In vitro Apical-out enteroides Modell der nekrotisierenden Enterokolitis

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein apikal-out-nekrotisierendes Enterokolitis-Modell (NEC)-in-a-dish, das Dünndarmenteroide mit umgekehrter Polarität verwendet und den Zugang zur apikalen Oberfläche ermöglicht. Wir bieten ein Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll zum Nachweis von NEC-bedingten Epithelstörungen und eine Methode zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von apikalen Enteroiden, die dem NEC-in-a-dish-Protokoll unterliegen.

Zusammenfassung

Die nekrotisierende Enterokolitis (NEC) ist eine verheerende Erkrankung bei Frühgeborenen, die durch Darmentzündungen und Nekrosen gekennzeichnet ist. Enteroide haben sich kürzlich als vielversprechendes System zur Modellierung gastrointestinaler Pathologien herausgestellt. Derzeit verwendete Methoden zur enteroiden Manipulation haben jedoch entweder keinen Zugang zur apikalen Oberfläche des Epithels (dreidimensional [3D]) oder sind zeit- und ressourcenintensiv (zweidimensionale [2D] Monoschichten). Diese Methoden erfordern oft zusätzliche Schritte, wie z.B. Mikroinjektion, damit das Modell physiologisch übersetzbar wird. Hier beschreiben wir ein physiologisch relevantes und kostengünstiges Protokoll zur Untersuchung von NEC in vitro durch Umkehrung der enteroiden Polarität, was dazu führt, dass die apikale Oberfläche nach außen zeigt (apikal-out). Ein Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll zur Untersuchung der Integrität der enteroiden Barriere und der junctionalen Proteinexpression nach Exposition gegenüber Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) oder Lipopolysaccharid (LPS) unter normoxischen oder hypoxischen Bedingungen wird ebenfalls bereitgestellt. Die Lebensfähigkeit von 3D-apikalen Enteroiden, die normoxischen oder hypoxischen LPS oder TNF-α für 24 h ausgesetzt waren, wird ebenfalls bewertet. Enteroide, die entweder LPS oder TNF-α ausgesetzt waren, zeigten in Kombination mit Hypoxie eine Störung der Epithelarchitektur, einen Verlust der Adhärenz-Junction-Proteinexpression und eine Verringerung der Zelllebensfähigkeit. Dieses Protokoll beschreibt ein neues apikales NEC-in-a-dish-Modell, das eine physiologisch relevante und kostengünstige Plattform darstellt, um potenzielle epitheliale Ziele für NEC-Therapien zu identifizieren und die frühgeborene Darmreaktion auf Therapeutika zu untersuchen.

Einleitung

Die nekrotisierende Enterokolitis (NEC), eine schwere entzündliche Erkrankung des Dünndarms, die bei bis zu 10% der Frühgeborenen auftritt, ist häufig mit hoher Morbidität und Mortalität verbunden ^1,2. Sterblichkeitsraten von fast 50% bei Säuglingen mit sehr niedrigem Geburtsgewicht (<1500 g), die einen chirurgischen Eingriff erfordern, sind nicht ungewöhnlich³. Während die genaue Ätiologie von NEC derzeit nicht verstanden wird, wird angenommen, dass Risikofaktoren wie die Fütterung von Säuglingsnahrung bei der Entwicklung der Krankheit mit physiologischen Anomalien wie Dysbiose, einem ....

Protokoll

Alle Tierverfahren in dieser Studie wurden vom University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Dünndarmproben von einem frühgeborenen nichtmenschlichen Primaten (NHP, 90% Trächtigkeit, Olivenpavian, Papio anubis) wurden nach Euthanasie für eine separate Studie gewonnen (Protokoll #101523-16-039-I).

1. Etablierung eines apikalen enteroiden NEC-in-a-dish-Modells

1. Vorbereitung von Medien und enteroiden Behandlungen
   HINWEIS: Nach der Herstellung nach aseptischer Standardtechnik können die Medien bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden.
   1. Bereiten Sie....

Ergebnisse

Die Verwendung von Enteroiden zur Modellierung von Darmentzündungen, auch im Zusammenhang mit nekrotisierender Enterokolitis, ist heute üblich. Die meisten derzeit verwendeten Methoden haben jedoch entweder keinen Zugang zur apikalen Oberfläche von Enteroiden, was die physiologische Relevanz von Verbindungen, die für eine eventuelle Verwendung als orale Therapeutika bestimmt sind, negiert, oder sie sind technisch schwierig und zeitaufwendig, wie bei enteroid-abgeleiteten Monoschichten. Um den Nutzen aktueller in .......

Diskussion

Die jüngste Entwicklung enteroider Modelle, die aus intestinalen Epithelkrypten abgeleitet werden, ermöglicht ein physiologisch relevanteres In-vitro-Gewebe , in dem die nekrotisierende Enterokolitis-Pathogenese untersucht werden kann. Trotz der Einbeziehung aller wichtigen differenzierten Zelltypen des Darmepithels unterliegen 3D-Enteroide immer noch mehreren signifikanten Einschränkungen. Die herkömmlichen, basolateralen Enteroide sind in 3D-ECM-Hydrogelkuppeln suspendiert, deren Zusammensetzung und Dichte.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0	Fisher Scientific	15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
15 mL Conical tube	VWR	89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates	Fisher Scientific	07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mm	Thermo Scientific	102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate	Sigma-Aldrich	AP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer	STEMCELL Technologies	36254
E-cadherin antibody (7H12)	Novus Biologicals	NBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Millipore Sigma	1004960700
Glycerol	Sigma-Aldrich	56-81-5
ImageJ	Fiji	N/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	STEMCELL Technologies	06010
Leica SP8 Confocal Microscope	Leica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography	Millipore Sigma	L3012-10MG
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-7
Normal Donkey Serum	Sigma-Aldrich	566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate	Thermo Scientific	136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4	Corning	21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Fisher Scientific	P36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]	Abcam	ab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg	Bio-Techne	210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L	Fisher Scientific	3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661)	Thermo Scientific	T3605
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat cap	Thermo Scientific	AB0350
Tween-20	Sigma-Aldrich	9005-64-5