JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

היכולת לסמן באופן קבוע תאי גזע וצאצאיהם באמצעות פלואורופור באמצעות קו עכברים מהונדס בלתי ניתן להשראה מאפשרת ניתוח מרחבי וזמני של הפעלה, התפשטות, נדידה ו/או התמיינות in vivo. מעקב אחר שושלת יכול לחשוף מידע חדש על מחויבות לשושלת, תגובה להתערבויות ורב-תחומיות.

Abstract

קו עכברים תעתיק הפוך של טלומראז (Tert) פותח כדי לחקור את ההתנהגות והגורל של תאי גזע של רקמות בוגרות, על ידי חציית מערכת 'Tet-On' oTet-Cre עכבר oTet-Cre עם טרנסגן טרנסאקטיבטור טטרציקלין הפוך (rtTA) חדשני המקושר למקדם Tert, שהדגמנו מסמן אוכלוסייה חדשה של תאי גזע במוח בוגרים. כאן, מתן נגזרת הטטרציקלין דוקסיציקלין ל-mTert-rtTA::oTet-Cre עכברים יסמן באופן בלתי נמנע אוכלוסייה של תאים המבטאים שבר של 4.4 קילו-בייט של האזור המקדם של הגן טרט. כאשר משלבים את כתב Rosa-mTmG, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG עכברים יבטאו את הממברנה tdTomato (mTomato) עד שהטיפול בדוקסיציקלין יגרום להחלפת ביטוי mTomato בממברנה EGFP (mGFP) בתאים שגם מבטאים את טרט. לכן, כאשר עכברי מעקב אחר שושלת משולשת-מהונדסת אלה מקבלים דוקסיציקלין (תקופת ה"דופק" שבמהלכה מסומנים תאים המבטאים TERT), תאים אלה יהפכו לתאי mGFP+ המסומנים באופן בלתי נדלה, שניתן לעקוב אחריהם במשך כל פרק זמן רצוי לאחר הסרת דוקסיציקלין (תקופת ה"מרדף"), גם אם ביטוי Tert יאבד לאחר מכן. לאחר מכן מוחות מקובעים על-ידי פרפוזיה ומעובדים עבור אימונופלואורסצנציה ויישומים אחרים במורד הזרם, על מנת לפרש שינויים בהפעלת תאי גזע, התפשטות, מחויבות לשושלת, הגירה לנישות מוחיות שונות והתמיינות לסוגי תאים בוגרים. באמצעות מערכת זו, כל עכבר rtTA יכול להזדווג עם oTet-Cre וכתב רוזה כדי לערוך ניסויי שושלת "מרדף דופק" של דוקסיציקלין באמצעות סמנים של תאי גזע.

Introduction

הערך של שושלת מעקב אחר קו עכבר
ניתוח של תאי גזע in vivo יכול להיות קשה מכיוון שמבחנים רבים הבוחנים תאים כאלה מתמקדים רק באפיון תאים אלה בזמן המוות של החיה, המייצג תמונת מצב סופנית בזמן. כדי להבין טוב יותר את תהליכי ההתרבות, ההתמיינות והנדידה של תאי אב, סוגי תאי ביניים/מעבר ותאים בוגרים לאורך זמן, נדרשת גישת ניתוח אורכי. ניתן להשיג זאת באמצעות מחקרי מעקב אחר שושלת לפיהם תאי גזע/אב מסומנים באופן בלתי ניתן לערעור וניתן לעקוב אחריהם במשך כל פרק זמן לאחרמכן 1.

במוח היונקים הבוגרים, תהליך הנוירוגנזה שבו נוירונים שנולדו בוגרים נוצרים מתאי גזע ותאי אב נותח לראשונה באמצעות שימור תוויות עם תימידין-H3 2,3,4 או 5-ברומו-2'-דאוקסיורידין (BrdU)5,6,7,8 . במחקרים אלה, תאים מתרבים סומנו באנלוגית התימין, אשר שולבה בדנ"א של התאים במהלך שכפול וחלוקת תאים/התפשטות. התא המסומן, כמו גם צאצאיהם, הכילו אפוא את האנלוגיה הזו, שזוהתה לאחר המוות. עם זאת, בעוד שתימידין-H3 ו-BrdU אפשרו סימון של תאים מתרבים וצאצאיהם באזורים במוח שבהם תאי גזע לא הובנו כראוי, מחקרים אלה הופרעו על ידי החסרונות של כלים אלה. Thymidine-H3 גורם למעצר מחזור תאים, אפופטוזיס ועיכוב סינתזת DNA תלוי מינון9, בעוד BrdU מסמן תאים ברמות משתנות בהתאם לנתיב מתן10 ונקלט על ידי תאים במהלך תיקון או אפופטוזיס, כמו גם במהלך חלוקת תאים11. שיטות תיוג יעילות יותר שימשו לאחרונה, כגון תיוג עם 5-אתניל-2'-דאוקסיורידין (EdU), אך רבות מאותן בעיות כמו BrdU עדיין נותרו12. גישות אלה מגבילות גם בכך שהן מסמנות כל תא שגשוג, לא רק תאי גזע, ולכן פרשנות התוצאות עלולה להיות מבלבלת. בשושלת הנוירוגנית, כל תאי הגזע והאב הקדמון שומרים על יכולת מיטוטית, ורק תאי עצב סופניים/בוגרים אינם מתרבים. עבור אסטרוציטים ומיקרוגליה, אך לא אוליגודנדרוציטים, התפשטות נשמרת ללא הגבלת זמן 13,14,15.

עכברים מהונדסים המשמשים לשושלת עקבות רק אחר תאים שמביעים חלבון בעל עניין, כמו זה שאושר לזיהוי תאי גזע בוגרים כפי שאנו משתמשים כאן, הפכו לפיכך לנפוצים יותר כאשר חוקרים תאי גזע וצאצאיהם. למרות שקשה ליצור באמצעות גישות מהונדסות של עכברים, קווי עכברים המתחקים אחר שושלות מאפשרים מעקב אחר תאים מסומנים במיוחד במוח, ואינם מסתמכים על התפשטות בלבד. במערכת העכברים המהונדסים Tet-On, מתן טטרציקלין או דוקסיציקלין (נגזרת טטרציקלין) גורם לביטוי Cre-recombinase בתאים שהונדסו עם טרנסאקטיבטור טטרציקלין הפוך (rtTA), אשר מתועתק על ידי מקדם עניין. לאחר מכן, הרקומבינציה המונעת על-ידי ה-Cre, שאינה ניתנת למחיקה, תפעיל את הביטוי של חלבון פלואורסצנטי או זוהר בלתי ניתן למחיקה בתאים המעניינים, בהתאם לעכבר רוזה-עיתונאי שהופעל. תאים אלה, המסומנים באופן בלתי נמנע, ממשיכים לבטא את הכתב הזה לאחר חלוקה, התמיינות או נדידה, ומאפשרים מעקב אחר תאים אלה וצאצאיהם לאורך זמן או לאחר התערבויות שונות16. היתרונות של גישות התחקות אחר שושלת מהונדסות כוללים: 1) ספציפיות של התחקות אחר שושלת תאים מסוימת או אב/תא גזע המסומן על ידי rtTA, 2) ביטוי בל יימחה של החלבון הפלואורסצנטי או הזוהר למרות תחלופת התאים או התמיינותם, 3) רעילות נמוכה, 4) הפעלה מותנית בכל נקודה במחזור החיים של החיה, ו-5) קלות השימוש במבחנים נפוצים, כולל חיסון/אימונופלואורסצנציה16.

שיטות אחרות של כלי כתבים בלתי ניתנים להשראה בעכברים כוללות שימוש בעכברי Cre-ERT2, אשר ניתן להצמידם עם ROSA-GFP, ROSA-mTmG, או טרנסגנים אחרים של כתבים פלואורסצנטיים. בחיות אלה, אלמנט רגולטורי ספציפי לתא, כגון מקדם או אזור משפר עניין, מניע את הייצור של Cre recombinase, אשר יכול להיות מופעל רק באמצעות מתן טמוקסיפן. בעוד שקווי עכבר Cre-ERT2 מאפשרים השראה של Cre בקווי תאים ספציפיים, יש שפע של ידע המפרט את ההשפעות של טמוקסיפן על נוירוגנזה בוגרת17,18. בנוסף, קיימים גנים רבים של כתבים פלואורסצנטיים המונעים על ידי ROSA שניתן להשתמש בהם במקום GFP או mTmG, כולל YFP או CFP, אשר יאפשרו תיוג פלואורסצנטי חלופי באורכי גל פלואורסצנטיים אחרים. ניתן להשתמש בגנים אלה של דיווח פלואורסצנטי עם מערכות Tet-On או Cre-ERT2.

טרנסקריפטאז הפוך של טלומראז (TERT) הוא הרכיב המגביל את הקצב של ההולואנזים טלומראז, הפועל להרחבת הטלומרים לאחר קיצורם במהלך חלוקת התא19,20. TERT זוהה כסמן של תאי גזע של רקמה בוגרת במעי21,22, מח עצם21, כבד23, שומן24, רירית הרחם25,26 ועצם1. עדיין לא ידוע אם ביטוי TERT בתאי גזע בוגרים אלה נועד אך ורק לפעילות המרחיבה טלומראז או לביצוע תפקידי TERT שאינם קנוניים27. תאי גזע בוגרים (qASCs) המבטאים TERT זוהו ונמצאו במעקב ברחבי הגוף עם עכברי מעקב אחר שושלת מהונדסת כדי לחקור את יכולת הרב-פוטנטיות וההתחדשות העצמית של תאי גזע אלה, כמו גם את הפוטנציאל שלהם להפעיל, להתרבות, להתמיין ולהגר 1,22,23,28. יצירת הטרנסג'ן Tert-rtTA בוצעה בעבר1. במאמר זה נתאר את השימוש בקו עכברי TERT למעקב אחר שושלת כדי לחקור TERT + qASCs שזיהינו כאוכלוסיית ASC חדשנית במוח העכבר הבוגר.

יצירת שושלת מהונדסת העוקבת אחר קו עכברים
כדי ליצור קו עכברים המתחקה אחר שושלת באמצעות מערכת Tet-On, יש לשלב שלושה טרנסג'נדרים בתוך חיה אחת באמצעות הזדווגות עכברים. הראשון הוא rtTA, המתבטא בשליטתו של מקדם הגן המעניין (שלנו הוא TERT-rtTA). בתא שמבטא את הגן המעניין הזה, ה-rtTA יבוא לידי ביטוי. השני הוא גן oTet-Cre, המכיל אלמנט תגובת טטרציקלין (TRE) שיאפשר שעתוק של Cre רקומבינאז בנוכחות תעתיק היתוך rtTA וטטרציקלין או דוקסיציקלין. טטרציקלין או דוקסיציקלין יכולים להינתן לבעל חיים באמצעות מי שתייה או צ'או29. לבסוף, חייב להיות גן שיופעל על ידי מחשוף קר רקומבינאז. בכתב יד זה, גן התיוג שנתאר הוא הגן Rosa26-mTmG, אשר עד רקומבינציה של Cre תתמלל בכל מקום mTomato (פלואורסצנציה אדומה של קרום בכל התאים). עם זאת, אם תא מבטא את תעתיק ה-rtTA ומכיל טטרציקלין או דוקסיציקלין, רקומבינציה של Cre של קבוצה של אתרי lox P בין אתרי mTomato ו-mGFP תשנה את אתר R26 ותגרום לתא לייצר ממברנה EGFP (mGFP, או פלואורסצנציה ירוקה של ממברנה) במקום עגבניית ממברנה. האופי הבלתי ניתן למחיקה של אות mGFP זה יאפשר תיוג ומעקב in vivo של תאים בזמן שהם מתרבים, נודדים ומתמיינים. בעקבות העקבות, ניתן לנתח תאים לביטוי של GFP באמצעות אימונופלואורסצנציה בקריוזקציות סטנדרטיות או במוחות עבים יותר המנוקים אופטית.

במאמר זה נתאר את השימוש בקו העכבר הספציפי, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. כדי ליצור את קו העכברים המהונדס המשולש הזה, הזדווגנו תחילה עם חיות oTet-Cre (זן מעבדת ג'קסון #006234) עם חיות רוזה-mTmG (זן מעבדת ג'קסון #007676) כדי ליצור oTet-Cre::Rosa-mTmG עכברים מהונדסים כפולים. בעלי חיים אלה עברו גנוטיפ עם פריימרים ותבניות PCR שצוינו בטבלאות משלימות 1 ו-2. עכברי mTert-rtTA (שנוצרו על ידי דייוויד בריו1) הזדווגו לבעלי חיים oTet-Cre::Rosa-mTmG כדי ליצור mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG עכברים (איור 1A)1,30. מנגנון הפעולה של קו העכבר mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG מתואר באיור 1B.

אינדוקציה של דוקסיציקלין ועיצוב מרדף דופק
בעת תכנון ניסויים, חשוב לקחת בחשבון מספר גורמים שישפיעו על תוצאות ניסויי מעקב אחר שושלת, כולל גיל החיה באינדוקציה של דוקסיציקלין, משך מתן דוקסיציקלין (תקופת "הדופק"), משך הזמן לאחר הסרת דוקסיציקלין לפני איסוף הרקמות (תקופת "המרדף"), ותזמון ההתערבויות במהלך תהליכים אלה. שיקולי תכנון מחקר אלה חיוניים להבנת התאים המסומנים וצאצאיהם בסיום הניסוי. השלב הראשון בתהליך הוא לזהות את גיל העניין של החיה ואת משך מתן הדוקסיציקלין. תקופות פולס ארוכות יותר יאפשרו לפוטנציאל של תאים נוספים לבטא את המקדם המקושר ל-rtTA כדי לבוא לידי ביטוי ולכך שיותר תאים בעלי עניין יסומנו באופן בלתי נמנע. סוג תא המציג ביטוי חולף של הגן המעניין עשוי לדרוש תקופת דופק ארוכה יותר מאשר תאים המבטאים באופן רציף את הגן המעניין. עם זאת, אם מטרת המחקר היא להבין את ההשפעות קצרות הטווח של התא המעניין או התערבות חריפה, תקופת הדופק לא יכולה להיות ארוכה מדי, שכן ברגע שתא מסומן, הוא יעבור דרך כל מספר של שינויים במהלך שארית תקופת הדופק. בחלק מהמחקרים שלנו, דופק של יומיים ללא תקופת מרדף שימש כדי לחקות באופן הדוק יותר כתב ישיר עבור TERT. הסיבה לכך היא שמשך הזמן המינימלי לרקומבינציה של הגן Rosa-mTmG הוא יומיים31.

התקופה החיונית הבאה בניסוי מרדף דופק היא האורך שבין הסרת דוקסיציקלין לזלוף של החיה, הידוע גם בשם 'המרדף'. זמן מחצית החיים של דוקסיציקלין בעכברים הוא כ-170 דקות ללא קשר למסלול ההנחיה, מה שמאפשר את המסקנה כי אינדוקציה של דוקסיציקלין ככל הנראה כבר לא מתרחשת מספר שעות לאחר ההסרה32. עם זאת, חשוב לציין כי חילוף החומרים של דוקסיציקלין איטי יותר בעכברים מזדקנים, מה שעלול להוביל לתקופות 'דופק' יעילות יותר מאשר בעלי חיים צעיריםבני 33.

במהלך תקופת המרדף, תאים מסומנים ימשיכו להיות מסומנים, גם לאחר התפשטות, התמיינות או נדידה. גם הצאצאים של תאים אלה יסומנו. מטרת המחקר תעצב את אורך פרדיגמת מרדף הדופק. אם מטרת המחקר היא להבין את ההתחדשות של רקמה לאורך תקופה ארוכה של זמן עם התאים המעניינים, ייתכן שתידרש תקופת מרדף ארוכה. לבסוף, יש להחליט על עיתוי ההתערבויות או הטיפולים. מתן במהלך תקופת הדופק ישפיע על התאים המבטאים את גן העניין כמו גם על כל צאצא שנוצר במהלך תקופה זו, בעוד שהמתן במהלך תקופת המרדף עשוי להשפיע בעיקר על צאצאי התאים המעניינים, אם כי הדבר יהיה תלוי במהירות שבה התאים המסומנים מתחלקים או מתמיינים. דוגמאות לתכנון ניסיוני של מרדף דופק שהשתמשנו בו מתוארות באיור 2A.

חשוב גם להיות מודעים לאפשרות של אות GFP ברקע עקב ביטוי דולף. ביטוי דולף מתרחש כתוצאה מפוטנציאל קשירה מובנה בין rtTA לרצפי Otet בהיעדר דוקסיציקלין, ופעילות שיורית של הטרנסג'ן Otet בהיעדר rtTA (נבדקב-34). ביטוי דולף מייצג חולשה אחת של מערכות Tet, ואף על פי שהדליפה היא לעתים קרובות חיסרון מקובל על המערכת, מצבים שבהם הביטוי הדולף יכול להוביל לרעילות ותמותה, כגון עם רעלן דיפתריה (DTA) בחיות Otet-DTA יכולים להגביל את השימוש במערכות אלה35.

עיבוד מוח, חתך ואימונופלואורסצנציה של מקטעים דקים למיקרוסקופיה
כדי לנתח את מוחותיהם של עכברים לאחר ניסוי מעקב אחר שושלת, יש להחדיר תחילה עכברים באמצעות עירוי טרנסקרדיאלי כדי להסיר דם ו- CSF שיכולים להוביל לפלואורסצנציה אוטו-פלואורסצנטית גבוהה במוח. ישנם שני מקבעים נפוצים שהחיה עשויה להיות חדורתם אליהם: מקבע רקמת היסטוכואיצה, מקבע גליוקסלי (GF), או 4% פרפורמלדהיד (PFA). קיבועים גליוקסלים מאפשרים תהליך קיבוע עדין יחסית עם פחות קישורים צולבים מאשר PFA. זה מפחית את נוקשות הרקמות, מפחית את הצורך בשליפת אנטיגן, ומאפשר פתרונות נוגדנים פחות מרוכזים במהלך חיסון. עם זאת, אם הם מכילים מתנול זה עשוי לשמש להגברת autofluorescence36. מצד שני, PFA יאפשר לעתים קרובות קיבוע חזק יותר, ובעוד שאחזור אנטיגן יידרש במהלך חיסון, ישנם נוגדנים שיעבדו רק עם רקמות קבועות PFA, וזלוף עם 4% PFA נדרש עבור טכניקת הסליקה האופטית שתואר מאוחר יותר.

מעקב אחר פרפוזיה הוא שלב שלאחר הקיבעון, שבו המוחות שקועים באותו סוג של קיבוע המשמש במהלך הזלוף במהלך הלילה. זה מאפשר לכל אזורי המוח שאולי לא תוקנו במלואם במהלך הזלוף להמשיך לתקן. לאחר מכן, המוחות ידוגרו בסוכרוז בסוכרוז במי מלחים מוחזקים בפוספט (PBS) כדי להסיר כמה שיותר מים לפני שלב ההקפאה כדי למנוע היווצרות קרח בתוך הרקמה ("שימור קריו"). לאחר מכן ניתן לחתוך את המוחות לכל מספר של מקטעי רקמות סגיטליים, קורונליים או רוחביים לצורך עיבוד. הן מבחינת הדיוק והן מבחינת יכולת השכפול, יש להשתמש בבלוקים מכוילים של המוח באופן שיבטיח חתכי ברגמא עקביים בין בעלי חיים. הגורם החשוב ביותר שיכול להשפיע על אופן חתך המוח הוא אזורי המוח המעניינים. לדוגמה, בעוד שחתך סגיטלי עשוי לאפשר לנתח יותר אזורי מוח בקטע רקמה אחד, חתך זה לא יאפשר ניתוח של אזורים נוירו/גליוגניים של האזור התת-חדרי החדרי (V-SVZ) מכיוון שהצדדים הצדדיים והמדיאליים של החדר הצדדי יהיו בלתי ניתנים להבחנה במימד זה והם נצפים טוב יותר במישור הקורונלי. זו יכולה להיות הבחנה חשובה שיש לעשות במחקרי נוירוגנזה למבוגרים, שכן הצד הצדדי של החדר הצדדי מכיל את V-SVZ הנוירוגני, בעוד שהדופן המדיאלית של החדר הצדדי היא נישה גליוגנית יותר37.

לאחר שהרקמות חולקו למקטעים קורונליים, סגיטליים או רוחביים, הן יוקפאו לבלוקים באמצעות תמיסת הטבעה אופטימלית של טמפרטורת קירור (OCT). כאן, המוחות קפואים בתוך החומר המטביע הזה, עם שימוש בתערובת של קרח יבש ואתנול. אם נדרש ניתוח מקטע דק, בלוקים ייפרסו על קריוסטאט, ובהתאם לניתוח במורד הזרם הנדרש ניתן לדבוק בשקופיות זכוכית טעונות חיובית כמקטעים דקים (<20 מיקרומטר). ניתן להשתמש גם בשקופיות זכוכית שאינן טעונות, אך השימוש בשקופיות לא טעונות עלול לגרום לרקמות להתנתק מהשקופיות38. אם נדרשים מקטעי רקמה צפים חופשיים בעובי בינוני (>20 מיקרומטר), הרקמות ייאספו כמקטעים צפים חופשיים. אם נדרשים חלקים עבים (0.5-4 מ"מ), נדרש חיתוך של מקטעי מוח שאינם קפואים עם ויברטום. חשוב לציין את הבדלי האחסון בין מקטעי האחסון בשקופיות, הדורשים הקפאה בטמפרטורה של -20 עד -80 מעלות צלזיוס ומקטעים צפים חופשיים, אשר יאוחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

ניקוי מוח ומיקרוסקופיה קונפוקלית אימונופלואורסצנטית שלמה
אם רוצים ניתוח רחב יותר, אך פחות מפורט, של התאים שעוקבים אחר שושלת במוח העכבר, ניתוח מקיף של מקטעים עבים יותר של רקמת המוח אפשרי עם ניקוי מוח iDISCO39 ואחריו מיקרוסקופיה קונפוקלית של אימונוסטיזציה ואריחים של z-stack או מיקרוסקופיה של יריעות אור. כאן, חלקים גדולים של מוח העכבר יפונו אופטית (תהליך של דליפידציה39), מה שמאפשר טוב יותר הדמיית אותות פלואורסצנטיים על פני קטע רקמה של 1 מ"מ. החסרונות של תהליך זה הם אוטופלואורסצנציה גבוהה ויכולת מופחתת להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה של מורפולוגיה של תאים וניתוח מפורט של צביעה משותפת בשל מרחקי העבודה המוגדלים הנדרשים בהשוואה לשיטות מסורתיות יותר (קריוזקציות דקות או מקטעים צפים חופשיים). מסיבה זו, אנו ממליצים על ניקוי המוח כדי לנתח את תוצאות מעקב השושלת בקנה מידה גדול באזורי מוח מרובים, במקום לנסות לאפיין או לנתח תאים בודדים.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת מדינת אוהיו.

1. יצירת שושלת המתחקה אחר קו עכברי טט-און, אסטרטגיות רבייה וגנוטיפ עבור עכברי קוהורט ניסיוני

הערה: כאן, אנו מתארים את היצירה של מערכת עכבר Tet-On עם Rosa-mTmG כגן הכתב הפלואורסצנטי שעובר רקומבינציה של Cre, אולם ניתן להשתמש בקווי כתבים אחרים המונעים על ידי Cre-recombination גם עם מערכת Tet-On.

  1. הגדר כלוב הזדווגות של זכר oTet-Cre אחד (+/-) עם נקבה אחת או יותר מסוג R26 (mTmG) (+/+). ראה איור 1 לקבלת סקירה כללית של מערך ההזדווגות הניסיוני של העכבר.
  2. הגורים שיתקבלו (F1) יהיו oTet-Cre (+/-) או oTet-Cre (-/-) ו-R26 (mTmG) (+/-). בצעו גנוטיפ לפי הפריימרים בטבלה משלימה 1 ובפרוטוקולים בטבלה משלימה 2.
  3. בעת הגמילה, בצע בדיקת germline על ידי לקיחת אגרוף אוזן מכל גמילה. בחנו את אגרוף האוזן תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בספקטרום GFP/FITC כדי לקבוע אם החיה עברה רקומבינציה של חיידקים בהתפתחות. אם כן, החיה תבטא GFP בכל תא, ואגרוף האוזן יהיה פלואורס עם אות mGFP. לא ניתן להשתמש בבעלי חיים אלה להזדווגות או לניסויים.
    הערה: קליפס אוזניים מעכברים שאינם חיידקים מראים רק פלואורסצנציה אנדוגנית מתחת למיקרוסקופ (איור 1C), בעוד שבעלי חיים של חיידקים מראים אות GFP בהיר (איור 1D). אוזני בקרה יכולות להיות מעכברים שאינם מכילים טרנסגנים פלואורסצנטיים. כהערה, לשערות אוזניים יש פלואורסצנציה אנדוגנית גבוהה ואין להשתמש בהן כגורם מכריע (איור 1C). בנוסף, נצפים הבדלים בפלואורסצנציה האנדוגנית בין עכברים בצבע פרווה לבן לעומת שחור, ויש להשתמש בבקרות מעכברים באותו צבע פרווה כמו עכברים שנבדקו בניתוח זה.
  4. חבר זכר אחד oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/-) עם נקבה אחת או יותר oTet-Cre (-/-) x R26 (mTmG) עכברים.
  5. הדור שייווצר (F2) יהיה 1/4 R26 (mTmG) (+/+) ו-1/2 Cre (+/-). חצו את בעלי החיים האלה עם בעלי חיים mTert-rtTA (+/+) על ידי הזדווגות אחת של oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) עם חיה אחת או יותר של mTert-rtTA (+/+).
    הערה: השתמשנו בבעלי חיים mTert-rtTA (+/+), אך ניתן לבצע תהליך זה עם כל קו עכבר rtTA30.
  6. עבור בעלי חיים ניסיוניים, הגדר רבייה כדי ליצור mTert-rtTA (+/+) או (+/-) x oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) או (+/-).

2. אינדוקציה דוקסיציקלין של Cre ועיצוב מרדף דופק

  1. כאשר בעלי חיים נמצאים בגיל הנכון לתחילת המחקר, החליפו את מי השתייה שלהם במי דוקס: מי שתייה המכילים 5% סוכרוז ו-2 מ"ג/מ"ל היקלט דוקסיציקלין. השתמש בחיות Cre-negative המקבלות את אותו מרדף דופק של דוקסיציקלין כמו חיות ניסוי כקבוצת ביקורת לדפוסי הביטוי הפלואורסצנטיים המתקבלים.
    1. לאחר ההכנה, יש לאחסן מי דוקס בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש אחד. ראה טבלה 1 לקבלת מידע נוסף. מי דוקס עשויים להינתן לבעלי חיים בבקבוקי שתייה עד 5 ימים לפני שהם מוחלפים, שכן צמיחה פטרייתית יכולה להתרחש אם מי דוקס נשארים בחוץ בטמפרטורת החדר לפרקי זמן ארוכים יותר.
      הערה: פולס דוקסיציקלין של יומיים לפחות נדרש להשראת אות mGFP בעת שימוש בטרנסגן mTmG (נייר mTmG ראשוני).
      הערה: לא בדקנו ריכוזי דוקסיציקלין מלבד 2 מ"ג/מ"ל. ספרות קודמת זיהתה כי ריכוז זה יש את ההשפעות הגבוהות ביותר כאשר הוא מנוהל באמצעות מי שתייה29. כמות הדוקסיציקלין המועברת עשויה להשתנות בהתאם לכמות השתייה שנעשית על ידי כל חיה. ניתן גם לבצע הזרקת דוקסיציקלין או גאבאג' על מנת להיות עקביים בין בעלי חיים40.
  2. לאחר תום תקופת הדופק, הסירו את מי הדוקס מהכלובים והחליפו במי שתייה רגילים. החיות יהיו כעת בתקופת 'המרדף' עד המוות.

3. זלוף טרנסקרדיאלי ונתיחה מוחית

  1. מוציאים עכבר מהכלוב שלו ומרסנים את החיה באמצעות האגודל השמאלי והאצבע הקדמית. הזריקו לבעל החיים באמצעות הזרקה תוך-צפקית (i.p.) עם תמיסה של 100 מ"ג/מ"ל קטמין ו-20 מ"ג/מ"ל קסילאזין ב-0.9% מי מלח סטריליים לריכוז סופי של 200 מ"ג/ק"ג קטמין ו-20 מ"ג/ק"ג קסילאזין. ראה טבלה 1 לקבלת מידע נוסף.
    אזהרה: הפרוטוקולים להרדמה עשויים להשתנות בהתאם למדינה. בנוסף, ישנן השפעות של הרדמה על המוח, כולל שינויים במורפולוגיה ובפעולה של מיקרוגליאלי ורמות קורטיקוסטרון שיש להבין בעת ביצוע זלופים לצורך איסוף וניתוח המוח41,42.
  2. לאחר כ-1-2 דקות החיה תאבד את הרפלקס הימני שלה. כדי לבחון זאת, פשוט גלגלו את החיה על גבה ואם היא לא יכולה להתגלגל חזרה על רגליה, היא איבדה את הרפלקס הימני.
  3. לאחר כ 5-10 דקות החיה תאבד את רפלקס הדוושה שלה. כדי לבדוק את רפלקס הדוושה, השתמש באגודל ובאצבע כדי לצבוט כל אחת מכפות הרגליים של החיה. אם אין תגובה, בצורה של קפיצה או התכווצות שרירים, השתמש בציפורניים של האגודל והאצבע כדי לצבוט כל אחת מכפות הרגליים של החיה. אם אין תגובה, החיה איבדה את רפלקס הדוושה.
    הערה: אם החיה מגיבה לרפלקס הדוושה במשך יותר מ-15 דקות לאחר ההזרקה, ייתכן שיהיה צורך בזריקה נוספת של 1/2 מהזריקה הראשונית של קטמין/קסילאזין. גיל, מין, גנוטיפ, פנוטיפ וטיפול עשויים להשפיע על התגובה של החיה לקוקטייל התרופה הזה.
  4. לאחר שהולכים לאיבוד רפלקסים ימניים ודוושות, בדקו את רפלקס העין על ידי מגע קל עם גלגל העין של העכבר עם אצבע עם כפפות. חוסר תגובה מצביע על כך שרפלקס העיניים אבד.
  5. אבטח את העכבר במצב שכיבה עם כפות המוצמדות למשטח עבודה הניתן להצמדה.
  6. בצע חתך דרך העור עם מספריים כירורגיים לאורך קו האמצע של בית החזה בערך 1-2 ס"מ מתחת לתהליך xiphoid. חותכים מעולה עד בתהליך ה-xiphoid.
  7. לתפוס את הסחוס של תהליך xiphoid עם מלקחיים. מכניסים מספריים וחותכים דרך השרירים והצלעות באלכסון לאורך צדו הימני של העכבר עד לרמה של המנעולים.
    1. הרימו את שרירי בית החזה עם מלקחיים וחתכו את הסרעפת עד שניתן יהיה לדמיין את הלב. לאחר מכן בצע חתך אלכסוני זהה לאורך צדו השמאלי של העכבר, תוך הקפדה למנוע כל מגע עם הלב. השתמש hemostat כדי להרחיק את שרירי בית החזה מן החלל.
      הערה: בשלב זה, העכבר לא יוכל לנשום יותר, לכן פעל במהירות כדי למנוע מוות לפני השלבים הבאים.
  8. אבטח את הלב הפועם עם מלקחיים קהים והכנס מחט מחלק לחדר השמאלי דרך בסיס קשת אבי העורקים.
  9. מהדק את בסיס המחט לחדר השמאלי ממש מעל אתר ההחדרה.
  10. בצע חתך באטריום הימני, ובסימן הראשון לזרימת הדם, התחל לחדור את החיה עם 20 מ"ל של 1x PBS ב 8.11 מ"ל לדקה.
  11. לאחר ש- 1x PBS עיצב את הגוף, עבור למתקן המתאים ליישום במורד הזרם ותנקב את העכבר עם 20 מ"ל של fixative.
    1. לצורך חתך קפוא ושמירה חיסונית, החדירו את בעלי החיים עם מקבע הגליאוקסלים לניקוי המוח, הוסיפו לבעל החיים 4% PFA ב-1x PBS (pH 7.4).
      הערה: סימנים של זלוף מוצלח כוללים נוקשות של בעלי חיים (נוקשות קלה עם גליוקסל, נוקשות אינטנסיבית עם PFA) וחוסר כלי דם גלויים ברחבי הרקמות.
  12. ערפו את העכבר והסירו את המוח על ידי החדרת מספריים לגזע המוח וחיתוך לאורך התפר הסקומוסלי עד לתפר הקדמי בכל צד. לאחר מכן חותכים את התפר הגופני כדי להסיר את מכסה הגולגולת, נזהרים שלא לפגוע בנורת חוש הריח. משם, סובבו את הגולגולת על פיה, והשתמשו במלקחיים מעוקלים כדי להסיר את המוח, תוך הקפדה לנתק את עצב הראייה.
  13. הניחו את המוח החדור במחסנית טישו ושקעו בקיבוע המשמש להחדרת החיה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

4. טיפול במוח, חיתוך ומחלות חיסון

  1. טיפול מוחי וחיתוך
    1. יש להסיר מחסניות מוח מהמתקן הגליאוקסלי ולדגום ב-15% סוכרוז ב-1x PBS למשך יומיים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או עד שהמוח ישקע.
    2. הסר מחסניות מוח מ-15% סוכרוז ודגירה ב-30% סוכרוז ב-1x PBS למשך יומיים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או עד שהמוח ישקע.
      הערה: ראה טבלה 1 לקבלת מידע נוסף.
    3. יש להסיר מוחות מ-30% סוכרוז ב-1x PBS ולהפריד את המוח ל'בלוקים' שונים באמצעות גוש מוח קורונלי או גוש מוח סגיטלי.
    4. הטמיעו מקטעי מוח קורונליים או סגיטליים במתחם OCT על ידי הנחת מקטעי מוח על תערובת של קרח יבש ואתנול (EtOH). לאחר ש-OCT הפך ללבן והופך למוצק, מוציאים מתערובת קרח-EtOH יבשה ומאחסנים עטופים בפרפילם, בתוך שקית אטומה לאוויר בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    5. מוציאים בלוקים קפואים מהמקפיא ומניחים בתוך קריוסטאט עם טמפרטורה פנימית שנקבעה ל -20 מעלות צלזיוס. השתמש ב- OCT כדי לחבר את הבלוק לצ'אק מתכת כך שהרקמה תהיה מחוברת היטב. אפשר ~ 5 דקות לרקמה לקפוא לצ'אק. פורסים את הרקמה ב-7 מיקרומטר, ומניחים כל פרוסת טישו על מגלשת זכוכית טעונה.
    6. אפשרו לשקופיות לאפות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הניחו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש במחלות חיסון.
  2. חיסון
    1. שקופיות חמות לטמפרטורת החדר (RT) ולאחר תיקון עם אצטון קר כקרח למשך 15 דקות.
    2. יש לשטוף שקופיות למשך 5 דקות במאגר שטיפה אחד (לדוגמה, IHC Select TBS Wash Buffer), ולרעוד ב-60 סל"ד ב-RT בין כל שלב.
    3. Permeabilize עבור צביעה של אנטיגנים גרעיניים עם 0.3% Triton X-100 למשך 10 דקות ב- RT. Permeabilize עבור צביעה של אנטיגנים ציטופלסמיים עם 0.3% Tween-20 במשך 10 דקות ב- RT.
    4. בצע שליפת אנטיגן על ידי שקופיות microwaving ב 50-100 מ"ל של 1x DAKO אנטיגן אחזור פתרון נמוך על נמוך במשך 10 דקות, פעמיים. לאחר מכן יש לשטוף עם מאגר שטיפה למשך 5 דקות ב-RT.
    5. דגירה מחליקה ב-0.3% טיפוגן שחור ב-70% EtOH למשך 20 דקות ב-RT ולאחר מכן לשטוף עם מאגר שטיפה.
    6. ציירו מחסום הידרופובי סביב כל רקמה מבלי לאפשר לרקמות להתייבש. לאחר מכן חסום למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טיפה אחת של ריאגנט חוסם מיליפור לכל רקמה. לאחר מכן הוסיפו 100 μL נוגדן ראשוני מדולל בנוגדנים מדולל לכל רקמה ודגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    7. למחרת, דגירה של מקטעים בנוגדנים משניים של Alexa Fluor למשך 10 דקות ב- RT. לאחר מכן יש לשטוף מגלשות במאגר שטיפה.
    8. מכסים את מקטעי המוח ב-100 μL של 1:500 נוגדן נגד GFP המצומד ל-AlexaFluor 488 כדי להגביר את אות ה-GFP האנדוגני המסמן את התאים המאותתרים ולדגירה במהלך הלילה ב-4 °C (64 °F).
    9. למחרת, יש לשטוף עם חיץ שטיפה 2x, ולאחר מכן לשטוף במי DI זורמים במשך 5 דקות.
      הערה: הקפידו לשטוף בעדינות במי DI, תוך הקפדה על הימנעות ממים זורמים במגלשות עצמן שעלולות להסיר מקטעי מוח ממגלשות.
    10. נגדי עם 100 ננוגרם/מ"ל 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) למשך 5 דקות. לאחר מכן לשטוף במי DI זורמים במשך 5 דקות.
    11. מוסיפים טיפה של מדיום הרכבה על גבי כל מקטע רקמה ואטמים עם כיסוי של 22 מ"מ x 22 מ"מ. הדמיה מומלצת ביום ההרכבה כדי להבטיח אות אופטימלי.

5. ניקוי מוח iDISCO (מותאם מ-39)

  1. קיבוע וחתך
    1. מוחות לאחר תיקון ב 4% PFA לילה ב 4 ° C ולאחר מכן שוב עבור 1 שעה ב RT.
    2. שטפו מוחות ב-1x PBS במשך שעה, פעמיים, ב-RT. לאחר מכן חותכים למקטעים בעובי 1 מ"מ באמצעות בלוק המוח הדרוש ומניחים לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה של 5 מ"ל המכילים 1x PBS.
  2. מתנול טרום טיפול (עם מתנול)
    הערה: בשל האפשרות שמתנול ישפיע על חיסון של חלבונים מסוימים, המחברים רוצים להפנות את הקורא ל- Renier et al. 2014 עבור פרוטוקול לפרוטוקול iDISCO ללא מתנול חלופה39. ראה טבלה 1 לקבלת מידע נוסף אודות הפתרונות הבאים בסעיף זה.
    1. יש לשטוף עם 1x PBS למשך שעה אחת פעמיים (רעד) ב-RT.
    2. יש לשטוף ב-50% מתנול (ב-PBS) למשך שעה אחת (טלטול) ב-RT.
    3. יש לשטוף ב-80% מתנול למשך שעה אחת (טלטול) ב-RT.
    4. יש לשטוף ב-100% מתנול למשך שעה אחת פעמיים (רעד) ב-RT.
    5. דגימות אקונומיקה עם 5% מי חמצן (H2O2) ב-20% דימתיל סולפוקסיד (DMSO)/מתנול (1 נפח 30% H2O2/1 נפח DMSO/4 נפח מתנול, קר כקרח) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה (רעידות).
    6. לאחר ההלבנה, שטפו דגימות במתנול במשך שעה אחת פעמיים (רעד) ב-RT.
    7. יש לשטוף ב-20% DMSO/מתנול למשך שעה אחת פעמיים (רעד) ב-RT.
    8. יש לשטוף ב-80% מתנול למשך שעה אחת (טלטול) ב-RT.
    9. יש לשטוף ב-50% מתנול למשך שעה אחת (רעד) ב-RT.
    10. יש לשטוף ב-PBS במשך שעה אחת פעמיים (רועדת) ב-RT.
    11. יש לשטוף ב-PBS/0.2% טריטון X-100 למשך שעה אחת פעמיים (רועד) ב-RT.
  3. חיסון של מוחות מנקים
    1. דגימות אינקובציה ב-1x PBS/0.2% Triton X-100/20% DMSO/0.3 M גליצין ב-37 מעלות צלזיוס בלילה על שייקר מסלולי.
    2. יש לחסום ב-1x PBS/0.2% טריטון X-100/10% DMSO/6% סרום עיזים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים על שייקר מסלולי.
    3. יש לשטוף דגימות ב-1x PBS/0.2% Tween-20/10 μg/mL מלח נתרן הפרין מרירית חזירית למשך שעה אחת פעמיים ב-37 °C, ולאחר מכן לדגום ב-1x PBS/0.2% Tween-20/10 מיקרוגרם/מ"ל הפרין/5% DMSO/3% סרום עיזים המכיל 1:500 ריכוז של ארנב נגד GFP AlexaFluor 488 ב-37°C על שייקר מסלולי למשך יומיים.
    4. יש לשטוף דגימות ב-1x PBS/0.2% Tween-20 עם 10 מיקרוגרם/מ"ל הפרין למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולי, שלוש פעמים, ולאחר מכן פעם ביום במשך יומיים.
    5. דגימות הדגירה במשך הלילה ב-10 מ"ל של 50% v/v Tetrahydrofuran (THF)/H2O בצינור חרוטי של 15 מ"ל.
    6. דגימות דגירה במשך שעה אחת ב-10 מ"ל של 80% THF/H2O.
    7. דגימות דגירה פעמיים במשך שעה אחת ב-100% THF.
    8. דגימות יבשות עם מגבון סטרילי ודגירה בדיכלורומתאן עד שהן שוקעות לתחתית הבקבוקון (כ-40 דקות). אין לדוג >60 דקות.
      הערה: הקפידו לטפל בדיכלורומתאן מתחת למכסה אדים.
    9. דגירה דגימות ב-18 מ"ל של אתר דיבנזיל (DBE) עד לשחרור (>2 שעות).
    10. אחסן דוגמאות ב- DBE ב- RT עד שהן מוכנות לתמונה.
      הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, חשוב לצלם דגימות בהקדם האפשרי לאחר השלמת הניקוי.

6. הדמיה של שקופיות מוכתמות או מוחות מנוקים

  1. כדי לצלם מקטעי מוח מוכתמים במערכת החיסון, נתחו שקופיות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, שבהן ניתן לאשר ביטוי משותף של נוגדנים מרובים. אנו משתמשים במיקרוסקופ Leica Stellaris 5 עם גלאים היברידיים HyD S, אך כל מיקרוסקופ קונפוקלי של סריקת נקודה יעבוד. המטרות כוללות HC PL APO 10x/0.40 CS2, HC PL APO 40x/1.30 OIL CS2, ו- HC PL APO 63x/1.40.
    1. הגדר את קווי הלייזר ומסנני הפליטה הנכונים. הלייזרים הנדרשים ועוצמות הלייזר המתאימות כפופים לשילובי המיקרוסקופ והפלואורופור הנמצאים בשימוש.
      הערה: אנו משתמשים בשילוב של דיודה 405 ננומטר ולייזרים של אור לבן כדי לכוונן את העירור העדין וספקטרום הפליטה עבור כל פלואורופור, או קבוצות של פלואורופורים, המשמשים להפחתה ומניעת הצלבה. תוצאות דומות ניתן להשיג גם באמצעות שילובי לייזר/מסנן מסורתיים, אך שימו לב היטב לדימום בתעלה. ניתן לזהות את הדימום על ידי הפעלת קו לייזר יחיד בשילוב עם כל אחד משילובי מסנני הפליטה הרצויים כדי לראות אילו ערוצים מושפעים מכל לייזר ספציפי. לדוגמה, אם הלייזר של הדיודה 405 ננומטר מייצר פלואורסצנציה נראית לעין במסנן הפליטה GFP, יש דימום דרך התרחשות. ודא כי ערוצים מרובים יצולמו ברצף מסגרת אחר מסגרת כדי להפחית באופן משמעותי כל דימום דרך התרחשות.
    2. עבור מוחות Tet-On מוכתמים יחד עם כתב mTmG, בחר DAPI (לדוגמה, 405 ננומטר, em. 450 ננומטר), GFP (לדוגמה, 488 ננומטר, em. 509 ננומטר), tdTomato (לדוגמה, 555 ננומטר, em. 582 ננומטר), והפלואורופור האדום-רחוק המתאים להתאמה לפלואורופור המשמש את הנוגדן המשני. אנו ממליצים על Alexa Fluor 647 (לדוגמה, 651 ננומטר, em. 667 ננומטר).
    3. קבעו תחילה הגדרות עם מוח בקרת Cre המוכתם הן ב-GFP והן במשני הפלואורסצנטי. פרוסות המוח האלה ישלטו בפלואורסצנציה ברקע מהנוגדנים הפלואורסצנטיים ולא יראו שום אות GFP אמיתי.
    4. נתחו כל מקטע מוח מלמעלה למטה, משמאל לימין, כדי לוודא שאף אות לא הוחמץ בניתוח. אם מדמיינים את אותו מקטע מוח בהגדלה שונה, מומלץ להשתמש תחילה בהגדלה הנמוכה יותר, שכן ההגדלה הגבוהה יותר תלבין מהר יותר את אות ה-mTomato.
  2. כדי לצלם מוחות מנוקים, השתמשו במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך עם שלב אוטומטי ופונקציית ריצוף אוטומטית. אנו משתמשים במיקרוסקופ Leica Stellaris 5. מכיוון שהדגימות כה עבות (>500 מיקרומטר), נדרשים מרחקי עבודה גדולים יותר המגבילים את ההגדלה שניתן להשיג ביעילות. אנו משתמשים ביעד HC PL APO 10x/0.40 CS2 עבור כל הדמיית המוח המנוקה.
    1. התחילו בהנחת קטע מוח מנוקה שטוח על צלחת תחתית זכוכית ושקעו באתר דיבנזיל.
      הערה: אתר Dibenzyl הוא קורוזיבי לרוב העדשות האובייקטיביות ולרוב הפלסטיקים. מסיבה זו, כל פלסטיק פנימי בצלחת התחתונה מזכוכית צריך להיות מצופה באלסטומר סיליקון מתייבש במהירות.
    2. הגדר את קווי הלייזר ומסנני הפליטה הנכונים. עבור מוחות Tet-On מוכתמים יחד עם כתב mTmG, בחר DAPI, GFP, tdTomato, ואת הפלואורופור האדום הרחוק המתאים כדי להתאים את הפלואורופור המשמש את הנוגדן המשני. הגדר את הרזולוציה הרצויה, אנו ממליצים לפחות 1024 x 1024. הגדר את חור הסיכה ל- 1 AU.
    3. קבעו תחילה את עוצמת הלייזר ואת רווח הגלאי באמצעות מוח בקרת Cre המוכתם הן ב-GFP והן במשני הפלואורסצנטי. פרוסות המוח האלה ישלטו בפלואורסצנציה ברקע מהנוגדנים הפלואורסצנטיים ולא יראו שום אות GFP אמיתי.
    4. לאחר אופטימיזציה של עוצמות לייזר ורווח גלאים, מיפו את המוח להדמיה. התחל על ידי איתור כל ההיקף של מקטע המוח כדי להגדיר את ציר X ו- Y של רכישת התמונה. לאחר מכן, זהה את ציר Z על ידי הגדרת נקודת המוקד בערך לעומק מרכז הרקמה, והשתמש בבקרות מיקום Z כדי לאתר את הנקודה "הגבוהה ביותר" של הרקמה (ערך ה-Z החיובי ביותר). סרוק אזורים שונים של הרקמה ומגדיל את גובה ציר ה- Z המרבי לפי הצורך.
      1. חזור על הפעולה עבור הנקודה "הנמוכה ביותר" (בעלת ערך Z השלילי ביותר) הנדרשת כדי לקבל את כל עובי הרקמה. לסטלריס 5 יש גבול של ± 250 אום של נקודת המוקד. זה מגביל את החלקים האופטיים לעובי של 500 מיקרומטר בציר Z. האזור התלת-ממדי של החלק במוח ידוע כיום.
    5. הגדר את גודל שלב Z ל- 6 מיקרומטר והתחל לרכוש את התמונה. זמן הרכישה תלוי במספר גורמים ויכול לנוע בין שעות לימים בהתאם לפרמטרים הרצויים. כדי להקטין את זמן רכישת התמונה, נסו להקטין את הרזולוציות, להגדיל את מהירות סריקת הלייזר או להגדיל את גודל הצעד.
    6. לאחר שהתמונה המרוצפת של כל קטע המוח המנוקה נלכדה, נתחו לפי הצורך.

תוצאות

בעוד שהאות הפלואורסצנטי הנובע ממערכת Tet-On עם כתב פלואורסצנטי ישתנה בהתאם למקדם העניין ולפלואורופור(ים) שבו נעשה שימוש, נתאר כיצד ניתחו ממצאים עם mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG בעלי חיים. ניתוח של מוחות בוגרים לאחר מרדף דופק הביא לתאים המבטאים GFP בממברנה בנישות אנטומיות שונות. יש לציין את ההבדל בעוצמת הפ...

Discussion

מתוארת שיטה ליצירה, ניצול וניתוח של שושלת משולשת מהונדסת המתחקה אחר קו עכברים המסמנת תאי גזע בתוך מוח העכבר הבוגר in vivo. בשילוב עם חיסון או ניקוי מוחי, ניתן לבצע זיהוי ואפיון של תאים פלואורסצנטיים במעקב ברחבי המוח. טכניקה זו מציעה את היכולת להבין את פוטנציאל הפלסטיק/התחדשות/שיפוץ של תא?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לד"ר דיאנה קרלון (בית החולים לילדים בבוסטון, בית הספר לרפואה של הרווארד) ולד"ר מתיו ליינס (מרכז ג'וסלין לסוכרת; מכון המחקר של המרכז הרפואי מיין) להדרכה המשתמשת בבעלי חיים mTert-rtTA.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibody diluentAgilentS080983-2
Antigen Retrieval SolutionAgilentS2367
anti-GFP antibodyInvitrogenA2311Use at 1:500-1:000
AcetoneFisher ScientificA18-4
B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/JThe Jackson LaboratoryJAX:006234
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/JThe Jackson LaboratoryJAX:007676
Blocking Solution (IHC)Millipore Sigma20773
Blunt needleBSTEANX0012SYHIV
Coronal brain blockBraintreeBS-2000C
Cover slipCorning2850-22
CryostatLeicaCM1900
DAPISigma-AldrichD564
Dibenzyl etherMillipore Sigma33630
DichloromethaneSigma-Aldrich270997
Dimethyl SulfoxideSigma-AldrichD8418
Donkey SerumSigma-AldrichD9663
Doxycycline HyclateSigma-AldrichD9891
GlycineBio-Rad161-0718
Heparin Sodium Salt from Porcine MucosaSigma-AldrichH3393
Histochoice Molecular Biology Tissue FixativeAmrescoH120This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)
Hydrogen Peroxide SolutionSigma-Aldrich516813
IHC Select TBS Rinse BufferMillipore Sigma20845
KetamineWestward0143-95095-10This product requires a DEA license for storage and use.
MethanolFisher ScientificA452-4
Microscope SlidesFisherbrand12-550-15
Milipore BlockMillipore20773
Mounting mediumMillipore Sigma5013
Optimal Cutting Temperature SolutionSakura4583
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
PBS Solution (10X)TeknovaP0496
Sagittal brain blockBraintreeRBM-2000S
SalineBraunS8004-5264
SucroseSigma-AldrichS7903
Sudan (Typogen) BlackMillipore Sigma199664
TetrahydrofuranSigma-Aldrich186562
Tissue cartridgeSimportM512
Triton X-100Bio-Rad1610407
Tween-20Millipore Sigma655205
XylazineAnaSedsc-362950Rx

References

  1. Carlone, D. L., et al. Telomerase expression marks transitional growth-associated skeletal progenitor/stem cells. Stem Cells. 39 (3), 296-305 (2021).
  2. Altman, J., Das, G. D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. Journal of Comparative Neurology. 124 (3), 319-335 (1965).
  3. Cameron, H. A., Gould, E. Adult neurogenesis is regulated by adrenal steroids in the dentate gyrus. Neuroscience. 61 (2), 203-209 (1994).
  4. Kaplan, M. S., Hinds, J. W. Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs. Science. 197 (4308), 1092-1094 (1977).
  5. Gould, E., et al. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult tree shrew is regulated by psychosocial stress and NMDA receptor activation. Journal of Neuroscience. 17 (7), 2492-2498 (1997).
  6. Eriksson, P. S., et al. Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nature Medicine. 4 (11), 1313-1317 (1998).
  7. Gould, E., et al. Neurogenesis in adulthood: a possible role in learning. Trends in Cognitive Science. 3 (5), 186-192 (1999).
  8. Hastings, N. B., Gould, E. Rapid extension of axons into the CA3 region by adult-generated granule cells. Journal of Comparative Neurology. 413 (1), 146-154 (1999).
  9. Hu, V. W., et al. 3H-thymidine is a defective tool with which to measure rates of DNA synthesis. The FASEB Journal. 16 (11), 1456-1457 (2002).
  10. Cifuentes, M., et al. A comparative analysis of intraperitoneal versus intracerebroventricular administration of bromodeoxyuridine for the study of cell proliferation in the adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 201 (2), 307-314 (2011).
  11. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
  12. Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
  13. Guizzetti, M., Kavanagh, T. J., Costa, L. G. Measurements of astrocyte proliferation. Methods in Molecular Biology. 758, 349-359 (2011).
  14. Gomez-Nicola, D., et al. Regulation of microglial proliferation during chronic neurodegeneration. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2481-2493 (2013).
  15. Bradl, M., Lassmann, H. Oligodendrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 37-53 (2010).
  16. Das, A. T., Tenenbaum, L., Berkhout, B. Tet-On systems for doxycycline-inducible gene expression. Current Gene Therapy. 16 (3), 156-167 (2016).
  17. Lee, C. M., et al. Single-cell RNA-seq analysis revealed long-lasting adverse effects of tamoxifen on neurogenesis in prenatal and adult brains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (32), 19578-19589 (2020).
  18. Smith, B. M., et al. Oral and injected tamoxifen alter adult hippocampal neurogenesis in female and male mice. eNeuro. 9 (2), (2022).
  19. Greenberg, R. A., et al. Expression of mouse telomerase reverse transcriptase during development, differentiation and proliferation. Oncogene. 16 (13), 1723-1730 (1998).
  20. Cong, Y. S., Wright, W. E., Shay, J. W. Human telomerase and its regulation. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (3), 407-425 (2002).
  21. Breault, D. T., et al. Generation of mTert-GFP mice as a model to identify and study tissue progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (30), 10420-10425 (2008).
  22. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 179-184 (2011).
  23. Lin, S., et al. Distributed hepatocytes expressing telomerase repopulate the liver in homeostasis and injury. Nature. 556 (7700), 244-248 (2018).
  24. Lynes, M. D., et al. Telomerase reverse transcriptase expression marks a population of rare adipose tissue stem cells. Stem Cells. 40 (1), 102-111 (2022).
  25. Cousins, F. L., et al. Telomerase reverse transcriptase expression in mouse endometrium during reepithelialization and regeneration in a menses-like model. Stem Cells and Development. 28 (1), 1-12 (2019).
  26. Deane, J. A., et al. The mouse endometrium contains epithelial, endothelial and leucocyte populations expressing the stem cell marker telomerase reverse transcriptase. Molecular Human Reproduction. 22 (4), 272-284 (2016).
  27. Thompson, C. A. H., Wong, J. M. Y. Non-canonical functions of telomerase reverse transcriptase: emerging roles and biological relevance. Current Topics in Medicinal Chemistry. 20 (6), 498-507 (2020).
  28. Lynes, M. D., et al. Telomerase reverse transcriptase expression marks a population of rare adipose tissue stem cells. Stem Cells. , (2021).
  29. Redelsperger, I. M., et al. Stability of doxycycline in feed and water and minimal effective doses in tetracycline-inducible systems. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (4), 467-474 (2016).
  30. Jensen, G. J., et al. Telomerase reverse transcriptase (TERT)-expressing cells mark a novel stem cell population in the adult mouse brain. Peer Review. , (2022).
  31. Muzumdar, M. D., et al. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  32. Bocker, R., et al. Comparison of distribution of doxycycline in mice after oral and intravenous application measured by a high-performance liquid chromatographic method. Arzneimittelforschung. 31 (12), 2116-2117 (1981).
  33. Lucchetti, J., et al. Plasma and brain concentrations of doxycycline after single and repeated doses in wild-type and APP23 mice. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 368 (1), 32-40 (2019).
  34. Sun, Y., Chen, X., Xiao, D. Tetracycline-inducible expression systems: new strategies and practices in the transgenic mouse modeling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 39 (4), 235-246 (2007).
  35. Lee, P., et al. Conditional lineage ablation to model human diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (19), 11371-11376 (1998).
  36. Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as "gold standard" for immunohistochemistry. American Journal of Clinical Pathology. 129 (3), 358-366 (2008).
  37. Delgado, A. C., et al. Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain. Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).
  38. Bratthauer, G. L. Preparation of frozen sections for analysis. Immunocytochemical Methods and Protocols. , 67-73 (2010).
  39. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  40. Cawthorne, C., et al. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. Journal of Biomolecular Techniques. 18 (2), 120-123 (2007).
  41. Hristovska, I., et al. Ketamine/xylazine and barbiturates modulate microglial morphology and motility differently in a mouse model. PLoS One. 15 (8), 0236594 (2020).
  42. Pereira, G. C., et al. Anesthesia can alter the levels of corticosterone and the phosphorylation of signaling molecules. BMC Research Notes. 14 (1), 363 (2021).
  43. Markakis, E. A., Gage, F. H. Adult-generated neurons in the dentate gyrus send axonal projections to field CA3 and are surrounded by synaptic vesicles. Journal of Comparative Neurology. 406 (4), 449-460 (1999).
  44. Magavi, S. S., Leavitt, B. R., Macklis, J. D. Induction of neurogenesis in the neocortex of adult mice. Nature. 405 (6789), 951-955 (2000).
  45. Evans, J., et al. Characterization of mitotic neurons derived from adult rat hypothalamus and brain stem. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 1076-1085 (2002).
  46. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Neurogenesis in the hypothalamus of adult mice: potential role in energy balance. Science. 310 (5748), 679-683 (2005).
  47. Parent, A., Cicchetti, F., Beach, T. G. Calretinin-immunoreactive neurons in the human striatum. Brain Research. 674 (2), 347-351 (1995).
  48. Rich, E. L., Shapiro, M. Rat prefrontal cortical neurons selectively code strategy switches. Journal of Neuroscience. 29 (22), 7208-7219 (2009).
  49. Suzuki, S. O., Goldman, J. E. Multiple cell populations in the early postnatal subventricular zone take distinct migratory pathways: a dynamic study of glial and neuronal progenitor migration. Journal of Neuroscience. 23 (10), 4240-4250 (2003).
  50. Figueres-Onate, M., Sanchez-Gonzalez, R. -., Lopez-Mascaraque, L. -. Deciphering neural heterogeneity through cell lineage tracing. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (5), 1971-1982 (2021).
  51. Hammelrath, L., et al. Morphological maturation of the mouse brain: An in vivo MRI and histology investigation. Neuroimage. 125, 144-152 (2016).
  52. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70 (4), 687-702 (2011).
  53. Sanchez-Gonzalez, R., Bribian, A., Lopez-Mascaraque, L. Cell fate potential of NG2 progenitors. Scientific Reports. 10 (1), 9876 (2020).
  54. Suzuki, T., et al. Cells of NG2 lineage increase in glomeruli of mice following podocyte depletion. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 315 (5), 1449-1464 (2018).
  55. Chou, Y. H., et al. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
  56. Hendrickson, M. L., et al. Expression of nestin by neural cells in the adult rat and human brain. PLoS One. 6 (4), 18535 (2011).
  57. Bifari, F., et al. Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 383 (2015).
  58. Doetsch, F., et al. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97 (6), 703-716 (1999).
  59. Seri, B., et al. Astrocytes give rise to new neurons in the adult mammalian hippocampus. Journal of Neuroscience. 21 (18), 7153-7160 (2001).
  60. DeCarolis, N. A., et al. In vivo contribution of nestin- and GLAST-lineage cells to adult hippocampal neurogenesis. Hippocampus. 23 (8), 708-719 (2013).
  61. Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. Cells in the astroglial lineage are neural stem cells. Cell and Tissue Research. 331 (1), 179-191 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved