cre (+/-) или oTet-Cre (-/-) и R26 (mTmG) (+/-). Выполняют генотипирование в соответствии с праймерами в Дополнительной таблице 1 и протоколами в Дополнительной таблице 2.
  3. При отъеме выполните тестирование зародышевой линии, принимая удар по уху от каждого отъема. Исследуйте ушной перфоратор под эпифлуоресцентным микроскопом в спектре GFP /FITC, чтобы определить, подверглось ли животное рекомбинации зародышевой линии в развитии. Если это так, животное будет экспрессировать GFP в каждой клетке, а ушной удар будет флуоресцировать сигналом mGFP. Эти животные не могут быть использованы для вязок или экспериментов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ушные клипсы мышей, которые не являются зародышевой линией, показывают только эндогенную флуоресценцию под микроскопом (рисунок 1C), в то время как животные зародышевой линии показывают яркий сигнал GFP (рисунок 1D). Контрольные уши могут быть у мышей, которые не содержат флуоресцентных трансгенов. Отметим, что волоски уха имеют высокую эндогенную флуоресценцию и не должны использоваться в качестве определяющего фактора (рисунок 1С). Кроме того, различия в эндогенной флуоресценции наблюдаются между мышами белого и черного цвета шерсти, и в этом анализе необходимо будет использовать контроль от мышей того же цвета шерсти, что и тестируемые мыши.
  4. Соедините одного самца oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/-) с одной или несколькими самками мышей oTet-Cre (-/-) x R26 (mTmG).
  5. Результирующее поколение (F2) составит 1/4 R26 (mTmG) (+/+) и 1/2 Cre (+/-). Скрестите этих животных с животными mTert-rtTA (+/+), спарив одно oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) с одним или несколькими животными mTert-rtTA (+/+).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали mTert-rtTA (+/+) животных, но этот процесс может быть выполнен с любой линией мыши rtTA30.
  6. Для экспериментальных животных настройте селекции на генерацию mTert-rtTA (+/+) или (+/-) x oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) или (+/-).

2. Индукция доксициклина Cre и импульсная конструкция

  1. Когда животные достигнут подходящего возраста для начала исследования, замените их питьевую воду водой докс: питьевой водой, содержащей 5% сахарозы и 2 мг / мл доксициклина гиклата. Используйте Cre-отрицательных животных, которые получают ту же погоню за пульсом доксициклина, что и экспериментальные животные, в качестве контрольной группы для результирующих флуоресцентных паттернов экспрессии.
    1. После приготовления храните воду докса при температуре 4 °C до 1 месяца. Дополнительные сведения см. в таблице 1 . Воду Dox можно вводить животным в питьевых бутылках в течение 5 дней, прежде чем она будет заменена, так как грибковый рост может произойти, если воду dox оставить при комнатной температуре в течение более длительных периодов времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для индукции сигнала mGFP при использовании трансгена mTmG требуется импульс доксициклина продолжительностью не менее 2 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы не тестировали концентрации доксициклина, кроме 2 мг/мл. Предыдущая литература определила, что эта концентрация имеет самые высокие эффекты при введении через питьевую воду29. Количество доставляемого доксициклина может отличаться в зависимости от количества питья, сделанного каждым животным. Инъекция или прием доксициклина также могут быть сделаны для того, чтобы быть последовательными между животными40.
  2. После того, как период пульса закончится, удалите воду из клеток и замените ее обычной питьевой водой. Животные теперь будут находиться в периоде «погони» до самой смерти.

3. Транскардиальная перфузия и рассечение мозга

  1. Выньте мышь из клетки и удерживайте животное большим и указательным пальцами левой руки. Вводят животному через внутрибрюшинную (в..) инъекцию раствором 100 мг/мл кетамина и 20 мг/мл ксилазина в 0,9% стерильном физиологическом растворе для конечной концентрации 200 мг/кг кетамина и 20 мг/кг ксилазина. Дополнительные сведения см. в таблице 1 .
    ВНИМАНИЕ: Протоколы анестезии могут отличаться в зависимости от страны. Кроме того, существуют эффекты анестетиков на мозг, включая изменения в морфологии и действии микроглии и уровнях кортикостерона, которые необходимо понимать при выполнении перфузий с целью сбора и анализа мозга41,42.
  2. Примерно через 1-2 мин животное потеряет свой корректирующий рефлекс. Чтобы проверить это, просто переверните животное на спину, и если оно не может откатиться на ноги, оно потеряло правильный рефлекс.
  3. Примерно через 5-10 минут животное потеряет педальный рефлекс. Чтобы проверить педальный рефлекс, используйте большой и указательный пальцы, чтобы ущипнуть каждую из ног животного. Если нет ответа, в виде прыжка или мышечного спазма, используйте ногти большого и указательного пальцев, чтобы ущипнуть каждую из ног животного. Если ответа нет, животное теряет педальный рефлекс.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если животное реагирует на педальный рефлекс в течение более 15 мин после инъекции, может потребоваться дополнительная инъекция 1/2 первоначальной инъекции кетамина/ксилазина. Возраст, пол, генотип, фенотип и лечение могут повлиять на реакцию животного на этот лекарственный коктейль.
  4. После того, как корректирующие и педальные рефлексы будут потеряны, проверьте глазной рефлекс, слегка соприкоснувшись с глазным яблоком мыши пальцем в перчатке. Отсутствие реакции указывает на то, что глазной рефлекс был потерян.
  5. Закрепите мышь в положении лежа на спине лапами, прикрепленными к закрепляемой рабочей поверхности.
  6. Сделайте разрез через кожу хирургическими ножницами вдоль грудной средней линии примерно на 1-2 см ниже мечевидного отростка. Нарежьте выше до тех пор, пока не начнется мечевидный отросток.
  7. Обхватите хрящ мечевидного отростка щипцами. Вставьте ножницы и прорежьте мускулатуру и грудную клетку по диагонали вдоль правой стороны мыши до уровня ключиц.
    1. Поднимите грудную мускулатуру щипцами и прорежьте диафрагму, пока сердце не будет визуализировано. Затем сделайте идентичный диагональный разрез вдоль левой стороны мыши, убедившись, что предотвратите любой контакт с сердцем. Используйте гемостат, чтобы держать грудную мускулатуру подальше от полости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент мышь больше не сможет дышать, поэтому работайте быстро, чтобы предотвратить смерть до следующих шагов.
  8. Закрепите бьющееся сердце тупыми щипцами и вставьте дозирующую иглу в левый желудочек через основание дуги аорты.
  9. Зажмите основание иглы к левому желудочку чуть выше места введения.
  10. Сделайте разрез в правом предсердии и при первых признаках кровотока начните перфузию животного 20 мл 1x PBS при 8,11 мл/ мин.
  11. После того, как 1x PBS перфузирует тело, переключитесь на соответствующее фиксирующее средство для последующего применения и перфузируйте мышь 20 мл фиксатора.
    1. Для замороженного секционирования и иммуноокрашения перфузируйте животное глиоксальным фиксатором для очистки мозга, перфузируйте животное с 4% PFA в 1x PBS (рН 7,4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Признаки успешной перфузии включают жесткость животных (незначительная жесткость с глиоксалем, интенсивная жесткость с PFA) и отсутствие видимых кровеносных сосудов по всем тканям.
  12. Обезглавить мышь и удалить мозг, вставив ножницы в ствол мозга и разрезав вдоль сквамозного шва до лобно-подмышечного шва с каждой стороны. Затем нарежьте поперек фонтоназального шва, чтобы снять черепную крышку, стараясь не повредить обонятельную луковицу. Оттуда переверните череп вверх дном и используйте изогнутые щипцы, чтобы удалить мозг, обязательно перерезав зрительный нерв.
  13. Поместите перфузированный мозг в тканевый картридж и погрузите в фиксатор, используемый для перфузии животного на ночь при 4 °C.

4. Лечение мозга, нарезка и иммуноокрашивание мозга

  1. Лечение и нарезка мозга
    1. Извлеките мозговые картриджи из глиоксаль-фиксатора и инкубируйте в 15% сахарозы в 1x PBS в течение 2 дней при 4 °C или до тех пор, пока мозг не утонет.
    2. Удалите мозговые картриджи из 15% сахарозы и инкубируйте в 30% сахарозы в 1x PBS в течение 2 дней при 4 °C или до тех пор, пока мозг не утонет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения дополнительной информации см. таблицу 1 .
    3. Удалите мозг из 30% сахарозы в 1x PBS и разделите мозг на различные «блоки», используя корональный блок мозга или сагиттальный блок мозга.
    4. Встраивание корональных или сагиттальных отделов мозга в соединение OCT путем размещения участков мозга на смеси сухого льда и этанола (EtOH). После того, как OCT побелеет и станет твердым, извлеките из сухого льда смесь EtOH и храните завернутую в парапленку, внутри герметичного мешка при -20 °C.
    5. Извлеките замороженные блоки из морозильной камеры и поместите внутрь криостат с внутренней температурой, установленной на -20 °C. Используйте OCT, чтобы прикрепить блок к металлическому патрону, чтобы ткань была прочно прикреплена. Дайте ~5 мин, чтобы ткань замерзла до патрона. Нарежьте ткань на 7 мкм, поместив каждый срез ткани на заряженный стеклянный слайд.
    6. Дайте слайдам выпекаться в течение ночи при 37 °C, а затем поместите при -20 °C до использования для иммуноокрашивания.
  2. Иммуноокрашивание
    1. Теплые горки до комнатной температуры (RT) и постфиксируются ледяным ацетоном в течение 15 мин.
    2. Промывайте слайды в течение 5 минут в 1x ополаскивательном буфере (например, IHC Select TBS Rinse Buffer), встряхивая при 60 об/мин при RT между каждым шагом.
    3. Пермеабилизируют для окрашивания ядерных антигенов 0,3% Тритоном Х-100 в течение 10 мин при РТ. Пермеабилизируют для окрашивания цитоплазматических антигенов 0,3% Tween-20 в течение 10 мин при РТ.
    4. Выполняйте извлечение антигена с помощью микроволнистых слайдов в 50-100 мл 1x DAKO Antigen Retrieval Solution на низком уровне в течение 10 мин, дважды. Затем промыть ополаскивателем в течение 5 мин при РТ.
    5. Инкубировать слайды в 0,3% Typogen Black в 70% EtOH в течение 20 мин при RT, а затем промыть ополаскивателем.
    6. Нарисуйте гидрофобный барьер вокруг каждой ткани, не давая тканям высохнуть. Затем блокируют в течение 20 минут при 37 °C с 1 каплей миллипорного блокирующего реагента на ткань. Затем добавляют 100 мкл первичного антитела, разведенного в разбавителе антител, к каждой ткани и инкубируют в течение ночи при 4 °C.
    7. На следующий день инкубируют участки во вторичных антителах Alexa Fluor в течение 10 мин при RT. Затем вымойте слайды в буфере для ополаскивания.
    8. Покрыть участки мозга в 100 мкл антитела 1:500 против GFP, конъюгированного с AlexaFluor 488 для усиления эндогенного сигнала GFP, отмечающего прослеживаемые клетки, и инкубировать в течение ночи при 4 °C.
    9. На следующий день промыть ополаскивателем 2 раза, а затем промыть в проточной DI воде в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно тщательно мойте водой DI, заботясь о том, чтобы избежать любой проточной воды на самих горках, которая может удалить участки мозга с горок.
    10. Противодействовать 100 нг/мл 4′,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в течение 5 мин. Затем промыть в проточной воде DI в течение 5 мин.
    11. Добавьте каплю монтажной среды поверх каждого участка ткани и запечатайте крышкой размером 22 мм x 22 мм. Визуализация рекомендуется в день монтажа для обеспечения оптимального сигнала.

5. Очистка мозга iDISCO (адаптировано из39)

  1. Фиксация и секционирование
    1. Постфиксируют мозг в 4% PFA на ночь при 4 °C, а затем снова в течение 1 ч при RT.
    2. Промывайте мозги в 1x PBS в течение часа, дважды, на RT. Затем разрезать на участки толщиной 1 мм с помощью необходимого мозгового блока и поместить в 5 мл микроцентрифужные трубки, содержащие 1x PBS.
  2. Предварительная обработка метанола (метанолом)
    ПРИМЕЧАНИЕ: В связи с возможностью влияния метанола на иммуноокрашание определенных белков, авторы хотели бы указать читателю на Renier et al. 2014 для протокола iDISCO без метанола альтернативы39. Дополнительные сведения о следующих решениях в этом разделе см. в таблице 1 .
    1. Промыть 1x PBS в течение 1 ч дважды (встряхивание) при RT.
    2. Промыть в 50% метаноле (в ПБС) в течение 1 ч (встряхивание) на РТ.
    3. Промыть в 80% метаноле в течение 1 ч (встряхивание) при РТ.
    4. Промыть в 100% метаноле в течение 1 ч дважды (встряхнуть) при РТ.
    5. Отбеливающие образцы с 5% перекисью водорода (H2O2) в 20% диметилсульфоксиде (DMSO)/метаноле (1 объем 30% H2O2/1 объем DMSO/4 объема метанола, ледяной холод) при 4 °C в течение ночи (встряхивание).
    6. После отбеливания промыть образцы метанолом в течение 1 ч дважды (встряхивание) на РТ.
    7. Промыть в 20% ДМСО/метанол в течение 1 ч дважды (встряхивание) при РТ.
    8. Промыть в 80% метаноле в течение 1 ч (встряхивание) при РТ.
    9. Промыть в 50% метаноле в течение 1 ч (встряхивание) на РТ.
    10. Промыть в ПБС в течение 1 ч дважды (встряхнуть) при РТ.
    11. Промывайте в PBS/0,2% Triton X-100 в течение 1 ч дважды (встряхивая) при RT.
  3. Иммуноокрашивание очищающего мозга
    1. Инкубируйте образцы в 1x PBS/0,2% Triton X-100/20% DMSO/0.3 M глицина при 37 °C в течение ночи на орбитальном шейкере.
    2. Блокируйте в 1x PBS/0,2% Triton X-100/10% DMSO/6% козьей сыворотке при 37 °C в течение 3 дней на орбитальном шейкере.
    3. Промывайте образцы в 1x PBS/0,2% Tween-20/10 мкг/мл гепариновой натриевой соли из слизистой оболочки свиней в течение 1 ч дважды при 37 °C, а затем инкубируйте в 1x PBS/0,2% Tween-20/10 мкг/мл гепарина/5% DMSO/3% козьей сыворотки, содержащей 1:500 концентрацию анти-GFP кролика AlexaFluor 488 при 37 °C на орбитальном шейкере в течение 2 дней.
    4. Промывайте образцы в 1x PBS/0,2% Tween-20 с 10 мкг/мл гепарина в течение 1 ч при 37 °C на орбитальном шейкере, три раза, а затем один раз в сутки в течение 2 дней.
    5. Инкубировать образцы в течение ночи в 10 мл 50% v/v тетрагидрофурана (THF)/H2Oв конической пробирке объемом 15 мл.
    6. Инкубировать пробы в течение 1 ч в 10 мл 80% ТГФ/Н2O.
    7. Инкубировать образцы дважды в течение 1 ч в 100% ТГФ.
    8. Сушат образцы стерильной салфеткой и инкубируют в дихлорметане до тех пор, пока они не опустятся на дно флакона (примерно 40 мин). Не инкубировать >60 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно обращайтесь с дихлорметаном под вытяжным кожухом.
    9. Инкубировать образцы в 18 мл дибензилового эфира (ДБЭ) до очистки (>2 ч).
    10. Храните образцы в DBE на RT до тех пор, пока они не будут готовы к изображению.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов важно как можно скорее получить образец после завершения очистки.

6. Визуализация окрашенных слайдов или очищенного мозга

  1. Чтобы получить изображение иммуноокрашенных участков мозга, проанализируйте слайды с помощью конфокальной микроскопии, где может быть подтверждена коэкспрессия нескольких антител. Мы используем микроскоп Leica Stellaris 5 с гибридными детекторами HyD S, но подойдет любой точечный сканирующий конфокальный микроскоп. Цели включают HC PL APO 10x/0.40 CS2, HC PL APO 40x/1.30 OIL CS2 и HC PL APO 63x/1.40.
    1. Настройте правильные лазерные линии и эмиссионные фильтры. Требуемые лазеры и соответствующие интенсивности лазеров зависят от используемых комбинаций микроскопа и флуорофора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем комбинацию диодных 405 нм и лазеров белого света для точной настройки спектров возбуждения и излучения для каждого флуорофора или групп флуорофоров, используемых для уменьшения и устранения перекрестных помех. Аналогичные результаты могут быть достигнуты с использованием традиционных комбинаций лазер /фильтр, но обратите пристальное внимание на канал пропускания. Выпуск за обрез можно определить, включив одну лазерную линию в сочетании с каждой из желаемых комбинаций эмиссионных фильтров, чтобы увидеть, на какие каналы воздействует каждый конкретный лазер. Например, если диодный лазер 405 нм производит видимую флуоресценцию в эмиссионном фильтре GFP, происходит кровотечение. Убедитесь, что несколько каналов визуализируются последовательно кадр за кадром, чтобы значительно уменьшить количество кровотечений.
    2. Для мозга Tet-On с репортером mTmG выберите DAPI (например, 405 нм, эм. 450 нм), GFP (например, 488 нм, эм. 509 нм), tdTomato (например, 555 нм, эм. 582 нм) и соответствующий фар-красный флуорофор, чтобы соответствовать флуорофору, используемому на вторичном антителе. Мы рекомендуем Alexa Fluor 647 (например, 651 нм, эм. 667 нм).
    3. Сначала установите настройки с мозгом Cre-control, окрашенным как GFP, так и флуоресцентным вторичным. Эти срезы мозга будут контролировать фоновую флуоресценцию от флуоресцентных антител и не будут показывать реальный сигнал GFP.
    4. Проанализируйте каждый участок мозга сверху вниз, слева направо, чтобы убедиться, что ни один сигнал не был пропущен в анализе. При визуализации одного и того же участка мозга при различных увеличениях рекомендуется сначала использовать более низкие увеличения, так как более высокое увеличение будет быстрее отбеливать сигнал mTomato.
  2. Чтобы получить изображение очищенного мозга, используйте перевернутый конфокальный микроскоп с автоматизированной сценой и автоматизированной функцией укладки плитки. Мы используем микроскоп Leica Stellaris 5. Поскольку образцы настолько толстые (>500 мкм), требуются большие рабочие расстояния, которые ограничивают увеличение, которое может быть эффективно достигнуто. Мы используем объектив HC PL APO 10x/0.40 CS2 для всех очищенных изображений мозга.
    1. Начните с того, что положите очищенный участок мозга на стеклянную нижнюю чашку и погрузитесь в дибензиловый эфир.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дибензиловый эфир коррозионно влияет на большинство объективов и большинство пластмасс. По этой причине любой внутренний пластик в стеклянной нижней посуде должен быть покрыт быстросохнущим силиконовым эластомером.
    2. Настройте правильные лазерные линии и эмиссионные фильтры. Для совместно окрашенных мозгов Tet-On с репортером mTmG выберите DAPI, GFP, tdTomato и соответствующий фар-красный флуорофор, чтобы соответствовать флуорофору, используемому на вторичном антителе. Установите нужное разрешение, рекомендуем не менее 1024 x 1024. Установите точечное отверстие на 1 а.е.
    3. Сначала установите интенсивность лазера и усиление детектора с помощью мозга Cre-control, окрашенного как GFP, так и флуоресцентным вторичным. Эти срезы мозга будут контролировать фоновую флуоресценцию от флуоресцентных антител и не будут показывать реальный сигнал GFP.
    4. После того, как интенсивность лазера и усиление детектора были оптимизированы, наметьте мозг для визуализации. Начните с определения местоположения всего периметра секции мозга, чтобы установить оси X и Y для получения изображения. Затем определите ось Z, установив фокусную точку примерно на глубину центра ткани, и используйте элементы управления Z-позиционированием, чтобы найти «самую высокую» точку ткани (наиболее положительное Z-значение). Сканируйте различные участки ткани, увеличивая максимальную высоту оси Z по мере необходимости.
      1. Повторите для «самой низкой» (наиболее отрицательной Z-величины) точки, необходимой для получения всей толщины ткани. Stellaris 5 имеет предел ± 250 мкм фокусной точки. Это ограничивает оптические участки толщиной 500 мкм по оси Z. 3D-область секции мозга теперь известна.
    5. Установите размер Z-шага на 6 мкм и начните получать изображение. Время приобретения зависит от нескольких факторов и может составлять от часов до суток в зависимости от желаемых параметров. Чтобы уменьшить время получения изображения, попробуйте уменьшить разрешение, увеличить скорость лазерного сканирования или увеличить размер шага.
    6. После того, как мозаичное изображение всего очищенного участка мозга было захвачено, проанализируйте по желанию.

Результаты

В то время как флуоресцентный сигнал, полученный от системы Tet-On с флуоресцентным репортером, будет варьироваться в зависимости от интересующего промотора и используемого флуорофора (флуорофоров), мы опишем, как результаты были проанализированы с животными mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Анализ моз...

Обсуждение

Описан метод создания, использования и анализа тройной трансгенной линии, прослеживающей линию мыши, отмечающую стволовые клетки в мозге взрослой мыши in vivo. В сочетании с иммуноокрашиванием или очисткой мозга может быть выполнена идентификация и характеристика прослеживаемых фл...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Диану Карлоне (Бостонская детская больница, Гарвардская медицинская школа) и д-ра Мэтью Лайнса (Центр диабета Джослина; Научно-исследовательский институт Медицинского центра штата Мэн) для руководства с использованием животных mTert-rtTA.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibody diluentAgilentS080983-2
Antigen Retrieval SolutionAgilentS2367
anti-GFP antibodyInvitrogenA2311Use at 1:500-1:000
AcetoneFisher ScientificA18-4
B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/JThe Jackson LaboratoryJAX:006234
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/JThe Jackson LaboratoryJAX:007676
Blocking Solution (IHC)Millipore Sigma20773
Blunt needleBSTEANX0012SYHIV
Coronal brain blockBraintreeBS-2000C
Cover slipCorning2850-22
CryostatLeicaCM1900
DAPISigma-AldrichD564
Dibenzyl etherMillipore Sigma33630
DichloromethaneSigma-Aldrich270997
Dimethyl SulfoxideSigma-AldrichD8418
Donkey SerumSigma-AldrichD9663
Doxycycline HyclateSigma-AldrichD9891
GlycineBio-Rad161-0718
Heparin Sodium Salt from Porcine MucosaSigma-AldrichH3393
Histochoice Molecular Biology Tissue FixativeAmrescoH120This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)
Hydrogen Peroxide SolutionSigma-Aldrich516813
IHC Select TBS Rinse BufferMillipore Sigma20845
KetamineWestward0143-95095-10This product requires a DEA license for storage and use.
MethanolFisher ScientificA452-4
Microscope SlidesFisherbrand12-550-15
Milipore BlockMillipore20773
Mounting mediumMillipore Sigma5013
Optimal Cutting Temperature SolutionSakura4583
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
PBS Solution (10X)TeknovaP0496
Sagittal brain blockBraintreeRBM-2000S
SalineBraunS8004-5264
SucroseSigma-AldrichS7903
Sudan (Typogen) BlackMillipore Sigma199664
TetrahydrofuranSigma-Aldrich186562
Tissue cartridgeSimportM512
Triton X-100Bio-Rad1610407
Tween-20Millipore Sigma655205
XylazineAnaSedsc-362950Rx

Ссылки

  1. Carlone, D. L., et al. Telomerase expression marks transitional growth-associated skeletal progenitor/stem cells. Stem Cells. 39 (3), 296-305 (2021).
  2. Altman, J., Das, G. D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. Journal of Comparative Neurology. 124 (3), 319-335 (1965).
  3. Cameron, H. A., Gould, E. Adult neurogenesis is regulated by adrenal steroids in the dentate gyrus. Neuroscience. 61 (2), 203-209 (1994).
  4. Kaplan, M. S., Hinds, J. W. Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs. Science. 197 (4308), 1092-1094 (1977).
  5. Gould, E., et al. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult tree shrew is regulated by psychosocial stress and NMDA receptor activation. Journal of Neuroscience. 17 (7), 2492-2498 (1997).
  6. Eriksson, P. S., et al. Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nature Medicine. 4 (11), 1313-1317 (1998).
  7. Gould, E., et al. Neurogenesis in adulthood: a possible role in learning. Trends in Cognitive Science. 3 (5), 186-192 (1999).
  8. Hastings, N. B., Gould, E. Rapid extension of axons into the CA3 region by adult-generated granule cells. Journal of Comparative Neurology. 413 (1), 146-154 (1999).
  9. Hu, V. W., et al. 3H-thymidine is a defective tool with which to measure rates of DNA synthesis. The FASEB Journal. 16 (11), 1456-1457 (2002).
  10. Cifuentes, M., et al. A comparative analysis of intraperitoneal versus intracerebroventricular administration of bromodeoxyuridine for the study of cell proliferation in the adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 201 (2), 307-314 (2011).
  11. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
  12. Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
  13. Guizzetti, M., Kavanagh, T. J., Costa, L. G. Measurements of astrocyte proliferation. Methods in Molecular Biology. 758, 349-359 (2011).
  14. Gomez-Nicola, D., et al. Regulation of microglial proliferation during chronic neurodegeneration. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2481-2493 (2013).
  15. Bradl, M., Lassmann, H. Oligodendrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 37-53 (2010).
  16. Das, A. T., Tenenbaum, L., Berkhout, B. Tet-On systems for doxycycline-inducible gene expression. Current Gene Therapy. 16 (3), 156-167 (2016).
  17. Lee, C. M., et al. Single-cell RNA-seq analysis revealed long-lasting adverse effects of tamoxifen on neurogenesis in prenatal and adult brains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (32), 19578-19589 (2020).
  18. Smith, B. M., et al. Oral and injected tamoxifen alter adult hippocampal neurogenesis in female and male mice. eNeuro. 9 (2), (2022).
  19. Greenberg, R. A., et al. Expression of mouse telomerase reverse transcriptase during development, differentiation and proliferation. Oncogene. 16 (13), 1723-1730 (1998).
  20. Cong, Y. S., Wright, W. E., Shay, J. W. Human telomerase and its regulation. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (3), 407-425 (2002).
  21. Breault, D. T., et al. Generation of mTert-GFP mice as a model to identify and study tissue progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (30), 10420-10425 (2008).
  22. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 179-184 (2011).
  23. Lin, S., et al. Distributed hepatocytes expressing telomerase repopulate the liver in homeostasis and injury. Nature. 556 (7700), 244-248 (2018).
  24. Lynes, M. D., et al. Telomerase reverse transcriptase expression marks a population of rare adipose tissue stem cells. Stem Cells. 40 (1), 102-111 (2022).
  25. Cousins, F. L., et al. Telomerase reverse transcriptase expression in mouse endometrium during reepithelialization and regeneration in a menses-like model. Stem Cells and Development. 28 (1), 1-12 (2019).
  26. Deane, J. A., et al. The mouse endometrium contains epithelial, endothelial and leucocyte populations expressing the stem cell marker telomerase reverse transcriptase. Molecular Human Reproduction. 22 (4), 272-284 (2016).
  27. Thompson, C. A. H., Wong, J. M. Y. Non-canonical functions of telomerase reverse transcriptase: emerging roles and biological relevance. Current Topics in Medicinal Chemistry. 20 (6), 498-507 (2020).
  28. Lynes, M. D., et al. Telomerase reverse transcriptase expression marks a population of rare adipose tissue stem cells. Stem Cells. , (2021).
  29. Redelsperger, I. M., et al. Stability of doxycycline in feed and water and minimal effective doses in tetracycline-inducible systems. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (4), 467-474 (2016).
  30. Jensen, G. J., et al. Telomerase reverse transcriptase (TERT)-expressing cells mark a novel stem cell population in the adult mouse brain. Peer Review. , (2022).
  31. Muzumdar, M. D., et al. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  32. Bocker, R., et al. Comparison of distribution of doxycycline in mice after oral and intravenous application measured by a high-performance liquid chromatographic method. Arzneimittelforschung. 31 (12), 2116-2117 (1981).
  33. Lucchetti, J., et al. Plasma and brain concentrations of doxycycline after single and repeated doses in wild-type and APP23 mice. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 368 (1), 32-40 (2019).
  34. Sun, Y., Chen, X., Xiao, D. Tetracycline-inducible expression systems: new strategies and practices in the transgenic mouse modeling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 39 (4), 235-246 (2007).
  35. Lee, P., et al. Conditional lineage ablation to model human diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (19), 11371-11376 (1998).
  36. Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as "gold standard" for immunohistochemistry. American Journal of Clinical Pathology. 129 (3), 358-366 (2008).
  37. Delgado, A. C., et al. Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain. Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).
  38. Bratthauer, G. L. Preparation of frozen sections for analysis. Immunocytochemical Methods and Protocols. , 67-73 (2010).
  39. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  40. Cawthorne, C., et al. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. Journal of Biomolecular Techniques. 18 (2), 120-123 (2007).
  41. Hristovska, I., et al. Ketamine/xylazine and barbiturates modulate microglial morphology and motility differently in a mouse model. PLoS One. 15 (8), 0236594 (2020).
  42. Pereira, G. C., et al. Anesthesia can alter the levels of corticosterone and the phosphorylation of signaling molecules. BMC Research Notes. 14 (1), 363 (2021).
  43. Markakis, E. A., Gage, F. H. Adult-generated neurons in the dentate gyrus send axonal projections to field CA3 and are surrounded by synaptic vesicles. Journal of Comparative Neurology. 406 (4), 449-460 (1999).
  44. Magavi, S. S., Leavitt, B. R., Macklis, J. D. Induction of neurogenesis in the neocortex of adult mice. Nature. 405 (6789), 951-955 (2000).
  45. Evans, J., et al. Characterization of mitotic neurons derived from adult rat hypothalamus and brain stem. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 1076-1085 (2002).
  46. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Neurogenesis in the hypothalamus of adult mice: potential role in energy balance. Science. 310 (5748), 679-683 (2005).
  47. Parent, A., Cicchetti, F., Beach, T. G. Calretinin-immunoreactive neurons in the human striatum. Brain Research. 674 (2), 347-351 (1995).
  48. Rich, E. L., Shapiro, M. Rat prefrontal cortical neurons selectively code strategy switches. Journal of Neuroscience. 29 (22), 7208-7219 (2009).
  49. Suzuki, S. O., Goldman, J. E. Multiple cell populations in the early postnatal subventricular zone take distinct migratory pathways: a dynamic study of glial and neuronal progenitor migration. Journal of Neuroscience. 23 (10), 4240-4250 (2003).
  50. Figueres-Onate, M., Sanchez-Gonzalez, R. -., Lopez-Mascaraque, L. -. Deciphering neural heterogeneity through cell lineage tracing. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (5), 1971-1982 (2021).
  51. Hammelrath, L., et al. Morphological maturation of the mouse brain: An in vivo MRI and histology investigation. Neuroimage. 125, 144-152 (2016).
  52. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70 (4), 687-702 (2011).
  53. Sanchez-Gonzalez, R., Bribian, A., Lopez-Mascaraque, L. Cell fate potential of NG2 progenitors. Scientific Reports. 10 (1), 9876 (2020).
  54. Suzuki, T., et al. Cells of NG2 lineage increase in glomeruli of mice following podocyte depletion. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 315 (5), 1449-1464 (2018).
  55. Chou, Y. H., et al. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
  56. Hendrickson, M. L., et al. Expression of nestin by neural cells in the adult rat and human brain. PLoS One. 6 (4), 18535 (2011).
  57. Bifari, F., et al. Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 383 (2015).
  58. Doetsch, F., et al. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97 (6), 703-716 (1999).
  59. Seri, B., et al. Astrocytes give rise to new neurons in the adult mammalian hippocampus. Journal of Neuroscience. 21 (18), 7153-7160 (2001).
  60. DeCarolis, N. A., et al. In vivo contribution of nestin- and GLAST-lineage cells to adult hippocampal neurogenesis. Hippocampus. 23 (8), 708-719 (2013).
  61. Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. Cells in the astroglial lineage are neural stem cells. Cell and Tissue Research. 331 (1), 179-191 (2008).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены