İn Vitro Nekrotizan Enterokolitin Apikal-Out Enteroid Modeli

Özet

Bu protokol, apikal yüzeye erişime izin veren, ters polariteye sahip ince bağırsak enteroidlerini kullanan apikal-dışarı nekrotizan enterokolit (NEC) bir çanak içi modelini tanımlar. NEC ile ilişkili epitel bozulmasını tespit etmek için bir immünofloresan boyama protokolü ve NEC-in-a-dish protokolüne tabi tutulan apikal-out enteroidlerin yaşayabilirliğini belirlemek için bir yöntem sunuyoruz.

Özet

Nekrotizan enterokolit (NEC), preterm bebekleri etkileyen, intestinal inflamasyon ve nekroz ile karakterize yıkıcı bir hastalıktır. Enteroidler son zamanlarda gastrointestinal patolojileri modellemek için umut verici bir sistem olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, enteroid manipülasyon için şu anda kullanılan yöntemler ya epitelin apikal yüzeyine (üç boyutlu [3D]) erişimden yoksundur ya da zaman alıcı ve kaynak yoğundur (iki boyutlu [2D] tek katmanlılar). Bu yöntemler genellikle modelin fizyolojik olarak çevrilebilir hale gelmesi için mikroenjeksiyon gibi ek adımlar gerektirir. Burada, enteroid polariteyi tersine çevirerek in vitro NEC'yi incelemek için fizyolojik olarak alakalı ve ucuz bir protokol tarif ediyoruz, bu da apikal yüzeyin dışa bakmasıyla sonuçlanıyor (apikal-dışarı). Norkoksi veya hipoksik koşullar altında tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α) veya lipopolisakkarite (LPS) maruziyetini takiben enteroid bariyer bütünlüğünü ve bileşke protein ekspresyonunu incelemek için bir immünofloresan boyama protokolü de sağlanmaktadır. Normoksik veya hipoksik LPS veya TNF-α maruz kalan 3D apikal-out enteroidlerin 24 saat boyunca yaşayabilirliği de değerlendirilmektedir. LPS veya TNF-α maruz kalan enteroidler, hipoksi ile kombinasyon halinde, epitel mimarisinin bozulması, aderans birleşim proteini ekspresyonunun kaybı ve hücre canlılığında bir azalma sergiledi. Bu protokol, NEC tedavileri için potansiyel epitel hedeflerini belirlemek ve terapötiklere erken bağırsak yanıtını incelemek için fizyolojik olarak alakalı ve uygun maliyetli bir platform sunan yeni bir apikal-out-out-NEC-in-a-dish modelini tanımlamaktadır.

Giriş

Preterm bebeklerin %10'una varan oranda ince bağırsağın ciddi inflamatuar bir hastalığı olan nekrotizan enterokolit (NEK), genellikle yüksek morbidite ve mortalite ile ilişkilidir ^1,2. Cerrahi müdahale gerektiren çok düşük doğum ağırlıklı (<1500 g) bebeklerde %50'ye yaklaşan mortalite oranları nadir değildir³. NEC'nin kesin etiyolojisi şu anda anlaşılamamış olsa da, formül besleme gibi risk faktörlerinin, hastalığın gelişiminde dysbiosis, olgunlaşmamış bir bağırsak epiteli ve işlevsiz bir bağırsak bariyeri gibi fizyolojik anomalilerle birleştiği düşünülmektedir <....

Protokol

Bu çalışmadaki tüm hayvan prosedürleri, Oklahoma Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Ayrı bir çalışma için ötenaziyi takiben preterm insan olmayan primattan (NHP,% 90 gebelik, zeytin babunu, Papio anubis) ince bağırsak kolaylık örnekleri elde edildi (Protokol # 101523-16-039-I).

1. Apikal-out enteroid NEC-in-a-dish modelinin kurulması

1. Medya ve enteroid tedavilerin hazırlanması
   NOT: Standart aseptik tekniğe uygun olarak hazırlandıktan sonra, ortam 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.
   1. 50 mL insan organoid büyüme ortamını 50 ....

Sonuçlar

Nekrotizan enterokolit bağlamında bile, bağırsak iltihabını modellemek için enteroidlerin kullanımı artık yaygındır. Bununla birlikte, şu anda kullanılan yöntemlerin çoğu, enteroidlerin apikal yüzeyine erişimden yoksundur, oral terapötikler olarak nihai kullanım için amaçlanan bileşiklerin fizyolojik alaka düzeyini reddeder veya enteroid türevi tek katmanlarda olduğu gibi teknik olarak zor ve zaman alıcıdır. NEC'nin akım in vitro enteroid modellerinin faydasını arttırmak için, .......

Tartışmalar

İntestinal epitel kriptlerinden türetilen enteroid modellerin son zamanlarda geliştirilmesi, nekrotizan enterokolit patogenezinin inceleneceği fizyolojik olarak daha ilgili bir in vitro dokuya izin vermektedir. Bağırsak epitelinin tüm majör farklılaşmış hücre tiplerini içermesine rağmen, 3D enteroidler hala birkaç önemli sınırlamaya tabidir. Konvansiyonel, bazolateral çıkışlı enteroidler, bileşimi ve yoğunluğu doku kültürü ortamında normal difüzyonu sınırlayabilen 3D ECM hidroje.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0	Fisher Scientific	15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
15 mL Conical tube	VWR	89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates	Fisher Scientific	07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mm	Thermo Scientific	102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate	Sigma-Aldrich	AP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer	STEMCELL Technologies	36254
E-cadherin antibody (7H12)	Novus Biologicals	NBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Millipore Sigma	1004960700
Glycerol	Sigma-Aldrich	56-81-5
ImageJ	Fiji	N/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	STEMCELL Technologies	06010
Leica SP8 Confocal Microscope	Leica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography	Millipore Sigma	L3012-10MG
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-7
Normal Donkey Serum	Sigma-Aldrich	566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate	Thermo Scientific	136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4	Corning	21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Fisher Scientific	P36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]	Abcam	ab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg	Bio-Techne	210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L	Fisher Scientific	3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661)	Thermo Scientific	T3605
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat cap	Thermo Scientific	AB0350
Tween-20	Sigma-Aldrich	9005-64-5