Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

İndüklenebilir bir transgenik soy izleme fare çizgisi kullanarak kök hücreleri ve soylarını bir florofor ile kalıcı olarak işaretleme yeteneği, in vivo aktivasyon, proliferasyon, göç ve / veya farklılaşmanın mekansal ve zamansal analizine izin verir. Soy izleme, soy bağlılığı, müdahaleye yanıt ve çok potansiyelli hakkında yeni bilgiler ortaya çıkarabilir.

Özet

Yetişkin doku kök hücrelerinin davranışını ve kaderini araştırmak için bir telomeraz ters transkriptaz (Tert) soy izleme fare çizgisi, 'Tet-On' sistemi oTet-Cre faresini, Tert promotörüne bağlı yeni bir ters tetrasiklin transaktivatörü (rtTA) transgeni ile geçerek geliştirilmiştir. yetişkin beyin kök hücrelerinin yeni bir popülasyonunu işaret ediyor. Burada, tetrasiklin türevi doksisiklinin mTert-rtTA::oTet-Cre farelere uygulanması, Tert geninin promotör bölgesinin 4.4 kb'lik bir parçasını ifade eden bir hücre popülasyonunu silinmez bir şekilde işaretleyecektir. Rosa-mTmG muhabiri birleştirildiğinde, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG fareleri, doksisiklin tedavisi, Tert'i de ifade eden hücrelerde mDomates ekspresyonunun membran EGFP (mGFP) ile değiştirilmesine neden olana kadar membran tdTomato'yu (mTomato) eksprese edecektir. Bu nedenle, bu üçlü-transgenik soy izleme fareleri doksisiklin (TERT eksprese eden hücrelerin işaretlendiği "nabız" dönemi) aldığında, bu hücreler, Tert ekspresyonu daha sonra kaybolsa bile, doksisiklin çıkarılmasından ("kovalamaca" periyodu) sonra istenen herhangi bir süre boyunca izlenebilen, silinmez bir şekilde işaretlenmiş mGFP + hücreleri haline gelecektir. Beyinler daha sonra kök hücre aktivasyonu, proliferasyon, soy bağlılığı, çeşitli beyin nişlerine göç ve olgun hücre tiplerine farklılaşmadaki değişiklikleri yorumlamak için immünofloresan ve diğer aşağı akış uygulamaları için perfüzyonla sabitlenir ve işlenir. Bu sistemi kullanarak, herhangi bir rtTA faresi, kök hücre belirteçlerini kullanarak doksisiklin ile indüklenebilir "nabız kovalamaca" soy izleme deneyleri yapmak için oTet-Cre ve bir Rosa muhabiri ile eşleştirilebilir.

Giriş

Soy izleme fare çizgisinin değeri
Kök hücrelerin in vivo analizi zor olabilir, çünkü bu tür hücreleri inceleyen birçok tahlil, yalnızca hayvanın ölümü sırasında bu hücreleri karakterize etmeye odaklanır ve bu da zaman içinde bir terminal anlık görüntüsünü temsil eder. Progenitör, ara / geçiş hücre tipleri ve olgun hücrelerin zaman içinde proliferasyon, farklılaşma ve göç süreçlerini daha iyi anlamak için uzunlamasına bir analiz yaklaşımı gereklidir. Bu, kök / progenitör hücrelerin silinmez bir şekilde işaretlendiği ve daha sonra herhangi bir süre boyunca takip edilebileceği soy izleme çalışmaları ile sağlanabilir1.

Yetişkin memeli beyninde, yetişkin doğumlu nöronların kök ve progenitör hücrelerden yaratıldığı nörogenez süreci ilk olarak timidin-H 32,3,4 veya 5-bromo-2'-deoksiüridin (BrdU) ile etiket retansiyonu yoluyla analiz edilmiştir5,6,7,8 . Bu çalışmalarda, proliferatif hücreler, replikasyon ve hücre bölünmesi / proliferasyonu sırasında hücrelerin DNA'sına dahil edilen timin analoğu ile işaretlenmiştir. İşaretli hücre ve onların soyları, bu nedenle, daha sonra ölüm sonrası tanımlanan bu analogu içeriyordu. Bununla birlikte, timidin-H3 ve BrdU, kök hücrelerin yeterince anlaşılmadığı beyin bölgelerinde proliferatif hücrelerin ve soylarının işaretlenmesine izin verirken, bu çalışmalar bu araçların dezavantajları tarafından engellenmiştir. Timidin-H3, hücre döngüsü arresti, apoptozu ve doza bağımlı DNA sentezi inhibisyonunu inhibe 9'a indüklerken, BrdU, uygulama yoluna bağlı olarak hücreleri10 olarak değiştirir ve onarım veya apoptoz sırasında ve ayrıca hücre bölünmesi sırasında hücreler tarafından alınır11. Son zamanlarda 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) ile etiketleme gibi daha verimli etiketleme yöntemleri kullanılmıştır, ancak BrdU ile aynı sorunların çoğu hala12 olarak kalmaktadır. Bu yaklaşımlar, sadece kök hücreleri değil, herhangi bir proliferatif hücreyi işaretlemeleri açısından da sınırlayıcıdır ve bu nedenle sonuçların yorumlanması karıştırılabilir. Nörojenik soyda, tüm kök ve progenitör hücreler mitotik kapasiteyi korur ve sadece terminal / olgun nöronlar proliferatif değildir. Astrositler ve mikroglia için, ancak oligodendrositler için değil, proliferasyon süresiz olarak korunur13,14,15.

Burada kullandığımız yetişkin kök hücreleri tanımlamak için onaylanan gibi, yalnızca ilgilenilen bir proteini ifade eden hücreleri izlemek için kullanılan transgenik fareler, bu nedenle kök hücreleri ve soylarını araştırırken daha yaygın hale gelmiştir. Fare transgenik yaklaşımlarıyla üretilmesi zor olsa da, soy izleme fare çizgileri beyinde özel olarak işaretlenmiş hücrelerin izlenmesine izin verir ve yalnızca çoğalmaya dayanmaz. Tet-On transgenik fare sisteminde, tetrasiklin veya doksisiklin (bir tetrasiklin türevi) uygulanması, bir ters tetrasiklin transaktivatörü (rtTA) ile tasarlanmış hücrelerde Cre-rekombinaz ekspresyonunu indükler. Tet ile indüklenebilir Cre-driven rekombinasyon, kullanılan Rosa-reporter faresine bağlı olarak, ilgili hücrelerde silinmez bir floresan veya ışıldayan proteinin ekspresyonunu aktive edecektir. Bu silinmez şekilde işaretlenmiş hücreler, bölünme, farklılaşma veya göçten sonra bu muhabiri ifade etmeye devam ederek, bu hücrelerin ve soylarının zaman içinde veya farklı müdahalelerden sonra izlenmesine izin verir16. Transgenik soy izleme yaklaşımlarının avantajları şunlardır: 1) rtTA ile işaretlenmiş belirli bir hücre soyuna veya progenitör / kök hücreye izlemenin özgüllüğü, 2) hücre döngüsüne veya farklılaşmasına rağmen floresan veya ışıldayan proteinin silinmez ifadesi, 3) düşük toksisite, 4) hayvanın yaşam döngüsünün herhangi bir noktasında koşullu aktivasyon ve 5) ortak tahlillerle kullanım kolaylığı, immünoboyama/immünofloresan dahil16.

Farelerde geçici olarak indüklenebilir muhabir araçlarının diğer yöntemleri, ROSA-GFP, ROSA-mTmG veya diğer floresan muhabir transgenleri ile eşleştirilebilen Cre-ERT2 farelerinin kullanımını içerir. Bu hayvanlarda, bir promotör veya arttırıcı bölge gibi hücreye özgü bir düzenleyici unsur, yalnızca tamoksifen uygulaması yoluyla aktive edilebilen Cre rekombinaz üretimini yönlendirir. Cre-ERT2 fare çizgileri, belirli hücre hatlarında Cre'nin indüksiyonuna izin verirken, tamoksifenin yetişkin nörogenezi17,18 üzerindeki etkilerini detaylandıran zengin bir bilgi birikimi vardır. Ek olarak, YFP veya CFP de dahil olmak üzere GFP veya mTmG yerine kullanılabilecek birçok ROSA-güdümlü floresan muhabir geni vardır, bu da diğer floresan dalga boylarında alternatif floresan etiketlemeye izin verecektir. Bu floresan muhabir genleri Tet-On veya Cre-ERT2 sistemleri ile kullanılabilir.

Telomeraz ters transkriptaz (TERT), holoenzim telomerazın hız sınırlayıcı bileşenidir ve hücre bölünmesi19,20 sırasında kısaltıldıktan sonra telomerleri genişletmek için çalışır. TERT, bağırsak 21,22, kemik iliği 21, karaciğer 23, yağ 24, endometriyum25,26 ve kemik 1'deki yetişkin doku kök hücrelerinin bir belirteci olarak tanımlanmıştır. Bu yetişkin kök hücrelerdeki TERT ekspresyonunun sadece telomeraz uzatıcı aktivite için mi yoksa kanonik olmayan TERT rollerini yerine getirmek için mi olduğu hala bilinmemektedir27. TERT eksprese eden sessiz yetişkin kök hücreler (qASC'ler), bu kök hücrelerin çok etkili ve kendini yenileme yeteneğinin yanı sıra aktive etme, çoğalma, farklılaşma ve göç etme potansiyellerini incelemek için transgenik soy izleme fareleri ile vücutta tanımlanmış ve izlenmiştir 1,22,23,28. Tert-rtTA transgeninin oluşturulması daha öncegerçekleştirilmiştir 1. Bu yazıda, yetişkin fare beyninde yeni bir ASC popülasyonu olarak tanımladığımız TERT + qASC'leri incelemek için bir soy izleme TERT fare çizgisinin kullanımını açıklayacağız.

Transgenik bir soy izleme fare çizgisinin oluşturulması
Tet-On sistemini kullanarak soy izleme fare çizgisi oluşturmak için, fare çiftleşmesi yoluyla tek bir hayvanda üç transgen birleştirilmelidir. Birincisi, ilgilenilen genin promotörünün kontrolü altında ifade edilen bir rtTA'dır (bizimki TERT-rtTA'dır). Bu ilgi genini ifade eden bir hücrede, rtTA bu nedenle ifade edilecektir. İkincisi, hem rtTA füzyon transkriptinin hem de tetrasiklin veya doksisiklin varlığında Cre rekombinazının transkripsiyonuna izin verecek bir tetrasiklin yanıt elemanı (TRE) içeren bir oTet-Cre genidir. Tetrasiklin veya doksisiklin bir hayvana içme suyu veya chow29 yoluyla uygulanabilir. Son olarak, Cre rekombinaz bölünmesi ile aktive edilecek bir gen olmalıdır. Bu yazıda, tanımlayacağımız etiketleme geni, Cre rekombinasyonuna kadar her yerde mTomato'yu (tüm hücrelerde membran kırmızısı floresan) transkripte edecek olan Rosa26-mTmG genidir. Bununla birlikte, eğer bir hücre rtTA transkriptini ifade ederse ve tetrasiklin veya doksisiklin içeriyorsa, mDomates ve mGFP bölgeleri arasındaki bir dizi lox P bölgesinin Cre rekombinasyonu, R26 bölgesini değiştirecek ve hücrenin membran domates yerine membran EGFP (mGFP veya membran yeşil floresan) üretmesine neden olacaktır. Bu mGFP sinyalinin silinmez doğası, çoğalırken, göç ederken ve farklılaşırken hücrelerin in vivo etiketlenmesine ve izlenmesine izin verecektir. İzi takiben, hücreler standart kriyoseksiyonlarda veya daha kalın optik olarak temizlenmiş beyinlerde immünofloresan yoluyla GFP'nin ekspresyonu için analiz edilebilir.

Bu yazıda, belirli fare çizgisi olan mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG'nin kullanımını açıklayacağız. Bu üçlü transgenik fare hattını oluşturmak için, oTet-Cre hayvanlarını (Jackson Lab suşu #006234) Rosa-mTmG hayvanlarıyla (Jackson Lab suşu #007676) çiftleştirdik ve oTet-Cre::Rosa-mTmG çift transgenik fareler oluşturduk. Bu hayvanlar, Ek Tablo 1 ve 2'de belirtilen primerler ve PCR şablonları ile genotiplendirildi. mTert-rtTA fareleri (David Breault 1 tarafından yaratılmıştır) mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG fareleri oluşturmak için oTet-Cre::Rosa-mTmG hayvanlarıyla çiftleştirilmiştir (Şekil 1A)1,30. mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG fare çizgisinin etki mekanizması Şekil 1B'de gösterilmiştir.

Doksisiklin indüksiyonu ve nabız kovalama tasarımı
Deneyleri planlarken, hayvanın doksisiklin indüksiyonundaki yaşı, doksisiklin uygulamasının uzunluğu ("nabız" dönemi), doku toplanmasından önce doksisiklin çıkarılmasından sonraki sürenin uzunluğu ("kovalamaca" dönemi) ve bu işlemler sırasında herhangi bir müdahalenin zamanlaması dahil olmak üzere soy izleme deneylerinin sonucunu etkileyecek çeşitli faktörleri göz önünde bulundurmak önemlidir. Bu çalışma tasarımı hususları, etiketli hücreleri ve bunların soylarını deneyin sonunda anlamak için gereklidir. Süreçteki ilk adım, hayvanın ilgi yaşını ve doksisiklin uygulamasının uzunluğunu tanımlamaktır. Daha uzun nabız süreleri, daha fazla hücrenin rtTA'ya bağlı promotörün eksprese edilmesini ve daha fazla ilgi çekici hücrenin silinmez bir şekilde işaretlenmesini sağlayacaktır. İlgilenilen genin geçici ekspresyonunu sergileyen bir hücre tipi, ilgilenilen geni sürekli olarak ifade eden hücrelerden daha uzun bir nabız süresi gerektirebilir. Bununla birlikte, çalışmanın amacı, ilgilenilen hücrenin veya akut bir müdahalenin kısa vadeli etkilerini anlamaksa, nabız periyodu çok uzun olamaz, çünkü bir hücre işaretlendiğinde, nabız periyodunun geri kalanında herhangi bir sayıda değişiklikle izlenecektir. Bazı çalışmalarımızda, TERT için doğrudan muhabiri daha yakından taklit etmek için kovalamaca süresi olmayan 2 günlük bir nabız kullanılmıştır. Bunun nedeni, Rosa-mTmG geninin rekombinasyonu için minimum sürenin 2 gün31 olmasıdır.

Bir nabız kovalama deneyindeki bir sonraki temel dönem, doksisiklin ile hayvanın perfüzyonu arasındaki uzunluktur, aynı zamanda 'kovalamaca' olarak da bilinir. Farelerde doksisiklin yarı ömrü, uygulama yolundan bağımsız olarak yaklaşık 170 dakikadır ve doksisiklin indüksiyonunun çıkarıldıktan birkaç saat sonra32 artık gerçekleşmediği sonucuna varılmasına izin verir. Bununla birlikte, doksisiklin metabolizmasının yaşlı farelerde daha yavaş olduğunu ve bunun da genç hayvanlardan daha uzun etkili 'nabız' dönemlerine yol açabileceğini belirtmek önemlidir33.

Kovalama döneminde, etiketlenmiş hücreler çoğalma, farklılaşma veya göçten sonra bile etiketlenmeye devam edecektir. Bu hücrelerin soyu da etiketlenecektir. Çalışmanın amacı, nabız kovalama paradigmasının uzunluğunu şekillendirecektir. Çalışmanın amacı, bir dokunun ilgilenilen hücrelerle uzun bir süre boyunca yenilenmesini anlamaksa, uzun bir kovalamaca süresi gerekebilir. Son olarak, herhangi bir müdahalenin veya tedavinin zamanlamasına karar verilmelidir. Nabız periyodu sırasında uygulama, bu süre zarfında yaratılan herhangi bir soyu olduğu kadar ilgi genini ifade eden hücreleri de etkileyecektir, oysa kovalamaca döneminde uygulama, çoğunlukla ilgili hücrelerin soyunu etkileyebilir, ancak bu, etiketlenmiş hücrelerin ne kadar hızlı bölündüğüne veya farklılaştığına bağlı olacaktır. Kullandığımız nabız kovalama deneysel tasarımlarının örnekleri Şekil 2A'da özetlenmiştir.

Sızdıran ifade nedeniyle arka plan GFP sinyalinin olasılığının farkında olmak da önemlidir. Sızdıran ekspresyon, doksisiklin yokluğunda rtTA ve Otet dizileri arasındaki doğal bağlanma potansiyelinin ve rtTA'nın yokluğunda Otet transgeninin artık aktivitesinin bir sonucu olarak ortaya çıkar (34'te gözden geçirilmiştir). Sızdıran ifade, Tet sistemlerinin bir zayıflığını temsil eder ve sızıntı genellikle sistem için kabul edilebilir bir dezavantaj olmasına rağmen, sızdıran ifadenin Otet-DTA hayvanlarında dipteri toksini (DTA) gibi toksisiteye ve mortaliteye yol açabileceği durumlar bu sistemlerin kullanımını sınırlayabilir35.

Mikroskopi için ince kesitlerin beyin işlemesi, bölümlenmesi ve immünofloresansı
Bir soy izleme deneyinden sonra farelerin beyinlerini analiz etmek için, fareler önce beyinde yüksek otofloresansa yol açabilecek kan ve CSF'yi çıkarmak için transkardiyal perfüzyon yoluyla perfüze edilmelidir. Hayvanın perfüze edilebileceği yaygın olarak kullanılan iki fiksatif vardır: Histochoice Doku Fiksatifi, glioksal fiksatif (GF) veya% 4 paraformaldehit (PFA). Glioksal fiksatörler, PFA'dan daha az çapraz bağlama ile nispeten yumuşak bir fiksasyon işlemine izin verir. Bu, doku sertliğini azaltır, antijen alma ihtiyacını azaltır ve immün boyama sırasında daha az konsantre antikor çözeltilerine izin verir. Bununla birlikte, metanol içeriyorsa, bu otofloresan36'yı arttırmaya hizmet edebilir. Öte yandan, PFA genellikle daha sağlam bir fiksasyona izin verecektir ve immün boyama sırasında antijen geri kazanımı gerekli olsa da, sadece PFA ile sabitlenmiş dokularla çalışacak antikorlar vardır ve% 4 PFA ile perfüzyon daha sonra açıklanan optik temizleme tekniği için gereklidir.

Perfüzyonu takiben, beyinlerin bir gecede perfüzyon sırasında kullanılan aynı fiksatif tipine daldırıldığı bir fiksasyon sonrası adımdır. Bu, perfüzyon sırasında tamamen sabitlenmemiş olabilecek beyin bölgelerinin düzeltilmeye devam etmesini sağlar. Daha sonra, beyinler, doku içinde buz oluşumunu önlemek için donma adımından önce mümkün olduğunca fazla su çıkarmak için fosfat tamponlu salin (PBS) içinde sakkarozda inkübe edilecektir ("kriyo-koruma"). Beyinler daha sonra işlenmek üzere herhangi bir sayıda sagital, koronal veya enine doku bölümüne kesilebilir. Hem hassasiyet hem de tekrarlanabilirlik için, kalibre edilmiş beyin bloklarının hayvanlar arasında tutarlı bregma kesimleri sağlayacak şekilde kullanılması gerekir. Beyinlerin nasıl bölümlendiğini etkileyebilecek en önemli faktör, ilgilenilen beyin bölgeleridir. Örneğin, bir sagital kesim bir doku bölümünde daha fazla beyin bölgesinin analiz edilmesine izin verebilirken, bu kesim ventriküler-subventriküler bölgenin (V-SVZ) nöro / gliojenik bölgelerinin analizine izin vermeyecektir, çünkü lateral ventrikülün lateral ve medial taraflarının bu boyutta ayırt edilmesi imkansız olacaktır ve koronal düzlemde daha iyi gözlenir. Bu, yetişkin nörogenez çalışmalarında yapılması gereken önemli bir ayrım olabilir, çünkü lateral ventrikülün lateral tarafı nörojenik V-SVZ'yi içerirken, lateral ventrikülün medial duvarı daha gliojenik bir niş37'dir.

Dokular koronal, sagital veya enine bölümlere ayrıldıktan sonra, Optimum Soğutma Sıcaklığı (OCT) gömme çözeltisi kullanılarak bloklar halinde dondurulacaktır. Burada, beyinler kuru buz ve etanol karışımı kullanılarak bu gömme malzemesi içinde dondurulur. İnce kesit analizi gerekiyorsa, bloklar bir kriyostat üzerinde dilimlenir ve gerekli aşağı akış analizine bağlı olarak pozitif yüklü cam slaytlara ince kesitler (<20 μm) olarak yapıştırılabilir. Şarj edilmemiş cam slaytlar da kullanılabilir, ancak yüksüz slaytların kullanılması, dokuların slaytlardan yapışmasına neden olabilir38. Orta kalınlıkta serbest yüzen doku kesitleri (>20 μm) gerekiyorsa, dokular serbest yüzen kesitler halinde toplanacaktır. Kalın kesitler (0.5-4 mm) gerekiyorsa, dondurulmamış beyin bölümlerinin bir vibratom ile dilimlenmesi gerekir. Slaytlardaki -20 ila -80 °C'de donma gerektiren bölümler ile 4 °C'de saklanacak serbest yüzen bölümler arasındaki depolama farklılıklarına dikkat etmek önemlidir.

Beyin temizleme ve tüm montaj immünofloresan konfokal mikroskopi
Fare beynindeki soy izlenen hücrelerin daha geniş, ancak daha az ayrıntılı bir analizi istenirse, iDISCO beyin temizleme39 ve ardından immün boyama ve fayanslı z-yığını konfokal mikroskopi veya ışık tabakası mikroskobu ile beyin dokusunun daha kalın segmentlerinin kapsamlı bir analizi mümkündür. Burada, fare beyninin büyük bölümleri optik olarak temizlenecek (bir delipidasyon süreci39), bu da 1 mm'lik bir doku bölümünde floresan sinyal görüntülemeye daha iyi izin verecektir. Bu işlemin dezavantajları, yüksek otofloresan ve daha geleneksel yöntemlerle (ince kriyozasyonlar veya serbest yüzen kesitler) karşılaştırıldığında gereken artan çalışma mesafeleri nedeniyle hücre morfolojisinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etme yeteneğinin azalması ve ayrıntılı birlikte boyama analizidir. Bu nedenle, tek tek hücreleri karakterize etmeye veya analiz etmeye çalışmak yerine, birden fazla beyin bölgesinde büyük ölçekli soy izleme sonuçlarını analiz etmek için beyin temizlemeyi öneriyoruz.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler, Ohio State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Deneysel kohort fareler için Tet-On fare çizgisini izleyen bir soy izleme, üreme stratejileri ve genotipleme oluşturulması

NOT: Burada, Cre rekombinasyonuna tabi tutulan floresan muhabir geni olarak Rosa-mTmG ile bir Tet-On fare sisteminin oluşturulmasını özetliyoruz, ancak Tet-On sistemi ile birlikte çeşitli diğer Cre-rekombinasyon tahrikli muhabir hatları da kullanılabilir.

  1. Bir veya daha fazla R26 (mTmG) (+/+) dişi ile bir oTet-Cre (+/-) erkeğin çiftleşme kafesini kurun. Deneysel fare çiftleşme kurulumuna genel bir bakış için Şekil 1'e bakın.
  2. Elde edilen yavrular (F1) oTet-Cre (+/-) veya oTet-Cre (-/-) ve R26 (mTmG) (+/-) olacaktır. Ek Tablo 1'deki primerlere ve Ek Tablo 2'deki protokollere göre genotipleme yapın.
  3. Sütten kesmede, her sütten kesmeden bir kulak yumruğu alarak germline testi yapın. GFP / FITC spektrumunda bir epifloresan mikroskop altında kulak punch'ı inceleyin, hayvanın gelişimde germline rekombinasyonuna maruz kalıp kalmadığını belirlemek için. Eğer öyleyse, hayvan her hücrede GFP'yi ifade edecek ve kulak yumruğu mGFP sinyali ile floresan yapacaktır. Bu hayvanlar çiftleşme veya deneyler için kullanılamaz.
    NOT: Germline olmayan farelerden alınan kulak klipsleri mikroskop altında sadece endojen floresan gösterirken (Şekil 1C), germline hayvanlar parlak bir GFP sinyali gösterir (Şekil 1D). Kontrol kulakları, floresan transgenleri içermeyen farelerden olabilir. Bir not olarak, kulak kılları yüksek endojen floresana sahiptir ve belirleyici bir faktör olarak kullanılmamalıdır (Şekil 1C). Ek olarak, beyaz ve siyah ceket rengindeki fareler arasında endojen floresandaki farklılıklar gözlenir ve test edilen farelerle aynı kaplama rengine sahip farelerin kontrollerinin bu analizde kullanılması gerekecektir.
  4. Bir erkek oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/-) ile bir veya daha fazla dişi oTet-Cre (-/-) x R26 (mTmG) fareyi eşleştirin.
  5. Elde edilen nesil (F2) 1/4 R26 (mTmG) (+/+) ve 1/2 Cre (+/-) olacaktır. Bir oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) ile bir veya daha fazla mTert-rtTA (+/+) hayvanını çiftleştirerek bu hayvanları mTert-rtTA (+/+) hayvanlarla geçin.
    NOT: mTert-rtTA (+/+) hayvanları kullandık, ancak bu işlem herhangi bir rtTA fare satırı30 ile gerçekleştirilebilir.
  6. Deney hayvanları için, mTert-rtTA (+/+) veya (+/-) x oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) veya (+/-) üretmek üzere ıslahlar ayarlayın.

2. Cre ve nabız kovalama tasarımının Doksisiklin indüksiyonu

  1. Hayvanlar çalışmanın başlaması için doğru yaşta olduklarında, içme sularını dox suyuyla değiştirin:% 5 sakkaroz ve 2 mg / mL doksisiklin hiklatı içeren içme suyu. Elde edilen floresan ekspresyon kalıpları için deney hayvanlarıyla aynı doksisiklin nabız kovalamasını alan Cre-negatif hayvanları bir kontrol grubu olarak kullanın.
    1. Hazırlandıktan sonra, doks suyunu 4 ° C'de 1 aya kadar saklayın. Daha fazla bilgi için Tablo 1'e bakın. Dox suyu, içme şişelerindeki hayvanlara değiştirilmeden önce 5 güne kadar uygulanabilir, çünkü dox suyu oda sıcaklığında daha uzun süre dışarıda bırakılırsa mantar büyümesi meydana gelebilir.
      NOT: mTmG transgeni (ilk mTmG kağıdı) kullanılırken mGFP sinyalinin indüklenmesi için en az 2 günlük bir doksisiklin darbesi gereklidir.
      NOT: 2 mg/mL dışındaki doksisiklin konsantrasyonlarını test etmedik. Önceki literatür, bu konsantrasyonun içme suyu yoluyla uygulandığında en yüksek etkilere sahip olduğunu belirlemiştir29. Verilen doksisiklin miktarı, her hayvan tarafından yapılan içme miktarına bağlı olarak değişebilir. Hayvanlar arasında tutarlı olması için doksisiklin enjeksiyonu veya gavage da yapılabilir40.
  2. Nabız süresi sona erdikten sonra, kafeslerden doks suyunu çıkarın ve normal içme suyuyla değiştirin. Hayvanlar artık ölene kadar 'kovalamaca' döneminde olacaklar.

3. Transkardiyal perfüzyon ve beyin diseksiyonu

  1. Bir fareyi kafesinden çıkarın ve sol baş parmağını ve işaret parmağını kullanarak hayvanı kısıtlayın. Hayvana intraperitoneal (i.p.) enjeksiyon yoluyla, 200 mg / kg ketamin ve 20 mg / kg ksilazin nihai konsantrasyonu için% 0.9 steril salin içinde 100 mg / mL ketamin ve 20 mg / mL ksilazin çözeltisi enjekte edin. Daha fazla bilgi için Tablo 1'e bakın.
    DİKKAT: Anestezi protokolleri ülkeye göre farklılık gösterebilir. Ek olarak, anesteziklerin beyin üzerinde mikroglial morfoloji ve etkideki değişiklikler ve kortikosteron seviyeleri de dahil olmak üzere beyin üzerinde etkileri vardır ve beyin toplama ve analizi amacıyla perfüzyon yaparken anlaşılması gerekir41,42.
  2. Yaklaşık 1-2 dakika sonra hayvan haklı refleksini kaybedecektir. Bunu test etmek için, hayvanı sırt üstü yuvarlayın ve eğer ayaklarının üzerine geri dönemezse, doğru refleksini kaybetmiştir.
  3. Yaklaşık 5-10 dakika sonra hayvan pedal refleksini kaybedecektir. Pedal refleksini kontrol etmek için, hayvanın ayaklarının her birini sıkıştırmak için baş parmağınızı ve işaret parmağınızı kullanın. Yanıt yoksa, atlama veya kas spazmı şeklinde, hayvanın ayaklarının her birini sıkıştırmak için baş parmağın tırnaklarını ve işaret parmağını kullanın. Yanıt yoksa, hayvan pedal refleksini kaybetmiştir.
    NOT: Hayvan, enjeksiyondan sonra 15 dakikadan daha uzun bir süre pedal refleksine yanıt verirse, ilk ketamin / ksilazin enjeksiyonunun 1 / 2'sinin ek bir enjeksiyonu gerekebilir. Yaş, cinsiyet, genotip, fenotip ve tedavi, hayvanın bu ilaç kokteyline verdiği cevabı etkileyebilir.
  4. Sağ ve pedal refleksleri kaybolduktan sonra, fare göz küresine eldivenli bir parmakla hafifçe temas ettirerek oküler refleksi test edin. Yanıt eksikliği, oküler refleksin kaybolduğunu gösterir.
  5. Fareyi, pençeleri sabitlenebilir bir çalışma yüzeyine sabitlenmiş olarak sırtüstü pozisyonda sabitleyin.
  6. Ksifoid sürecin yaklaşık 1-2 cm altında torasik orta hat boyunca cerrahi makasla deriden bir kesi yapın. Ksifoid işlemine kadar üstün kesin.
  7. Ksifoid sürecin kıkırdağını forseps ile kavrayın. Makas yerleştirin ve kas sistemini ve göğüs kafesini farenin sağ tarafı boyunca çapraz olarak klavikulaların seviyesine kadar kesin.
    1. Torasik kas sistemini forseps ile yükseltin ve kalp görselleştirilene kadar diyaframdan dilimleyin. Ardından, farenin sol tarafı boyunca aynı çapraz kesimi yapın ve kalple herhangi bir teması önlediğinizden emin olun. Torasik kas sistemini boşluktan uzak tutmak için bir hemostat kullanın.
      NOT: Bu noktada, fare artık nefes alamayacak, bu nedenle sonraki adımlardan önce ölümü önlemek için hızlı bir şekilde çalışın.
  8. Atan kalbi künt forseps ile sabitleyin ve aort kemerinin tabanından sol ventriküle bir dağıtım iğnesi yerleştirin.
  9. İğne tabanını yerleştirme yerinin hemen üstündeki sol ventriküle kelepçeleyin.
  10. Sağ atriyumda bir kesi yapın ve kan akışının ilk belirtisinde, hayvanı 8.11 mL / dakika'da 20 mL 1x PBS ile perfüze etmeye başlayın.
  11. 1x PBS gövdeyi deldikten sonra, aşağı akış uygulaması için uygun fiksatöre geçin ve fareyi 20 mL fiksatif ile perfüze edin.
    1. Dondurulmuş kesit ve immün boyama için, beyin temizliği için glioksal fiksatif ile perfüze hayvanı, 1x PBS'de% 4 PFA (pH 7.4) ile perfüze hayvanı.
      NOT: Başarılı bir perfüzyonun belirtileri arasında hayvan sertliği (glioksal ile hafif sertlik, PFA ile yoğun sertlik) ve dokular boyunca görünür kan damarlarının eksikliği bulunur.
  12. Farenin kafasını kesin ve beyin sapına makas yerleştirerek ve skuamozal sütür boyunca her iki taraftaki frontomaksiller sütüre kadar keserek beyni çıkarın. Daha sonra kafatası kapağını çıkarmak için fontonazal sütür boyunca kesin, koku alma ampulüne zarar vermemeye dikkat edin. Oradan, kafatasını baş aşağı çevirin ve beyni çıkarmak için kavisli forseps kullanın, optik siniri kestiğinizden emin olun.
  13. Perfüze edilmiş beyni bir doku kartuşuna yerleştirin ve hayvanı gece boyunca 4 ° C'de perfüze etmek için kullanılan fiksatif içine daldırın.

4. Beyin tedavisi, dilimleme ve immün boyama

  1. Beyin tedavisi ve dilimleme
    1. Beyin kartuşlarını glioksal fiksatiften çıkarın ve 4 ° C'de 2 gün boyunca veya beyinler batana kadar 1x PBS'de% 15 sakkarozda inkübe edin.
    2. Beyin kartuşlarını% 15 sakarozdan çıkarın ve 4 ° C'de 2 gün boyunca veya beyinler batana kadar 1x PBS'de% 30 sakkarozda inkübe edin.
      NOT: Daha fazla bilgi için Tablo 1'e bakın.
    3. Beyinleri 1x PBS'de% 30 sakarozdan çıkarın ve bir koronal beyin bloğu veya sagital beyin bloğu kullanarak beyni çeşitli 'bloklara' ayırın.
    4. Beyin bölümlerini kuru buz ve etanol (EtOH) karışımı üzerine yerleştirerek koronal veya sagital beyin bölümlerini OCT bileşiğine yerleştirin. OCT beyaza döndükten ve katılaştıktan sonra, kuru buz-EtOH karışımından çıkarın ve parafilme sarılı, -20 ° C'de hava geçirmez bir torbanın içinde saklayın.
    5. Dondurulmuş blokları dondurucudan çıkarın ve iç sıcaklığı -20 ° C'ye ayarlanmış bir kriyostatın içine yerleştirin. Doku sağlam bir şekilde tutturulması için bloğu metal bir aynaya bağlamak için OCT kullanın. Dokunun mandrene donması için ~ 5 dakika bekleyin. Dokuyu 7 μm'de dilimleyin ve her doku dilimini yüklü bir cam slayta yerleştirin.
    6. Slaytların gece boyunca 37 ° C'de pişmesine izin verin ve daha sonra immün boyama için kullanılana kadar -20 ° C'ye yerleştirin.
  2. İmmün boyama
    1. Oda sıcaklığına (RT) sıcak kayar ve 15 dakika boyunca buz gibi soğuk asetonla sabitleme yapar.
    2. Kızakları 1x durulama tamponunda (örneğin, IHC Select TBS Durulama Tamponu) 5 dakika boyunca yıkayın, her adım arasında RT'de 60 rpm'de çalkalayın.
    3. RT'de 10 dakika boyunca% 0.3 Triton X-100 ile nükleer antijenlerin boyanması için geçirgenleştirin RT'de 10 dakika boyunca% 0.3 Tween-20 ile sitoplazmik antijenlerin boyanması için geçirgenleştirin.
    4. 50-100 mL'lik 1x DAKO Antijen Retrieval Solution'da slaytları 10 dakika boyunca iki kez kısık sesle dalga sallayarak antijen alımı gerçekleştirin. Daha sonra RT'de 5 dakika durulama tamponu ile durulayın.
    5. RT'de 20 dakika boyunca kızakları %70 EtOH'da %0,3 Typogen Black'te inkübe edin ve ardından durulama tamponu ile yıkayın.
    6. Dokuların kurumasına izin vermeden her dokunun etrafına hidrofobik bir bariyer çizin. Daha sonra doku başına 1 damla Millipore Bloke Reaktif ile 37 ° C'de 20 dakika boyunca bloke edin. Daha sonra her dokuya antikor seyreltici olarak seyreltilmiş 100 μL birincil antikor ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    7. Ertesi gün, Alexa Fluor sekonder antikorlarındaki bölümleri RT'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra slaytları durulama tamponunda yıkayın.
    8. İzlenen hücreleri işaretleyen endojen GFP sinyalini artırmak ve 4 ° C'de gece boyunca inkübe etmek için AlexaFluor 488'e konjuge edilmiş 1:500 anti-GFP antikorunun 100 μL'sinde beyin bölümlerini örtün.
    9. Ertesi gün, 2x durulama tamponu ile yıkayın ve ardından 5 dakika boyunca akan DI suyunda yıkayın.
      NOT: DI suyuyla nazikçe yıkadığınızdan emin olun, slaytların kendilerinde beyin bölümlerini slaytlardan çıkarabilecek akan sulardan kaçınmaya özen gösterin.
    10. 5 dakika boyunca 100 ng/mL 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile karşı leke yapın. Daha sonra 5 dakika boyunca akan DI suyunda yıkayın.
    11. Her doku kesitinin üzerine bir damla montaj ortamı ekleyin ve 22 mm x 22 mm'lik bir kapak kayması ile kapatın. Optimum sinyal sağlamak için montaj gününde görüntüleme önerilir.

5. iDISCO beyin temizleme (39'dan uyarlanmıştır)

  1. Sabitleme ve bölümleme
    1. Sabitleme sonrası beyinler% 4 PFA'da gece boyunca 4 ° C'de ve daha sonra RT'de 1 saat boyunca tekrar sabitlenir.
    2. RT'de beyinleri 1x PBS'de bir saat, iki kez yıkayın. Daha sonra gerekli beyin bloğunu kullanarak 1 mm kalınlığında bölümler halinde kesin ve 1x PBS içeren 5 mL mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin.
  2. Metanol ön işlemi (metanol ile)
    NOT: Metanolün bazı proteinlerin immün boyamasını etkileme olasılığı nedeniyle, yazarlar okuyucuyu metanol içermeyen bir iDISCO protokolü alternatifi39'a bir protokol için Renier ve ark. 2014'e yönlendirmek istemektedir. Bu bölümdeki aşağıdaki çözümlerle ilgili daha fazla bilgi için Tablo 1'e bakın.
    1. RT'de 1x PBS ile 1 saat boyunca iki kez yıkayın (sallama).
    2. RT'de %50 metanol (PBS'de) içinde 1 saat (çalkalama) yıkayın.
    3. RT'de 1 saat (sallama) için% 80 metanol içinde yıkayın.
    4. RT'de iki kez 1 saat boyunca% 100 metanol içinde yıkayın (sallama).
    5. %20dimetil sülfoksit (DMSO)/metanol (1 hacim %30 H 2 O2/1 hacim DMSO/4 hacimli metanol, buz gibi soğuk) içinde %5 hidrojen peroksit (H2 O2) içeren ağartıcı numuneleri gece boyunca 4 °C'de (çalkalanma).
    6. Ağartmadan sonra, numuneleri RT'de iki kez 1 saat boyunca metanol içinde yıkayın (çalkalayarak).
    7. RT'de %20 DMSO/metanol ile 1 saat boyunca iki kez yıkayın (sallama).
    8. RT'de 1 saat (sallama) için% 80 metanol içinde yıkayın.
    9. RT'de 1 saat (çalkalama) için% 50 metanol içinde yıkayın.
    10. PBS'de RT'de iki kez 1 saat boyunca yıkayın (sallayarak).
    11. RT'de PBS/%0,2 Triton X-100'de 1 saat boyunca iki kez yıkayın (sallama).
  3. Berrak beyinlerin immün boyaması
    1. Orbital çalkalayıcıda gece boyunca 37 °C'de numuneleri 1x PBS / % 0.2 Triton X-100 / % 20 DMSO / 0.3 M glisin içinde inkübe edin.
    2. 1x PBS/%0.2 Triton X-100/%10 DMSO/%6 keçi serumunu 37 °C'de yörüngesel çalkalayıcıda 3 gün boyunca bloke edin.
    3. Numuneleri domuz mukozasından 1x PBS/%0,2 Tween-20/10 μg/mL heparin sodyum tuzunda 37 °C'de iki kez 1 saat yıkayın ve daha sonra 2 gün boyunca yörüngesel çalkalayıcıda 37 °C'de 1:500 konsantrasyonda tavşan anti-GFP AlexaFluor 488 içeren 1x PBS/%0,2 Tween-20/10 μg/mL heparin/%5 DMSO/%3 keçi serumu içinde inkübe edin.
    4. Numuneleri 1x PBS/%0,2 Tween-20'de 10 μg/mL heparin ile 37 °C'de 1 saat boyunca orbital çalkalayıcıda üç kez ve daha sonra 2 gün boyunca günde bir kez yıkayın.
    5. Numuneleri 15 mL'lik konik bir tüp içinde %50 v/v Tetrahidrofuran (THF)/H2O'nun 10 mL'sinde gece boyunca inkübe edin.
    6. Numuneleri 10 mL'de 1 saat boyunca %80 THF/H 2 O oranındainkübeedin.
    7. Numuneleri% 100 THF'de 1 saat boyunca iki kez inkübe edin.
    8. Numuneleri steril bir mendille kurutun ve şişenin dibine batana kadar (yaklaşık 40 dakika) diklorometan içinde inkübe edin. >60 dakika kuluçkaya yatırmayın.
      NOT: Diklorometanı bir duman başlığı altında tuttuğunuzdan emin olun.
    9. Numuneleri 18 mL dibenzil eter (DBE) içinde berrak olana kadar (>2 saat) inkübe edin.
    10. Görüntülemeye hazır olana kadar örnekleri RT'de DBE'de saklayın.
      NOT: En iyi sonuçlar için, temizleme işlemi tamamlandıktan sonra numuneleri mümkün olan en kısa sürede görüntülemek önemlidir.

6. Lekeli slaytların veya temizlenmiş beyinlerin görüntülenmesi

  1. İmmünoboyalı beyin bölümlerini görüntülemek için, çoklu antikorların birlikte ekspresyonunun doğrulanabileceği konfokal mikroskopi yoluyla slaytları analiz edin. HyD S hibrid dedektörlü bir Leica Stellaris 5 mikroskobu kullanıyoruz, ancak herhangi bir nokta taramalı konfokal mikroskop çalışacaktır. Hedefler arasında HC PL APO 10x/0.40 CS2, HC PL APO 40x/1.30 OIL CS2 ve HC PL APO 63x/1.40 yer alıyor.
    1. Doğru lazer çizgilerini ve emisyon filtrelerini yapılandırın. Gerekli lazerler ve buna karşılık gelen lazer yoğunlukları, kullanılan mikroskop ve florofor kombinasyonlarına tabidir.
      NOT: Her florofor veya çapraz konuşmayı azaltmak ve ortadan kaldırmak için kullanılan florofor grupları için uyarma ve emisyon spektrumlarına ince ayar yapmak için diyot 405 nm ve beyaz ışık lazerlerinin bir kombinasyonunu kullanıyoruz. Benzer sonuçlar geleneksel lazer/filtre kombinasyonları kullanılarak da elde edilebilir, ancak kanal kanamasına çok dikkat edin. Kanama, her bir lazerden hangi kanalların etkilendiğini görmek için istenen emisyon filtresi kombinasyonlarının her biriyle birlikte tek bir lazer çizgisini açarak tanımlanabilir. Örneğin, 405 nm lazer diyotu GFP emisyon filtresinde görünür floresan üretiyorsa, kanama meydana gelir. Birden fazla kanalın kare kare görüntülendiğinden emin olun, böylece taşma meydana gelmesini büyük ölçüde azaltın.
    2. Bir mTmG muhabiri ile birlikte boyanmış Tet-On beyinleri için, ikincil antikor üzerinde kullanılan floroforla eşleşmesi için DAPI (ör. 405 nm, em. 450 nm), GFP (ör. 488 nm, em. 509 nm), tdDomates (ör. 555 nm, em. 582 nm) ve karşılık gelen uzak kırmızı floroforu seçin. Alexa Fluor 647'yi öneririz (ör. 651 nm, em. 667 nm).
    3. İlk önce hem GFP hem de floresan ikincil ile boyanmış bir Cre-control beyni ile ayarlar oluşturun. Bu beyin dilimleri, floresan antikorlarından gelen arka plan floresansını kontrol edecek ve gerçek GFP sinyali göstermeyecektir.
    4. Analizde hiçbir sinyalin kaçırılmadığını doğrulamak için her beyin bölümünü yukarıdan aşağıya, soldan sağa analiz edin. Aynı beyin bölümünü çeşitli büyütmelerde görüntülüyorsanız, daha yüksek büyütme mDomates sinyalini daha hızlı ağartacağından, önce daha düşük büyütmelerin kullanılması önerilir.
  2. Temizlenmiş beyinleri görüntülemek için, otomatik bir aşama ve otomatik döşeme işlevine sahip ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop kullanın. Leica Stellaris 5 mikroskobu kullanıyoruz. Numuneler çok kalın olduğundan (>500 μm), etkili bir şekilde elde edilebilecek büyütmeyi sınırlayan daha büyük çalışma mesafeleri gereklidir. Tüm temizlenmiş beyin görüntülemeleri için HC PL APO 10x/0.40 CS2 hedefini kullanıyoruz.
    1. Temizlenmiş bir beyin bölümünü cam tabanlı bir kaba düz bir şekilde yerleştirerek başlayın ve dibenzil etere batırın.
      NOT: Dibenzil eter, çoğu objektif lens ve çoğu plastik için aşındırıcıdır. Bu nedenle, cam alt tabaktaki herhangi bir iç plastiğin hızlı kuruyan silikon elastomer ile kaplanması gerekir.
    2. Doğru lazer çizgilerini ve emisyon filtrelerini yapılandırın. Bir mTmG muhabiri ile birlikte boyanmış Tet-On beyinleri için, ikincil antikor üzerinde kullanılan floroforla eşleşmesi için DAPI, GFP, tdDomates ve karşılık gelen uzak kırmızı floroforu seçin. İstediğiniz çözünürlüğü ayarlayın, en az 1024 x 1024 öneririz. İğne deliğini 1 AU olarak ayarlayın.
    3. Lazer yoğunluğunu ve dedektör kazancını ilk önce hem GFP hem de floresan ikincil ile boyanmış bir Cre-control beyni ile ayarlayın. Bu beyin dilimleri, floresan antikorlarından gelen arka plan floresansını kontrol edecek ve gerçek GFP sinyali göstermeyecektir.
    4. Lazer yoğunlukları ve dedektör kazancı optimize edildikten sonra, görüntüleme için beynin haritasını çıkarın. Görüntü alımının X ve Y eksenini ayarlamak için beyin bölümünün tüm çevresini bularak başlayın. Ardından, odak noktasını yaklaşık olarak dokunun merkez derinliğine ayarlayarak Z eksenini tanımlayın ve dokunun "en yüksek" noktasını (en pozitif Z değeri) bulmak için Z konumlandırma kontrollerini kullanın. Gerektiğinde maksimum Z ekseni yüksekliğini artırarak dokunun çeşitli bölgelerini tarayın.
      1. Dokunun tüm kalınlığını elde etmek için gereken "en düşük" (en negatif Z-değeri) nokta için tekrarlayın. Stellaris 5, odak noktasının ± 250 um'luk bir sınıra sahiptir. Bu, optik bölümleri Z ekseninde 500 μm kalınlığa sınırlar. Beyin bölümünün 3B alanı artık bilinmektedir.
    5. Z-adım boyutunu 6 μm olarak ayarlayın ve görüntüyü almaya başlayın. Edinme süresi çeşitli faktörlere bağlıdır ve istenen parametrelere bağlı olarak saatlerden günlere kadar değişebilir. Görüntü alma süresini kısaltmak için çözünürlükleri azaltmayı, lazer tarama hızını artırmayı veya adım boyutunu artırmayı deneyin.
    6. Temizlenmiş tüm beyin bölümünün döşenmiş görüntüsü yakalandıktan sonra, istediğiniz gibi analiz edin.

Sonuçlar

Bir floresan muhabiri olan bir Tet-On sisteminden kaynaklanan floresan sinyali, ilginin destekleyicisine ve kullanılan florofor (lar) a bağlı olarak değişmekle birlikte, bulguların mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG hayvanlarıyla nasıl analiz edildiğini açıklayacağız. Bir nabız kovalamacasından sonra yetişkin beyinlerinin analizi, çeşitli anatomik nişler boyunca membran GFP eksprese eden hücrelerle sonuçlandı. Çeşitli hücre tipleri arasındaki floresan yoğunluğundaki fark not edilmelidir. Floresan...

Tartışmalar

Yetişkin fare beynindeki kök hücreleri in vivo olarak işaretleyen üçlü transgenik soy izleme fare çizgisinin oluşturulması, kullanılması ve analizi için bir yöntem açıklanmaktadır. İmmün boyama veya beyin temizliği ile birleştirildiğinde, beyindeki izlenen floresan hücrelerin tanımlanması ve karakterizasyonu gerçekleştirilebilir. Bu teknik, etiketli kök hücrelerin aktive olurken, göç ederken, farklılaşırken veya çoğalırken plastik / rejeneratif / yeniden şekillenme potansiye...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar Dr. Diana Carlone (Boston Çocuk Hastanesi, Harvard Tıp Fakültesi) ve Dr. Matthew Lynes'e (Joslin Diyabet Merkezi; Maine Tıp Merkezi Araştırma Enstitüsü) mTert-rtTA hayvanlarını kullanarak rehberlik için.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibody diluentAgilentS080983-2
Antigen Retrieval SolutionAgilentS2367
anti-GFP antibodyInvitrogenA2311Use at 1:500-1:000
AcetoneFisher ScientificA18-4
B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/JThe Jackson LaboratoryJAX:006234
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/JThe Jackson LaboratoryJAX:007676
Blocking Solution (IHC)Millipore Sigma20773
Blunt needleBSTEANX0012SYHIV
Coronal brain blockBraintreeBS-2000C
Cover slipCorning2850-22
CryostatLeicaCM1900
DAPISigma-AldrichD564
Dibenzyl etherMillipore Sigma33630
DichloromethaneSigma-Aldrich270997
Dimethyl SulfoxideSigma-AldrichD8418
Donkey SerumSigma-AldrichD9663
Doxycycline HyclateSigma-AldrichD9891
GlycineBio-Rad161-0718
Heparin Sodium Salt from Porcine MucosaSigma-AldrichH3393
Histochoice Molecular Biology Tissue FixativeAmrescoH120This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)
Hydrogen Peroxide SolutionSigma-Aldrich516813
IHC Select TBS Rinse BufferMillipore Sigma20845
KetamineWestward0143-95095-10This product requires a DEA license for storage and use.
MethanolFisher ScientificA452-4
Microscope SlidesFisherbrand12-550-15
Milipore BlockMillipore20773
Mounting mediumMillipore Sigma5013
Optimal Cutting Temperature SolutionSakura4583
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
PBS Solution (10X)TeknovaP0496
Sagittal brain blockBraintreeRBM-2000S
SalineBraunS8004-5264
SucroseSigma-AldrichS7903
Sudan (Typogen) BlackMillipore Sigma199664
TetrahydrofuranSigma-Aldrich186562
Tissue cartridgeSimportM512
Triton X-100Bio-Rad1610407
Tween-20Millipore Sigma655205
XylazineAnaSedsc-362950Rx

Referanslar

  1. Carlone, D. L., et al. Telomerase expression marks transitional growth-associated skeletal progenitor/stem cells. Stem Cells. 39 (3), 296-305 (2021).
  2. Altman, J., Das, G. D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. Journal of Comparative Neurology. 124 (3), 319-335 (1965).
  3. Cameron, H. A., Gould, E. Adult neurogenesis is regulated by adrenal steroids in the dentate gyrus. Neuroscience. 61 (2), 203-209 (1994).
  4. Kaplan, M. S., Hinds, J. W. Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs. Science. 197 (4308), 1092-1094 (1977).
  5. Gould, E., et al. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult tree shrew is regulated by psychosocial stress and NMDA receptor activation. Journal of Neuroscience. 17 (7), 2492-2498 (1997).
  6. Eriksson, P. S., et al. Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nature Medicine. 4 (11), 1313-1317 (1998).
  7. Gould, E., et al. Neurogenesis in adulthood: a possible role in learning. Trends in Cognitive Science. 3 (5), 186-192 (1999).
  8. Hastings, N. B., Gould, E. Rapid extension of axons into the CA3 region by adult-generated granule cells. Journal of Comparative Neurology. 413 (1), 146-154 (1999).
  9. Hu, V. W., et al. 3H-thymidine is a defective tool with which to measure rates of DNA synthesis. The FASEB Journal. 16 (11), 1456-1457 (2002).
  10. Cifuentes, M., et al. A comparative analysis of intraperitoneal versus intracerebroventricular administration of bromodeoxyuridine for the study of cell proliferation in the adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 201 (2), 307-314 (2011).
  11. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
  12. Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
  13. Guizzetti, M., Kavanagh, T. J., Costa, L. G. Measurements of astrocyte proliferation. Methods in Molecular Biology. 758, 349-359 (2011).
  14. Gomez-Nicola, D., et al. Regulation of microglial proliferation during chronic neurodegeneration. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2481-2493 (2013).
  15. Bradl, M., Lassmann, H. Oligodendrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 37-53 (2010).
  16. Das, A. T., Tenenbaum, L., Berkhout, B. Tet-On systems for doxycycline-inducible gene expression. Current Gene Therapy. 16 (3), 156-167 (2016).
  17. Lee, C. M., et al. Single-cell RNA-seq analysis revealed long-lasting adverse effects of tamoxifen on neurogenesis in prenatal and adult brains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (32), 19578-19589 (2020).
  18. Smith, B. M., et al. Oral and injected tamoxifen alter adult hippocampal neurogenesis in female and male mice. eNeuro. 9 (2), (2022).
  19. Greenberg, R. A., et al. Expression of mouse telomerase reverse transcriptase during development, differentiation and proliferation. Oncogene. 16 (13), 1723-1730 (1998).
  20. Cong, Y. S., Wright, W. E., Shay, J. W. Human telomerase and its regulation. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (3), 407-425 (2002).
  21. Breault, D. T., et al. Generation of mTert-GFP mice as a model to identify and study tissue progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (30), 10420-10425 (2008).
  22. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 179-184 (2011).
  23. Lin, S., et al. Distributed hepatocytes expressing telomerase repopulate the liver in homeostasis and injury. Nature. 556 (7700), 244-248 (2018).
  24. Lynes, M. D., et al. Telomerase reverse transcriptase expression marks a population of rare adipose tissue stem cells. Stem Cells. 40 (1), 102-111 (2022).
  25. Cousins, F. L., et al. Telomerase reverse transcriptase expression in mouse endometrium during reepithelialization and regeneration in a menses-like model. Stem Cells and Development. 28 (1), 1-12 (2019).
  26. Deane, J. A., et al. The mouse endometrium contains epithelial, endothelial and leucocyte populations expressing the stem cell marker telomerase reverse transcriptase. Molecular Human Reproduction. 22 (4), 272-284 (2016).
  27. Thompson, C. A. H., Wong, J. M. Y. Non-canonical functions of telomerase reverse transcriptase: emerging roles and biological relevance. Current Topics in Medicinal Chemistry. 20 (6), 498-507 (2020).
  28. Lynes, M. D., et al. Telomerase reverse transcriptase expression marks a population of rare adipose tissue stem cells. Stem Cells. , (2021).
  29. Redelsperger, I. M., et al. Stability of doxycycline in feed and water and minimal effective doses in tetracycline-inducible systems. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (4), 467-474 (2016).
  30. Jensen, G. J., et al. Telomerase reverse transcriptase (TERT)-expressing cells mark a novel stem cell population in the adult mouse brain. Peer Review. , (2022).
  31. Muzumdar, M. D., et al. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  32. Bocker, R., et al. Comparison of distribution of doxycycline in mice after oral and intravenous application measured by a high-performance liquid chromatographic method. Arzneimittelforschung. 31 (12), 2116-2117 (1981).
  33. Lucchetti, J., et al. Plasma and brain concentrations of doxycycline after single and repeated doses in wild-type and APP23 mice. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 368 (1), 32-40 (2019).
  34. Sun, Y., Chen, X., Xiao, D. Tetracycline-inducible expression systems: new strategies and practices in the transgenic mouse modeling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 39 (4), 235-246 (2007).
  35. Lee, P., et al. Conditional lineage ablation to model human diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (19), 11371-11376 (1998).
  36. Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as "gold standard" for immunohistochemistry. American Journal of Clinical Pathology. 129 (3), 358-366 (2008).
  37. Delgado, A. C., et al. Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain. Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).
  38. Bratthauer, G. L. Preparation of frozen sections for analysis. Immunocytochemical Methods and Protocols. , 67-73 (2010).
  39. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  40. Cawthorne, C., et al. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. Journal of Biomolecular Techniques. 18 (2), 120-123 (2007).
  41. Hristovska, I., et al. Ketamine/xylazine and barbiturates modulate microglial morphology and motility differently in a mouse model. PLoS One. 15 (8), 0236594 (2020).
  42. Pereira, G. C., et al. Anesthesia can alter the levels of corticosterone and the phosphorylation of signaling molecules. BMC Research Notes. 14 (1), 363 (2021).
  43. Markakis, E. A., Gage, F. H. Adult-generated neurons in the dentate gyrus send axonal projections to field CA3 and are surrounded by synaptic vesicles. Journal of Comparative Neurology. 406 (4), 449-460 (1999).
  44. Magavi, S. S., Leavitt, B. R., Macklis, J. D. Induction of neurogenesis in the neocortex of adult mice. Nature. 405 (6789), 951-955 (2000).
  45. Evans, J., et al. Characterization of mitotic neurons derived from adult rat hypothalamus and brain stem. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 1076-1085 (2002).
  46. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Neurogenesis in the hypothalamus of adult mice: potential role in energy balance. Science. 310 (5748), 679-683 (2005).
  47. Parent, A., Cicchetti, F., Beach, T. G. Calretinin-immunoreactive neurons in the human striatum. Brain Research. 674 (2), 347-351 (1995).
  48. Rich, E. L., Shapiro, M. Rat prefrontal cortical neurons selectively code strategy switches. Journal of Neuroscience. 29 (22), 7208-7219 (2009).
  49. Suzuki, S. O., Goldman, J. E. Multiple cell populations in the early postnatal subventricular zone take distinct migratory pathways: a dynamic study of glial and neuronal progenitor migration. Journal of Neuroscience. 23 (10), 4240-4250 (2003).
  50. Figueres-Onate, M., Sanchez-Gonzalez, R. -., Lopez-Mascaraque, L. -. Deciphering neural heterogeneity through cell lineage tracing. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (5), 1971-1982 (2021).
  51. Hammelrath, L., et al. Morphological maturation of the mouse brain: An in vivo MRI and histology investigation. Neuroimage. 125, 144-152 (2016).
  52. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70 (4), 687-702 (2011).
  53. Sanchez-Gonzalez, R., Bribian, A., Lopez-Mascaraque, L. Cell fate potential of NG2 progenitors. Scientific Reports. 10 (1), 9876 (2020).
  54. Suzuki, T., et al. Cells of NG2 lineage increase in glomeruli of mice following podocyte depletion. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 315 (5), 1449-1464 (2018).
  55. Chou, Y. H., et al. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
  56. Hendrickson, M. L., et al. Expression of nestin by neural cells in the adult rat and human brain. PLoS One. 6 (4), 18535 (2011).
  57. Bifari, F., et al. Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 383 (2015).
  58. Doetsch, F., et al. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97 (6), 703-716 (1999).
  59. Seri, B., et al. Astrocytes give rise to new neurons in the adult mammalian hippocampus. Journal of Neuroscience. 21 (18), 7153-7160 (2001).
  60. DeCarolis, N. A., et al. In vivo contribution of nestin- and GLAST-lineage cells to adult hippocampal neurogenesis. Hippocampus. 23 (8), 708-719 (2013).
  61. Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. Cells in the astroglial lineage are neural stem cells. Cell and Tissue Research. 331 (1), 179-191 (2008).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır