JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول نموذجا لالتهاب الأمعاء والقولون الناخر القمي (NEC) في طبق باستخدام الأمعاء المعوية الصغيرة ذات القطبية المعكوسة ، مما يسمح بالوصول إلى السطح القمي. نحن نقدم بروتوكول تلطيخ الفلورسنت المناعي للكشف عن الاضطراب الظهاري المرتبط ب NEC وطريقة لتحديد جدوى المعوية القمية الخارجة الخاضعة لبروتوكول NEC-in-a-dish.

Abstract

التهاب الأمعاء والقولون الناخر (NEC) هو مرض مدمر يصيب الأطفال الخدج ، ويتميز بالتهاب الأمعاء والنخر. ظهرت المعوية مؤخرا كنظام واعد لنمذجة أمراض الجهاز الهضمي. ومع ذلك ، فإن الطرق المستخدمة حاليا للتلاعب المعوي إما تفتقر إلى الوصول إلى السطح القمي للظهارة (ثلاثي الأبعاد [3D]) أو تستغرق وقتا طويلا وكثيفة الاستخدام للموارد (الطبقات الأحادية ثنائية الأبعاد [2D]). غالبا ما تتطلب هذه الطرق خطوات إضافية ، مثل الحقن المجهري ، حتى يصبح النموذج قابلا للترجمة الفسيولوجية. هنا ، نصف بروتوكولا ذا صلة فسيولوجية وغير مكلف لدراسة NEC في المختبر عن طريق عكس القطبية المعوية ، مما يؤدي إلى مواجهة السطح القمي للخارج (القمي للخارج). كما يتم توفير بروتوكول تلطيخ الفلورسنت المناعي لفحص سلامة الحاجز المعوي وتعبير البروتين الموصل بعد التعرض لعامل نخر الورم ألفا (TNF-α) أو عديد السكاريد الشحمي (LPS) في ظل ظروف النورموكسيك أو نقص الأكسجين. كما يتم تقييم جدوى المعوية القمية 3D المعرضة ل normoxic أو hypoxic LPS أو TNF-α لمدة 24 ساعة. أظهرت المعوية المعرضة إما LPS أو TNF-α ، بالاشتراك مع نقص الأكسجة ، اضطرابا في البنية الظهارية ، وفقدان تعبير بروتين الوصلة الملتصقة ، وانخفاض في صلاحية الخلايا. يصف هذا البروتوكول نموذجا جديدا ل NEC-in-a-dish من القمي يقدم منصة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية وفعالة من حيث التكلفة لتحديد الأهداف الظهارية المحتملة لعلاجات NEC ودراسة الاستجابة المعوية المبكرة للعلاجات.

Introduction

التهاب الأمعاء والقولون الناخر (NEC) ، وهو مرض التهابي حاد في الأمعاء الدقيقة يحدث في ما يصل إلى 10 ٪ من الأطفال الخدج ، يرتبط عادة بارتفاع معدلات المراضة والوفيات 1,2. معدلات الوفيات التي تقترب من 50٪ في الرضع ذوي الوزن المنخفض جدا عند الولادة (<1500 جم) ، الذين يحتاجون إلى تدخل جراحي ، ليست غير شائعة3. في حين أن المسببات الدقيقة ل NEC غير مفهومة حاليا ، يعتقد أن عوامل الخطر ، مثل التغذية بالصيغة ، تتضاعف مع الشذوذ الفسيولوجي ، مثل dysbiosis ، وظهارة معوية غير ناضجة ، وحاجز معوي مختل وظيفيا ، في تطور المرض 2,4. على الرغم من الجهود الكبيرة المبذولة ، لم يحدث تقدم يذكر في الوقاية أو العلاج من NEC خلال العقد الماضي5. هناك حاجة إلى طريقة جديدة في المختبر لدراسة NEC واختلال الحاجز الظهاري المعوي المرتبط بها لتعزيز فهم التسبب في المرض ، حيث أن النتائج المستخلصة من النماذج الحيوانية قد ترجمت ، حتى الآن ، بشكل سيئ إلى جانب السرير6.

تم استخدام عدد من النماذج في المختبر للتحقيق في الآليات التي تعمل خلال NEC. خط الخلايا الظهارية المعوية البشرية ، Caco-2 ، هو من بين النماذج الأكثر استخداما في المختبر من NEC 7,8. تحاكي خلايا Caco-2 السمات المورفولوجية لحدود الفرشاة للأمعاء الدقيقة ، ولكن ، كخط خلوي ، لا تتمايز في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا في الجسم الحي ، بما في ذلك الخلايا الكأسية المنتجة للمخاط ، المطلوبة لنموذج قابل للترجمة بدرجة عالية. HT-29-MTX ، خلايا سرطان القولون الغدي البشري ، تشمل الخلايا المعوية المختلطة والنمط الظاهري لخلية الكأس ، ولكنها لا تزال تفتقر إلى أنواع الخلايا القائمة على السرداب من الظهارة المعوية9. IEC-6 و IEC-18 عبارة عن خطوط خلوية غير محولة ذات مورفولوجيا غير ناضجة تشبه السرداب اللفائفي ولكنها غير مشتقة من الأنسجة البشرية ، مما يحد من قدرتها الانتقالية. تستمد خطوط الخلايا المعوية FHs 74-Int و H4 من أنسجة الجنين البشري ولا تشكل تقاطعات ضيقة أو طبقات أحادية مستقطبة10,11 ، وبالتالي فهي غير ناضجة مقارنة حتى بأكثر الأطفال الخدج عرضة ل NEC. عادة ، تستخدم نماذج NEC في المختبر علاجات عديد السكاريد الشحمي (LPS) للحث على مستقبلات تشبه الرسوم 4 (TLR4) ، وهي مستقبل رئيسي يبدأ التهاب الأمعاء في NEC12. غالبا ما يستخدم الضرر الذي يتم بوساطة معالجة أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، عادة عن طريق بيروكسيد الهيدروجين ، للحث على تلف الأكسدة الشبيه ب NEC وموت الخلايا المبرمج13,14. كمحرك رئيسي لالتهاب الأمعاء ، يستخدم عامل نخر الورم ألفا (TNF-α) ، وهو مكون مصب لإشارات TLR4 الالتهابية ، بشكل شائع في هذه النماذج في المختبر لتقليد التسبب في الجسم الحي 15.

نمت شعبية المواد العضوية ، الناتجة عن الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) ، كنموذج في المختبر للأمعاء بسبب قدرتها على تلخيص المجمع في بنية الجسم الحي وتكوين الأنسجة من نوع الخلية التي تستمد منها16,17. نظام مخبري ذي صلة ، enteroids ، هي عضويات مشتقة من سراديب معوية مقطوعة يتم إنشاؤها وصيانتها بسهولة أكبر من المواد العضوية المشتقة من iPSC. عادة ما تزرع الأمعاء في مصفوفة ثلاثية الأبعاد (3D) خارج الخلية (ECM) مع وصول تجريبي يقتصر على سطح الخلية القاعدية. تم تطوير طرق ، مثل الحقن المجهري 18,19 ، للتغلب على هذا الحاجز أمام السطح القمي ، ولكن تراكم الحطام الخلوي المتخادع والمخاط داخل التجويف يجعل الحقن المجهري صعبا وغير متسق من الناحية الفنية. نظرا لأن منصات الحقن المجهري الروبوتية المخصصة لا يمكن الوصول إليها على نطاق واسع20 ، فإن التباين من مختبر إلى مختبر في القدرة التقنية والتقنية العامة يصبح متغيرات مهمة للتغلب عليها باستخدام بروتوكولات الحقن المجهري. تسمح الطبقات الأحادية ثنائية الأبعاد (2D) المشتقة من الأمعاء ثلاثية الأبعاد المنفصلة ، والتي لا تزال تضم جميع أنواع الخلايا الرئيسية للظهارة المعوية ، بالوصول إلى السطح القمي ولكن كان من الصعب تقليديا الحفاظ عليها بدون طبقة مغذية من الخلايا الليفية العضلية الوسيطة21. في حين يمكن استخدام الدعامات النفاذة لزراعة الخلايا للوصول إلى كل من الجانبين القمي والقاعدي للطبقات الأحادية المعوية دون استخدام الخلايا الليفية العضلية الأساسية ، فإن هذه الإدخالات تتطلب استئصال الغشاء وتركيبه قبل الاستخدام بطرائق مثل المجهر البؤري ، مما يؤدي إلى عملية أكثر تطلبا من الناحية الفنية وصعوبة عند استخدام طرق الفحص المجهري التقليدية22. تم تصميم NEC في المختبر باستخدام المعوية التقليدية ثلاثية الأبعاد 23,24,25 ويدعمالنفاذية 26,27 ، وقد تم تكرار التهاب الأمعاء مؤخرا مع نماذج الأمعاء على رقاقة 28,29. في حين أن نماذج الأمعاء على رقاقة التي تتضمن الموائع الدقيقة هي ، إلى حد بعيد ، النماذج الأكثر تقدما والقابلة للترجمة ، فإن هذه التكنولوجيا باهظة الثمن ومعقدة ولا يمكن لمعظم الباحثين الوصول إليها30.

سمحت التطورات الحديثة في تقنيات الأمعاء القمية بالوصول بسهولة إلى السطح القمي للأمعاء ثلاثية الأبعاد دون المخاطرة بتلف السلامة الهيكلية للظهارة في المختبر 31،32،33. تشترك المعوية القمية في تكوين نوع الخلية ووظيفة الحاجز في الظهارة المعوية في الجسم الحي ، ولكن ، على عكس الأمعاء 3D النموذجية ، تواجه الأسطح القمية لهذه الخلايا وسط الثقافة ، مما يسمح بإجراء المزيد من الدراسات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية حول امتصاص العناصر الغذائية ، والعدوى الميكروبية ، والإفراز اللمعاني31. ميزة إضافية من المعوية القمية هي القدرة على توزيع العوامل التجريبية بشكل متجانس على الأمعاء. لا يلزم اختلاف أحجام العلاج بناء على حجم الأمعاء ، كما هو الحال مع الحقن المجهري ، والقدرة على الحفاظ على هذه الأمعاء في ثقافة التعليق تنفي أي تدخل ECM على انتشار العامل التجريبي32.

التهاب الأمعاء والقولون الناخر هو مرض متعدد العوامل ينطوي على أنواع متعددة من الخلايا الظهارية المعوية ومجموعة متنوعة من العوامل البيئية والفسيولوجية المرضية34. تكوين الخلايا المتنوعة من الأمعاء المعوية هو تحسن واضح على الثقافات الأحادية في نمذجة مرض معقد مثل NEC. ومن المثير للاهتمام ، في حين أن التعرض الالتهابي واحد غالبا ما يكون كافيا للحث على حدوث ضرر في المزارع الأحادية في المختبر ، يبدو أن الأمعاء ، كما هو الحال مع نماذج الفئران23 ، تتطلب ما لا يقل عن مكونين التهابيين للحث على تلف يشبه NEC6. هنا ، نقدم نموذجا ل NEC-in-a-dish ، باستخدام المعوية القمية الخارجية بالاشتراك مع نقص الأكسجة (ميزة سريرية مهمة ل NEC6) وإما LPS أو TNF-α ، كنموذج محسن وأكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية في المختبر لدراسة الاستجابات الظهارية للالتهاب الشبيه ب NEC ، وربما تحديد الأهداف العلاجية. نحن نصف بروتوكولا لعكس قطبية الأمعاء المعوية الصغيرة 3D ، بالإضافة إلى بروتوكول تلطيخ الفلورسنت المناعي لتحديد اضطراب الحاجز الظهاري وتغيرات التعبير عن البروتين الوصلة. وأخيرا، نعرض أيضا فحصا بسيطا لجدوى الأمعاء لتحديد تأثير نموذج NEC-in-in-a-dish المزدوج الضربة.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات التابعة لمركز العلوم الصحية بجامعة أوكلاهوما. تم الحصول على عينات راحة الأمعاء الدقيقة من الرئيسيات غير البشرية الخدج (NHP ، 90٪ من الحمل ، البابون الزيتون ، Papio anubis) بعد القتل الرحيم لدراسة منفصلة (البروتوكول # 101523-16-039-I).

1. إنشاء نموذج NEC-in-a-dish المعوي القمي

  1. إعداد الوسائط والعلاجات المعوية
    ملاحظة: بمجرد إعدادها باتباع تقنية التعقيم القياسية ، يمكن تخزين الوسائط عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 أسبوع.
    1. تحضير وسائط خالية من المضادات الحيوية (AFM) عن طريق خلط 50 مل من وسائط النمو العضوي البشري مع 50 مل من المكملات العضوية (انظر جدول المواد). تحضير 5 mM حمض الإيثيلين ديامين تتراسيتيك / 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (EDTA / PBS) عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 0.5 M EDTA إلى 9900 ميكرولتر من PBS.
    2. قم بتبريد خليط النسر المعدل من Dulbecco المتوسط / المغذي F12 + 15 mM HEPES Buffer (DMEM / F12) عند 2-8 درجة مئوية.
    3. تحضير محلول مخزون TNF-α عن طريق تعليق 100 ميكروغرام من مسحوق TNF-α في 1 مل من 1x PBS. زيادة تخفيف مخزون TNF-α إلى تركيزات 20 نانوغرام/مل و 50 نانوغرام/مل باستخدام AFM كمذيب. قم بإعداد محلول مخزون LPS عن طريق تعليق 2 ملغ من LPS في 1 مل من 1x PBS. مزيد من تخفيف المخزون LPS إلى 100 ميكروغرام / مل و 200 ميكروغرام / مل باستخدام AFM كمذيب.
  2. عكس قطبية الأمعاء 3D
    ملاحظة: يهدف الإجراء التالي إلى عكس لوحة واحدة من 24 بئرا مسطحة القاع إلى لوحين لزراعة الأنسجة ذات التعلق المنخفض للغاية 24 بئرا. يجب تسخين ألواح زراعة الأنسجة إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. تم تحقيق اشتقاق الأمعاء ثلاثية الأبعاد القاعدية كما هو موضح سابقا من قبل العديد من المجموعات35,36 ، مع تعديلات طفيفة على الوسائط (مفصلة أعلاه). لا يختلف إجراء اشتقاق الأمعاء العام عن إجراء البشر. باختصار ، يتم غسل الأنسجة المستأصلة ، وتقطيعها إلى شظايا صغيرة ، واحتضانها في مخزن مؤقت لتعطيل الخلايا. ثم يتم تشغيل محلول الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر ، مما يؤدي إلى سراديب مطلية بكثافة عالية.
    1. استنشاق الوسائط من كل بئر من لوحة 24 بئرا من المعوية القاعدية 3D المعمول بها.
    2. أضف 500 ميكرولتر من 5 mM من EDTA / PBS البارد إلى كل بئر من لوحة 24 بئرا وقم بتعطيل مستخلص الغشاء السفلي / قبة ECM ميكانيكيا بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة p200 بحد أدنى 5x-6x.
    3. انقل محتويات أربعة آبار إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وأضف 8 مل من EDTA / PBS البارد إلى الأنبوب المخروطي. نقل ال 20 بئرا المتبقية بنفس الطريقة.
    4. احتضان أنابيب مخروطية 15 مل عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة على منصة دوارة أو شاكر عند 330 دورة في الدقيقة. بعد حضانة 1 ساعة ، قم بالطرد المركزي للأنابيب المخروطية عند 300 × g لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة والتخلص من supernatant من كل أنبوب.
    5. الجمع بين وغسل الكريات الخلوية مع 5 مل من DMEM / F12 وتوزيع تعليق الخلية في أنبوبين مخروطيين 15 مل.
    6. قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 300 × g لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الفائقة وأضف 12 مل من AFM إلى كل أنبوب ، مما يضمن إنعاش كريات الخلايا.
    7. ماصة 500 ميكرولتر من التعليق المعوي في كل بئر من اثنين من لوحات المرفقة 24 بئر منخفضة للغاية.
    8. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة2-5 أيام أو حتى تعكس الأمعاء القطبية.
    9. للتحقق من انعكاس الأمعاء ، قم أولا بإنشاء تلطيخ الفلورسنت المناعي التأكيدي ومتوسط الوقت اللازم للانعكاس (~ 3 أيام) ، ثم تأكد من انعكاس القطبية باستخدام تصور مجهري ضوئي أساسي. المعوية القمية الخارجية خلوية جدا في المظهر ، في حين أن الأمعاء القاعدية الجانبية غالبا ما يهيمن عليها وجود تجويف مركزي كبير أو مهد (انظر الشكل التكميلي 1).
      ملاحظة: بمجرد توحيد الإجراء ، يتجاوز معدل التحويل إلى القمي عادة 95٪. يهدف استخدام المعوية القمية إلى أن تكون تجربة طرفية ، على الرغم من أنه من الممكن نظريا تمرير الأمعاء القمية إلى عدد صغير من الأمعاء القاعدية الجانبية.
  3. Apical-out NEC-in-a-dish
    ملاحظة: بمجرد أن تعكس المعوية القطبية ، استخدم الثقافات في التجارب اللاحقة بسرعة ، حيث لم يتم تأكيد طول عمرها في التشكيل القمي بعد 3-4 أيام. بالنسبة لنموذج NEC-in-a-dish التالي ، تمت معالجة الأمعاء لمدة 24 ساعة ، ثم تم جمعها بعد ذلك مباشرة وحفظها للتجارب النهائية.
    1. بمجرد أن تعكس الأمعاء بصريا القطبية بكفاءة لا تقل عن 95٪ ، قم بإزالة الألواح من الحاضنة وجمع ثمانية آبار من صفيحة 24 بئرا في أنبوب مخروطي 15 مل. نظرا لأن المعوية القمية في حالة تعليق ، فما عليك سوى ماصة محلول الأمعاء / الوسائط. جهاز طرد مركزي أنبوب 15 مل عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    2. بمجرد أن يتم تكوير الخلايا ، قم بإزالة supernatant وأعد تعليق حبيبة الخلية في 4 مل من AFM الممزوج بالحجم المطلوب (10 ميكرولتر هنا لمطابقة أعلى حجم علاج مضاف) من 1x PBS (التحكم).
    3. ماصة 500 ميكرولتر من التعليق المعوي / PBS / AFM في ثمانية آبار من لوحة مرفق منخفضة للغاية من 24 بئرا وتحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
    4. كرر الخطوات 1.3.1.-1.3.3. لمعالجات TNF-α (20 نانوغرام/مل و50 نانوغرام/مل) وLPS (100 ميكروغرام/مل و200 ميكروغرام/مل) في نورموكسيا. بالنسبة لجميع علاجات نقص الأكسجة ، كرر الخطوات 1.3.1.-1.3.3.3 ، ولكن ضع اللوحة في حاضنة منفصلة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ CO 2 ، و 1٪ O2 لمدة 24 ساعة.
      ملاحظة: الخطوة 1.3.4. يمكن القيام به في وقت واحد مع الخطوات 1.3.1.-1.3.3 ، ولكن ، من أجل الوضوح ، تم فصل الإجراء أعلاه عن طريق العلاج من أجل تقليل التعقيد.

2. تلطيخ الفلورسنت المناعي والمجهر البؤري

  1. إعداد حلول تلطيخ
    1. تحضير 0.1٪ Triton X-100 عن طريق خلط 7 ميكرولتر من Triton X-100 في 1x PBS إلى حجم نهائي من 7 مل. قم بإعداد PBST (PBS-Tween) عن طريق إضافة 30 ميكرولتر من Tween-20 إلى 1x PBS إلى حجم نهائي يبلغ 30 مل.
    2. تحضير 10٪ مصل الحمير العادي (NDS) / PBST عن طريق إضافة 700 ميكرولتر من NDS إلى 6.3 مل من PBST. قم بإعداد 1٪ NDS / PBST عن طريق إضافة 70 ميكرولتر من NDS إلى PBST إلى حجم نهائي من 7 مل.
      ملاحظة: تم استخدام مصل الحمير هنا للارتباط بمضيف الأجسام المضادة الثانوي. ومع ذلك ، يجب أن تتطابق أنواع المصل المانعة مع أنواع الأجسام المضادة الثانوية من أجل منع الربط غير المحدد بشكل صحيح.
  2. تلطيخ (يوم 1)
    1. انقل محتويات أربعة آبار من صفيحة مكونة من 24 بئرا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. كرر ذلك لجميع الآبار / العلاجات المطلوبة ، مع كل علاج في أنبوب منفصل. جهاز الطرد المركزي للأنابيب عند 300 × g لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية. بمجرد أن يتم تكوير المعوية ، قم بإزالة supernatant.
    2. أعد تعليق كريات الخلايا في 300 ميكرولتر من 4٪ من تثبيت الفورمالديهايد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). بعد 30 دقيقة ، قم بطرد الأنابيب مركزيا عند 300 × g لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وقم بإزالة supernatant ، واغسل الكريات ب 500 ميكرولتر من المعقم ، RT 1x PBS.
    3. جهاز الطرد المركزي للأنابيب عند 300 × g لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة supernatant وإضافة 500 ميكرولتر من 0.1 ٪ Triton X-100 ، واتركه لمدة 1 ساعة في RT.
    4. بعد 1 ساعة ، قم بطرد مركزي للأنابيب عند 300 × g لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية وقم بإزالة supernatant. اغسل ب 500 ميكرولتر من 1x PBS وضع الأنابيب على دوار أو شاكر عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة عند 2-8 درجة مئوية. كرر هذا ما مجموعه 4x.
    5. الطرد المركزي للأنابيب عند 300 × غرام لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية وإزالة supernatant. أضف 500 ميكرولتر من 10٪ NDS / PBST واحتضن في RT لمدة 45 دقيقة. أثناء الحضانة ، قم بإعداد محاليل الأجسام المضادة الأولية عن طريق الجمع بين 20 ميكرولتر من الأجسام المضادة المضادة للفيلين المؤتلف ، و 10 ميكرولتر من الجسم المضاد E-cadherin ، و 1970 ميكرولتر من 1٪ NDS / PBST لثمانية آبار من صفيحة 24 بئرا.
    6. بعد 45 دقيقة من الحضانة ، قم بطرد الأنابيب مركزيا عند 300 × g لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية. ضع الأنابيب على الجليد. إزالة supernatant واستبدالها مع 250 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية. احتضان الأنابيب بين عشية وضحاها في 2-8 درجة مئوية.
  3. تلطيخ (يوم 2)
    1. الطرد المركزي للأنابيب عند 300 × غرام لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية وإزالة supernatant. أضف 250-500 ميكرولتر من PBST إلى كل أنبوب ، اعتمادا على حجم الكريات ، وضعها على الدوار أو الخلاط عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة عند 2-8 درجة مئوية. كرر غسل PBST 4x.
    2. تحضير محلول الأجسام المضادة الثانوية عن طريق إضافة 52 ميكرولتر من الحمار Cy3 الحمار المضاد للأرانب IgG (H + L) إلى 50٪ الجلسرين و 5.2 ميكرولتر من الحمار الفلورسنت الأخضر المضاد للفأر 488 الأجسام المضادة الثانوية إلى 5142.8 ميكرولتر من 1٪ NDS / PBST.
    3. بعد آخر غسل PBST والطرد المركزي ، قم بإزالة supernatant من الأنابيب. وزع 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي على كل أنبوب واحتضنه في الظلام بين عشية وضحاها عند 2-8 درجة مئوية.
  4. تركيب المعوية القمية الملطخة (اليوم 1)
    1. أحضر حامل قائم على الجلسرين يحتوي على صبغة نووية زرقاء إلى RT على مدار 1 ساعة.
    2. جهاز الطرد المركزي للأنابيب عند 300 × g لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية. إزالة 100 ميكرولتر من supernatant وإعادة تعليق الخلايا في ~ 100 μL المتبقية من supernatant. انقل تعليق الخلية إلى أنابيب 0.5 مل.
    3. الطرد المركزي للأنابيب في جهاز طرد مركزي صغير لمدة 20 ثانية لتكوير الخلايا. قم بإزالة supernatant وإعادة تعليق كريات الخلايا في 100 ميكرولتر من بقع الحمض النووي الحمراء البعيدة. احتضان الأنابيب في RT لمدة 10 دقائق.
    4. الطرد المركزي للأنابيب في جهاز طرد مركزي صغير لمدة 20 ثانية لتكوير الخلايا. قم بإزالة supernatant وأعد تعليق كريات الخلايا في 100 ميكرولتر من 1x PBS. كرر ذلك لغسل ثان.
    5. الطرد المركزي للأنابيب في جهاز طرد مركزي صغير لمدة 20 ثانية لتكوير الخلايا وإزالة 70 ميكرولتر من السوبرناتانت. أعد تعليق الخلايا في الحجم المتبقي من PBS وانقل المحتويات إلى غطاء ملصق (24 مم × 60 مم).
    6. ضع 75 ميكرولتر من المثبت مباشرة على العينة وقم بإزالة أي فقاعات بطرف ماصة. اسمح للأغطية بالشفاء بين عشية وضحاها (18-24 ساعة) في RT في الظلام.
  5. تركيب المعوية القمية الملطخة (اليوم 2)
    1. بعد المعالجة بين عشية وضحاها ، ضع طبقة رقيقة (~ 15 ميكرولتر) من الجلسرين على الأغطية. قم بتركيب الغطاء على الشريحة الزجاجية واضغط برفق في مكانه. انقر لإزالة أي فقاعات بين الغطاء والشرائح.
    2. اسمح لغطاء الغطاء بضبطه على RT في الظلام لمدة لا تقل عن 2 ساعة ، قبل التصوير عند تكبير 20x باستخدام مجهر بؤري. للحصول على التصور المجهري للأمعاء باستخدام طرق اكتساب مختلفة متحدة البؤرة ، راجع Lallemant et al.37.
  6. القياس الكمي للفلورسنت المناعي
    ملاحظة: تحدد هذه الطريقة التألق الكلي المصحح عن طريق إزالة إشارة الخلفية باستخدام برنامج ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).
    1. افتح الصور متحدة البؤرة في ImageJ وحدد المنطقة المطلوبة باستخدام أداة منطقة الاهتمام (ROI).
    2. قم بتعيين المعلمات المعرفة من قبل المستخدم عن طريق الانتقال إلى تحليل > تعيين القياسات. حدد المساحة > الكثافة المتكاملة > متوسط القيمة الرمادية ضمن علامة التبويب الإعدادات.
    3. انتقل إلى تحليل > القياس. ستظهر نافذة منبثقة تحتوي على القياسات. انسخ هذه القياسات والصقها في جدول بيانات.
    4. لطرح إشارة الخلفية، حدد مساحة صغيرة غير فلورية من الصورة. انتقل إلى تحليل > القياس لتلك المنطقة. ستظهر نافذة منبثقة تحتوي على القياسات. انسخ الإخراج والصقه في جدول بيانات.
    5. اضرب مساحة الخلية المحددة في متوسط تألق قراءات الخلفية، واطرح المجموع من الكثافة المتكاملة لحساب التألق الكلي للخلية المصحح (CTCF). كرر الخطوات المذكورة أعلاه لجميع الصور المثيرة للاهتمام، مع الاحتفاظ بالسجلات في جدول بيانات أو حزمة برامج إحصائية (انظر جدول المواد).

3. القمي خارج NEC-in-a-طبق الخلية الجدوى

  1. العلاجات المعوية
    1. أنشئ نموذج NEC-in-a-dish القمي لمدة 24 ساعة، كما هو الحال في الخطوة 1.
    2. إذابة كاشف فحص صلاحية الخلية بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. في يوم الفحص ، أحضر الكاشف إلى RT 30 دقيقة قبل الاستخدام. عكس الكاشف للخلط.
    3. قبل إجراء الفحص ، قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسائط من كل بئر ، تاركا 400 ميكرولتر المتبقية ، أضف 400 ميكرولتر من كاشف فحص صلاحية الخلية إلى كل بئر.
    4. امزج المحتويات جيدا بقوة على شاكر اللوحة في RT لمدة 5 دقائق عند 200 دورة في الدقيقة للحث على تحلل الخلايا. بعد الاهتزاز ، احتضن اللوحة في RT لمدة 25 دقيقة إضافية.
    5. بعد 25 دقيقة من الحضانة ، امزج محتويات بئر واحد عن طريق السحب وانقل 200 ميكرولتر من 800 ميكرولتر إلى بئر واحد من لوحة 96 بئرا ، غير شفافة ، بوليسترين ، واضحة القاع. كرر ذلك بالنسبة لل 600 ميكرولتر المتبقية ، مما يخلق أربعة نسخ طبق الأصل تقنية لكل بئر. انقل المحتويات المتبقية لكل بئر من لوحة ال 24 بئرا إلى صفيحة 96 بئرا بهذه الطريقة.
    6. باستخدام قارئ لوحات قادر على التلألؤ ، سجل القيم عند تكامل 0.25 مللي ثانية وقارن القيم النسبية بين العلاجات. بدلا من ذلك ، قارن تلألؤ العلاج بمعيار الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP).

النتائج

أصبح استخدام الأمعاء لنمذجة التهاب الأمعاء ، حتى في سياق التهاب الأمعاء والقولون الناخر ، شائعا الآن. ومع ذلك ، فإن معظم الطرق المستخدمة حاليا إما تفتقر إلى الوصول إلى السطح القمي للأمعاء ، مما يلغي الأهمية الفسيولوجية للمركبات المخصصة للاستخدام في نهاية المطاف كعلاجات عن طريق الفم ، أو ?...

Discussion

يسمح التطور الأخير للنماذج المعوية المشتقة من الخبايا الظهارية المعوية بأنسجة مختبرية أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية لدراسة التسبب في التهاب الأمعاء والقولون الناخر. على الرغم من تضمين جميع أنواع الخلايا المتمايزة الرئيسية في ظهارة الأمعاء ، إلا أن الأمعاء 3D لا تزال تخضع للعدي...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه وليس لديهما تضارب في المصالح.

Acknowledgements

هذا المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. يتم دعم HC من خلال منحة P20GM134973 من المعاهد الوطنية للصحة. يتم دعم KB من خلال منحة مؤسسة مستشفى الأطفال (CHF) ومؤسسة الصحة المشيخية (PHF). نشكر مختبر البيولوجيا الجزيئية وأبحاث قياس الخلايا في OUHSC على استخدام المرفق الأساسي ، الذي يوفر التصوير البؤري المنسق.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA, pH 8.0Fisher Scientific15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubesFisher Scientific05-408-129
15 mL Conical tubeVWR89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability AssayPromegaG9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well MicroplatesFisher Scientific07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mmThermo Scientific102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo ScientificA-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugateSigma-AldrichAP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES bufferSTEMCELL Technologies36254
E-cadherin antibody (7H12)Novus BiologicalsNBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9Millipore Sigma1004960700
GlycerolSigma-Aldrich56-81-5
ImageJFijiN/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)STEMCELL Technologies06010
Leica SP8 Confocal MicroscopeLeica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatographyMillipore SigmaL3012-10MG
Microscope SlidesFisher Scientific12-544-7
Normal Donkey SerumSigma-Aldrich566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom MicroplateThermo Scientific136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4Corning21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlueFisher ScientificP36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]Abcamab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µgBio-Techne210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate ReaderMolecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184LFisher Scientific3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661)Thermo ScientificT3605
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat capThermo ScientificAB0350
Tween-20Sigma-Aldrich9005-64-5

References

  1. Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: an immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  3. Bazacliu, C., Neu, J. Necrotizing enterocolitis: long term complications. Current Pediatric Reviews. 15 (2), 115-124 (2019).
  4. Lim, J. C., Golden, J. M., Ford, H. R. Pathogenesis of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatric Surgery International. 31 (6), 509-518 (2015).
  5. Neu, J. Necrotizing enterocolitis: the future. Neonatology. 117 (2), 240-244 (2020).
  6. Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
  7. Emami, C. N., Mittal, R., Wang, L., Ford, H. R., Prasadarao, N. V. Recruitment of dendritic cells is responsible for intestinal epithelial damage in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by Cronobacter sakazakii. Journal of Immunology. 186 (12), 7067-7079 (2011).
  8. Chen, L., et al. Human β-defensin-3 reduces excessive autophagy in intestinal epithelial cells and in experimental necrotizing enterocolitis. Scientific Reports. 9 (1), 19890 (2019).
  9. De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
  10. Gimeno-Alcañiz, J. V., Collado, M. C. Impact of human milk on the transcriptomic response of fetal intestinal epithelial cells reveals expression changes of immune-related genes. Food & Function. 10 (1), 140-150 (2019).
  11. Claud, E. C., Savidge, T., Walker, W. A. Modulation of human intestinal epithelial cell IL-8 secretion by human milk factors. Pediatric Research. 53 (3), 419-425 (2003).
  12. De Plaen, I. G. Inflammatory signaling in necrotizing enterocolitis. Clinics in Perinatology. 40 (1), 109-124 (2013).
  13. Subramanian, S., Geng, H., Tan, X. D. Cell death of intestinal epithelial cells in intestinal diseases. Sheng Li Xue Ba : [Acta Physiologica Sinica]. 72 (3), 308-324 (2020).
  14. Li, B., et al. Intestinal epithelial cell injury is rescued by hydrogen sulfide. Journal of Pediatric Surgery. 51 (5), 775-778 (2016).
  15. Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum reduces apoptosis in the intestinal epithelium in necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (5), 1118-1127 (2010).
  16. Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology - a review of methods. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
  17. Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (12), 1359-1363 (2012).
  18. Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of helicobacter pylori. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (105), e53359 (2015).
  19. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  20. Williamson, I. A., et al. A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
  21. Moorefield, E. C., Blue, R. E., Quinney, N. L., Gentzsch, M., Ding, S. Generation of renewable mouse intestinal epithelial cell monolayers and organoids for functional analyses. BMC Cell Biology. 19 (1), 15 (2018).
  22. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  23. Werts, A. D., et al. A novel role for necroptosis in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 403-423 (2020).
  24. Li, B., et al. Intestinal epithelial tight junctions and permeability can be rescued through the regulation of endoplasmic reticulum stress by amniotic fluid stem cells during necrotizing enterocolitis. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 35 (1), 21265 (2021).
  25. Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. JoVE:Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
  26. Senger, S., et al. Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
  27. Li, B., et al. Activation of Wnt signaling by amniotic fluid stem cell-derived extracellular vesicles attenuates intestinal injury in experimental necrotizing enterocolitis. Cell Death & Disease. 11 (9), 750 (2020).
  28. Beaurivage, C., et al. Development of a human primary gut-on-a-chip to model inflammatory processes. Scientific Reports. 10 (1), 21475 (2020).
  29. Jeon, M. S., et al. Contributions of the microbiome to intestinal inflammation in a gut-on-a-chip. Nano Convergence. 9 (1), 8 (2022).
  30. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
  31. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
  32. Co, J. Y., Margalef-Català, M., Monack, D. M., Amieva, M. R. Controlling the polarity of human gastrointestinal organoids to investigate epithelial biology and infectious diseases. Nature Protocols. 16 (11), 5171-5192 (2021).
  33. Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).
  34. Li, B., et al. Neonatal intestinal organoids as an ex vivo approach to study early intestinal epithelial disorders. Pediatric Surgery International. 35 (1), 3-7 (2019).
  35. Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue. Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).
  36. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (97), e52483 (2015).
  37. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
  38. Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
  39. Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372 (2020).
  40. Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
  41. Schneider, M. R., et al. A key role for E-cadherin in intestinal homeostasis and Paneth cell maturation. PLoS One. 5 (12), 14325 (2010).
  42. Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum improves intestinal integrity in a rat model of necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (5), 940-949 (2009).
  43. Khailova, L., et al. Changes in hepatic cell junctions structure during experimental necrotizing enterocolitis: effect of EGF treatment. Pediatric Research. 66 (2), 140-144 (2009).
  44. Ravisankar, S., et al. Necrotizing enterocolitis leads to disruption of tight junctions and increase in gut permeability in a mouse model. BMC Pediatrics. 18 (1), 372 (2018).
  45. Han, X., et al. Creating a more perfect union: modeling intestinal bacteria-epithelial interactions using organoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 769-782 (2021).
  46. Joo, S. S., et al. Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study. Animals: An Open Access Journal from MDPI. 12 (3), 372 (2022).
  47. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocols. 2 (4), 100951 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved