JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר מודל אנטרוקוליטיס נמקית (NEC)-בצלחת המשתמש באנטרוואידים של המעי הדק עם קוטביות הפוכה, ומאפשר גישה למשטח האפיקלי. אנו מספקים פרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי לזיהוי הפרעה אפיתליאלית הקשורה ל- NEC ושיטה לקביעת הכדאיות של אנטרואידים אפיקליים הנתונים לפרוטוקול NEC-in-a-dish.

Abstract

אנטרוקוליטיס נמקית (NEC) היא מחלה הרסנית המשפיעה על פגים, המאופיינת בדלקת מעיים ונמק. אנטרואידים התגלו לאחרונה כמערכת מבטיחה למודל פתולוגיות במערכת העיכול. עם זאת, השיטות המשמשות כיום למניפולציה אנטרואידית חסרות גישה לפני השטח האפיקליים של האפיתל (תלת-ממדי [3D]) או שהן גוזלות זמן ועתירות משאבים (מונולרים דו-ממדיים [2D]). שיטות אלה דורשות לעתים קרובות שלבים נוספים, כגון מיקרו-הזרקה, כדי שהמודל יהפוך לניתן לתרגום פיזיולוגי. כאן אנו מתארים פרוטוקול רלוונטי מבחינה פיזיולוגית וזול לחקר NEC במבחנה על ידי היפוך קוטביות אנטרואידית, וכתוצאה מכך המשטח האפיקלי פונה כלפי חוץ (apical-out). כמו כן מסופק פרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי לבחינת שלמות מחסום אנטרואידי וביטוי חלבונים צומתי לאחר חשיפה לגורם נמק גידולי - אלפא (TNF-α) או ליפופוליסכריד (LPS) בתנאים נורמוקסיים או היפוקסיים. כמו כן, נבדקת הכדאיות של אנטרוידים אפיקליים תלת-ממדיים החשופים ל-LPS נורמוקסי או היפוקסי או ל-TNF-α במשך 24 שעות. אנטרוידים שנחשפו ל-LPS או ל-TNF-α, בשילוב עם היפוקסיה, הפגינו הפרעה בארכיטקטורת האפיתל, אובדן ביטוי של חלבון צומת הדבקות וירידה בכדאיות התא. פרוטוקול זה מתאר מודל חדש של NEC-in-a-dish המציג פלטפורמה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית וחסכונית לזיהוי מטרות אפיתל פוטנציאליות לטיפולי NEC ולחקר תגובת המעיים המוקדמת לטיפולים.

Introduction

דלקת המעי הגס (NEC), מחלה דלקתית חמורה של המעי הדק המתרחשת בעד 10% מהפגים, קשורה בדרך כלל לתחלואה גבוהה ולתמותה 1,2. שיעורי תמותה המתקרבים ל-50% בתינוקות במשקל לידה נמוך מאוד (<1500 גרם), הדורשים התערבות כירורגית, אינם נדירים3. בעוד שהאטיולוגיה המדויקת של NEC אינה מובנת כיום, גורמי סיכון, כגון הזנת פורמולה, נחשבים למורכבים עם אנומליות פיזיולוגיות, כגון דיסביוזיס, אפיתל מעיים לא בשל, ומחסום מעיים לא מתפקד, בהתפתחות המחלה 2,4. למרות מאמץ משמעותי, התקדמות מועטה במניעה או בטיפול ב- NEC התרחשה בעשורהאחרון 5. שיטה חדשנית במבחנה לחקר NEC ותפקוד לקוי של מחסום אפיתל במעיים נדרשת כדי לקדם את ההבנה של הפתוגנזה של המחלה, כפי שממצאים ממודלים של בעלי חיים תרגמו עד כה בצורה גרועה למיטה6.

מספר מודלים של מבחנה שימשו כדי לחקור את המנגנונים הפועלים במהלך NEC. קו תאי האפיתל במעיים האנושיים, Caco-2, הוא בין המודלים הנפוצים ביותר בשימוש במבחנה של NEC 7,8. תאי Caco-2 מחקים תכונות מורפולוגיות של גבול המברשת של המעי הדק, אך כקו תאים, אינם מתמיינים למגוון הרחב של סוגי תאי in vivo, כולל תאי גביע המייצרים ריר, הנדרשים למודל הניתן לתרגום גבוה. HT-29-MTX, תאי אדנוקרצינומה של המעי הגס האנושי, כוללים פנוטיפ מעורב של אנטרוציטים ותאי גביע, אך עדיין חסרים סוגי תאים מבוססי קריפטה של אפיתל המעי9. IEC-6 ו-IEC-18 הם קווי תאים שאינם מותמרים עם מורפולוגיה לא בשלה דמוית קריפטה, אך אינם נגזרים מרקמה אנושית, מה שמגביל את יכולת התרגום שלהם. קווי תאי המעי FHs 74-Int ו-H4 מופקים מרקמת עובר אנושית ואינם יוצרים צמתים הדוקים או מונולרים מקוטבים10,11, ולכן הם לא בשלים בהשוואה אפילו לפגים ביותר הרגישים ל-NEC. בדרך כלל, מודלים של NEC במבחנה משתמשים בטיפולי ליפופוליסכריד (LPS) כדי לגרום לקולטן דמוי אגרה 4 (TLR4), קולטן מרכזי הגורם לדלקת מעיים ב-NEC12. נזק המתווך באמצעות טיפול במיני חמצן תגובתי (ROS), בדרך כלל באמצעות מי חמצן, משמש לעתים קרובות כדי לגרום לנזק חמצוני דמוי NEC ואפופטוזיס13,14. כגורם העיקרי לדלקת מעיים, גורם נמק גידולי-אלפא (TNF-α), מרכיב במורד הזרם של איתות TLR4 דלקתי, משמש בדרך כלל גם במודלים אלה במבחנה כדי לחקות פתוגנזה in vivo 15.

אורגנואידים, המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים בלתי ניתנים להשראה (iPSCs), צברו פופולריות כמודל חוץ גופי של המעי בשל יכולתם לשחזר את ארכיטקטורת ה-in vivo המורכבת ואת הרכב התאים של הרקמה שממנה הם נגזרים16,17. מערכת חוץ גופית קשורה, אנטרואידים, הם אורגנואידים שמקורם בקריפטות מעיים שנכרתו שקל יותר להקים ולתחזק מאשר אורגנואידים שמקורם ב-iPSC. אנטרוידים גדלים בדרך כלל במטריצה חוץ-תאית תלת-ממדית (3D) (ECM) עם גישה ניסיונית המוגבלת לפני השטח של התא הבזולטרלי. שיטות כגון מיקרו-הזרקה18,19, פותחו כדי להתגבר על מחסום זה בפני השטח האפיקלי, אך הצטברות של פסולת תאית מרופטת וליחה בתוך הלומן הופכת את המיקרו-הזרקה לקשה מבחינה טכנית ולא עקבית. מכיוון שפלטפורמות מיקרו-הזרקה רובוטיות מותאמות אישית אינן נגישות באופן נרחב20, השתנות מעבדה למעבדה ביכולת הטכנית ובטכניקה הכללית הופכת למשתנים משמעותיים שיש להתגבר עליהם באמצעות פרוטוקולי מיקרו-הזרקה. מונו-שכבות דו-ממדיות (2D) שמקורן באנטרוידים תלת-ממדיים מנותקים, שעדיין כוללים את כל סוגי התאים העיקריים של אפיתל המעי, מאפשרות גישה לפני השטח האפיקליים, אך באופן מסורתי היה קשה לתחזק אותן ללא שכבת הזנה של מיופיברובלסטים מזנכימליים21. בעוד שניתן להשתמש בתמיכות חדירות של תרביות תאים כדי לגשת הן לצד האפיקלי והן לצד הבזולטרלי של מונולרים אנטרואידים ללא שימוש במיופיברובלסטים בסיסיים, תוספות אלה דורשות כריתה והרכבה של הממברנה לפני השימוש בשיטות כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית, וכתוצאה מכך תהליך תובעני וקשה יותר מבחינה טכנית בעת שימוש בשיטות מיקרוסקופיה מסורתיות22. NEC עוצב במבחנה באמצעות אנטרואידים תלת-ממדיים מסורתיים 23,24,25 ותומך חדירב-26,27, ודלקת מעיים שוכפלה לאחרונה עם מודלים של מעיים על שבב 28,29. בעוד שמודלים של בטן על שבב המשלבים מיקרופלואידיקה הם, ללא ספק, המודלים המתקדמים ביותר הניתנים לתרגום, טכנולוגיה זו יקרה, מורכבת ובלתי נגישה לרוב החוקרים30.

ההתקדמות האחרונה בטכניקות אנטרואידיות אפיקליות אפשרה גישה קלה יותר למשטח האפיקלי של אנטרוידים תלת-ממדיים מבלי להסתכן בפגיעה בשלמות המבנית של האפיתל במבחנה 31,32,33. אנטרוידים Apical-out חולקים את הרכב סוג התא ואת תפקוד המחסום של אפיתל מעיים in vivo, אך בניגוד לאנטרוידים תלת-ממדיים טיפוסיים, המשטחים האפיקליים של תאים אלה פונים למדיום התרבית, מה שמאפשר מחקרים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית על ספיגת חומרים מזינים, זיהום מיקרוביאלי והפרשה לומינלית31. יתרון נוסף של אנטרואידים אפיקליים הוא היכולת להפיץ באופן הומוגני חומרים ניסיוניים לאנטרואידים. נפחי טיפול משתנים המבוססים על גודל אנטרואיד אינם נדרשים, כפי שהם עם מיקרו הזרקה, והיכולת לשמור על אנטרוידים אלה בתרבית השעיה שוללת כל הפרעה ECM על דיפוזיה של סוכן ניסיוני32.

דלקת אנטרוקוליטיס נמקית היא מחלה רב-גורמית המערבת מספר סוגי תאי אפיתל מעיים ומגוון גורמים סביבתיים ופתופיזיולוגיים34. הרכב התאים המגוון של אנטרואידים במעיים הוא שיפור ברור לעומת מונוקולטורים במידול מחלה מורכבת כגון NEC. באופן מעניין, בעוד שחשיפה דלקתית אחת מספיקה לעתים קרובות כדי לגרום נזק במונוקולטורות חוץ גופיות , נראה כי אנטרואידים, כמו במודלים של עכברים23, דורשים מינימום של שני מרכיבים דלקתיים כדי לגרום לנזק דמוי NEC6. כאן, אנו מציגים מודל NEC-in-a-dish apical-out, המשתמש באנטרוואידים אפיקליים בשילוב עם היפוקסיה (תכונה קלינית חשובה של NEC6) ו- LPS או TNF-α, כמודל משופר ורלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית במבחנה כדי לחקור תגובות אפיתל לדלקת דמוית NEC, ואולי גם לזהות מטרות טיפוליות. אנו מתארים פרוטוקול להיפוך הקוטביות של אנטרואידים תלת-ממדיים במעי הדק, כמו גם פרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי לזיהוי הפרעה במחסום האפיתל ושינויים בביטוי חלבונים צומתיים. לבסוף, אנו מדגימים עוד יותר בדיקת כדאיות אנטרואידית פשוטה כדי לקבוע את ההשפעה של מודל ה-NEC-in-a-dish שלנו, בעל שתי הלהיטים והאפיקליות.

Protocol

כל נהלי בעלי החיים במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה. דגימות נוחות המעי הדק מפרימט לא אנושי פג (NHP, 90% הריון, בבון זיתים, Papio anubis) התקבלו לאחר המתת חסד למחקר נפרד (פרוטוקול #101523-16-039-I).

1. הקמת מודל NEC-in-a-dish אנטרואידי apical-out

  1. הכנת טיפולי מדיה ואנטרואיד
    הערה: לאחר ההכנה בהתאם לטכניקה אספטית סטנדרטית, ניתן לאחסן את המדיה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
    1. הכן מדיה נטולת אנטיביוטיקה (AFM) על-ידי ערבוב של 50 מ"ל של מדיית גידול אורגנואידית אנושית עם 50 מ"ל של תוסף אורגנואידי (ראו טבלת חומרים). יש להכין 5 מ"מ של חומצה אתילנדיאמינטטראצית/1x מלח עם אגירת פוספט (EDTA/PBS) על-ידי הוספת 100 מיקרו-ליטר של 0.5 M EDTA ל-9,900 מיקרו-ליטר של PBS.
    2. תערובת הנשר הבינונית/מזינה של צ'יל דולבקו F12 + 15 mM HEPES Buffer (DMEM/F12) ב-2-8 מעלות צלזיוס.
    3. הכן את פתרון המלאי של TNF-α על-ידי השעיית 100 מיקרוגרם של אבקת TNF-α ב-1 מ"ל של PBS אחד. דילול נוסף של מלאי TNF-α לריכוזים של 20 ננוגרם/מ"ל ו-50 ננוגרם/מ"ל באמצעות AFM כממס. הכן פתרון מלאי LPS על ידי השעיית 2 מ"ג של LPS ב 1 מ"ל של 1x PBS. דילול נוסף של מלאי LPS ל-100 מיקרוגרם/מ"ל ו-200 מיקרוגרם/מ"ל באמצעות AFM כממס.
  2. היפוך הקוטביות של אנטרוידים תלת-ממדיים
    הערה: ההליך הבא מיועד להיפוך של צלחת תרבית רקמה אחת בעלת תחתית שטוחה של 24 בארות לשני לוחות תרבית רקמה בעלי חיבור נמוך במיוחד של 24 בארות. יש לחמם את צלחות תרבית הרקמה ל-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות לפני השימוש. הנגזרת של אנטרואידים תלת-ממדיים בזולטרליים הושגה כפי שתואר קודם לכן על ידי קבוצות רבות35,36, עם שינויים קלים עבור מדיה (מפורט לעיל). הליך הנגזרת האנטרואידית הכללית אינו שונה מזה של בני אדם. בקצרה, רקמה נכרתת נשטפת, נחתכת לשברים קטנים, ודוגרת במאגר הפרעה לתאים. לאחר מכן, תמיסת התא עוברת דרך מסננת תאים בגודל 70 מיקרומטר, והתוצאה היא קריפטות המצופות בצפיפות גבוהה.
    1. שאפו מדיה מכל באר של צלחת בת 24 בארות של אנטרוידים תלת-ממדיים מבוססים.
    2. הוסף 500 μL של 5 mM EDTA / PBS קר כקרח לכל באר של צלחת 24 באר ושיבש בעדינות מכנית את תמצית קרום המרתף / כיפת ECM על ידי pipetting למעלה ולמטה עם פיפטה p200 מינימום של 5x-6x.
    3. העבירו את תכולתן של ארבע בארות לצינור חרוטי של 15 מ"ל והוסיפו 8 מ"ל של EDTA/PBS קרים כקרח לצינור החרוטי. להעביר את 20 הבארות הנותרות באותו אופן.
    4. דגירה של צינורות חרוטיים של 15 מ"ל ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת על פלטפורמה מסתובבת או שייקר ב-330 סל"ד. לאחר הדגירה של שעה אחת, צנטריפוגה של צינורות חרוטיים ב 300 x גרם במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. יש להסיר ולהשליך את הסופר-נטנט מכל צינור.
    5. שלב ושטוף את כדורי התא עם 5 מ"ל של DMEM/F12 והפץ את תרחיף התא לשני צינורות חרוטיים של 15 מ"ל.
    6. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 x g במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופר-נאטנט והוסף 12 מ"ל של AFM לכל צינור, כדי להבטיח שכדורי התא יוחזרו לחיים.
    7. פיפטה 500 μL של ההשעיה האנטרואידית לתוך כל באר של שני לוחות חיבור נמוכים במיוחד 24 באר.
    8. לדגום את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2 במשך2-5 ימים או עד אנטרוידים יש קוטביות הפוכה.
    9. כדי לבדוק היפוך אנטרואידי, קבעו תחילה את הכתם האימונופלואורסצנטי המאשר ואת הזמן הממוצע להיפוך (~3 ימים), ולאחר מכן אשרו את היפוך הקוטביות באמצעות הדמיה בסיסית של מיקרוסקופ אור. אנטרוידים אפיקליים-חיצוניים הם בעלי מראה תאי מאוד, בעוד שאנטרוידים בזולטרליים-חיצוניים נשלטים לעתים קרובות על-ידי נוכחות של לומן מרכזי גדול או ניצנים (ראו איור משלים 1).
      הערה: לאחר שההליך עבר סטנדרטיזציה, יחס ההמרה ל- apical-out עולה בדרך כלל על 95%. השימוש באנטרוואידים אפיקליים-חיצוניים נועד לשמש כניסוי סופני, אם כי באופן תיאורטי ניתן להעביר אנטרואידים אפיקליים-החוצה למספר קטן של אנטרואידים בזולטרליים-החוצה.
  3. NEC-in-a-dish אפיקלי-אאוט
    הערה: לאחר שהאנטרוידים הפכו את הקוטביות, השתמש בתרביות בניסויים הבאים במהירות, מכיוון שאורך החיים שלהם בקונפורמציה אפיקלית לא אושר מעבר ל-3-4 ימים. עבור המודל הבא של NEC-in-a-dish, האנטרוידים טופלו במשך 24 שעות, ולאחר מכן נאספו מיד לאחר מכן ונשמרו לניסויים במורד הזרם.
    1. לאחר שהאנטרוידים הפכו חזותית את הקוטביות עם יעילות של 95% לפחות, הסר את הצלחות מהאינקובטור ואסוף שמונה בארות של צלחת 24 בארות לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל. מכיוון שהאנטרואידים האפיקליים נמצאים בהשעיה, פשוט הדביקו את התמיסה האנטרואידית/מדיה. צנטריפוגה צינור 15 מ"ל ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    2. לאחר שהתאים מופנים, הסר את הסופר-נאטנט ושלח מחדש את גלולת התא ב-4 מ"ל של AFM מעורבב עם הנפח הרצוי (10 μL כאן כדי להתאים לנפח הטיפול הגבוה ביותר שנוסף) של 1x PBS (בקרה).
    3. פיפטה 500 μL של מתלה enteroid / PBS / AFM לתוך שמונה בארות של צלחת חיבור נמוכה במיוחד 24 באר ודגירה של הצלחת ב 37 °C ו 5% CO2 במשך 24 שעות.
    4. חזור על שלבים 1.3.1.-1.3.3. לטיפולי TNF-α (20 ננוגרם/מ"ל ו-50 ננוגרם/מ"ל) ו-LPS (100 מיקרוגרם/מ"ל ו-200 מיקרוגרם/מ"ל) בנורמוקסיה. עבור כל טיפולי ההיפוקסיה, חזור על שלבים 1.3.1.-1.3.3., אך הנח את הצלחת באינקובטור נפרד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ו- 1% O2 למשך 24 שעות.
      הערה: שלב 1.3.4. ניתן לעשות זאת בו זמנית עם שלבים 1.3.1.-1.3.3, אבל, למען הבהירות, ההליך לעיל הופרד על ידי טיפול על מנת להפחית את המורכבות.

2. צביעה אימונופלואורסצנטית ומיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. הכנת תמיסות צביעה
    1. הכן 0.1% טריטון X-100 על ידי ערבוב 7 μL של טריטון X-100 ב 1x PBS לנפח סופי של 7 מ"ל. הכן PBST (PBS-Tween) על-ידי הוספת 30 μL של Tween-20 ל- 1x PBS לנפח סופי של 30 מ"ל.
    2. הכינו 10% סרום חמור רגיל (NDS)/PBST על ידי הוספת 700 μL של NDS ל-6.3 מ"ל של PBST. הכן 1% NDS/PBST על-ידי הוספת 70 μL של NDS ל-PBST לנפח סופי של 7 מ"ל.
      הערה: סרום חמורים שימש כאן כדי לתאם עם הנוגדן המשני המארח. עם זאת, מיני הסרום החוסם צריכים להתאים למיני הנוגדנים המשניים על מנת לחסום כראוי קשירה לא ספציפית.
  2. מכתים (יום 1)
    1. העבר את התוכן של ארבע בארות של צלחת 24 באר לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. יש לחזור על הפעולה לכל הבארות/טיפולים הרצויים, כאשר כל טיפול נמצא בצינור נפרד. צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x גרם במשך 4 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר שהאנטרואידים הם כדוריות, להסיר את supernatant.
    2. השהה את כדורי התא ב-300 μL של 4% פורמלדהיד מקובע למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לאחר 30 דקות, צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x גרם במשך 4 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, להסיר את supernatant, ולשטוף את הכדור עם 500 μL של סטרילי, RT 1x PBS.
    3. צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x גרם במשך 4 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסירו את הסופר-נטנט והוסיפו 500 מיקרון של 0.1% טריטון X-100, והניחו למשך שעה אחת ב-RT.
    4. לאחר שעה אחת, צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x גרם במשך 4 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. יש לשטוף עם 500 μL של 1x PBS ולהניח את הצינורות על מסובב או שייקר ב 200 סל"ד במשך 15 דקות ב 2-8 מעלות צלזיוס. חזור על זה בסך הכל 4x.
    5. צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x גרם במשך 4 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. יש להוסיף 500 μL של 10% NDS/PBST ולדגור ב-RT למשך 45 דקות. במהלך הדגירה, הכינו פתרונות נוגדנים ראשוניים על ידי שילוב של 20 μL של נוגדן רקומביננטי נגד ווילין, 10 μL של נוגדן E-cadherin, ו-1970 μL של 1% NDS/PBST עבור שמונה בארות של צלחת 24 בארות.
    6. לאחר הדגירה של 45 דקות, צנטריפוגה של הצינורות ב 300 x g במשך 4 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מניחים את הצינורות על קרח. הסר את supernatant והחלף עם 250 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית. לדגור את הצינורות בלילה ב 2-8 מעלות צלזיוס.
  3. מכתים (יום 2)
    1. צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x גרם במשך 4 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. מוסיפים 250-500 μL של PBST לכל צינור, בהתאם לגודל הכדור, ומניחים על המסובב או השייקר ב 200 סל"ד למשך שעה אחת ב 2-8 מעלות צלזיוס. חזור על שטיפת PBST 4x.
    2. הכן תמיסת נוגדנים משנית על ידי הוספת 52 μL של חמור Cy3 נגד ארנב IgG (H + L) ל 50% גליצרול ו 5.2 μL של חמור נגד עכבר נוגדנים פלואורסצנטיים ירוקים 488 נוגדנים משניים ל 5142.8 μL של 1% NDS / PBST.
    3. לאחר שטיפת ה-PBST והצנטריפוגה האחרונה, הסר את הסופרנטנט מהצינורות. יש לחלק 200 μL של תמיסת נוגדנים משנית לכל צינור ולדגור בחושך למשך הלילה בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.
  4. הרכבה של אנטרואידים אפיקליים מוכתמים (יום 1)
    1. יש להביא ל-RT חומר מבוסס גליצרול המכיל צבע גרעיני כחול למשך שעה אחת.
    2. צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x גרם במשך 4 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר 100 μL של supernatant ו resudate את התאים ב~ 100 μL הנותרים של supernatant. העבר את השעיית התא לצינורות 0.5 מ"ל.
    3. צנטריפוגה את הצינורות בצנטריפוגה מיני במשך 20 שניות כדי לזרוק את התאים. הסר את הסופרנטנט והושיע מחדש את כדורי התא ב-100 μL של כתם חומצת גרעין אדומה רחוקה. דגירה של הצינורות ב- RT למשך 10 דקות.
    4. צנטריפוגה את הצינורות בצנטריפוגה מיני במשך 20 שניות כדי לזרוק את התאים. הסר את הסופרנטנט ושלח מחדש את כדורי התא ב-100 μL של 1x PBS. יש לחזור על הפעולה לשטיפה שנייה.
    5. צנטריפוגה את הצינורות בצנטריפוגה מיני במשך 20 שניות כדי לזרוק את התאים ולהסיר 70 μL של supernatant. יש להשעות את התאים בנפח הנותר של PBS ולהעביר את התוכן לכיסוי מסומן (24 מ"מ x 60 מ"מ).
    6. יש למרוח 75 μL של mountant ישירות על הדגימה ולהסיר את כל הבועות עם קצה פיפטה. אפשרו לכיסויים להירפא למשך הלילה (18-24 שעות) ב-RT בחושך.
  5. הרכבת אנטרואידים אפיקליים מוכתמים (יום 2)
    1. לאחר הריפוי למשך הלילה, יש למרוח שכבה דקה (~15 μL) של גליצרול על הכיסויים. הרכיבו את הכיסוי על מגלשת הזכוכית ולחצו בעדינות למקומו. הקש כדי להסיר בועות בין הכיסוי לשקופית.
    2. אפשרו לכיסוי להתקבע ב-RT בחושך למשך שעתיים לפחות, לפני ההדמיה בהגדלה של פי 20 באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. להדמיה מיקרוסקופית של אנטרוידים באמצעות שיטות רכישה קונפוקליות שונות, עיין Lallemant et al.37.
  6. כימות אימונופלואורסצנטי
    הערה: שיטה זו קובעת את סך הפלואורסצנטיות המתוקנת על-ידי הסרת אות הרקע באמצעות תוכנת ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).
    1. פתחו את התמונות הקונפוקליות ב- ImageJ וקוו את האזור הרצוי בעזרת הכלי אזור עניין (ROI).
    2. הגדר פרמטרים המוגדרים על-ידי המשתמש על-ידי ניווט אל נתח > הגדר מדידות. בחר אזור > צפיפות משולבת > ערך אפור ממוצע תחת הכרטיסיה הגדרות.
    3. נווט כדי לנתח > למדוד. יופיע חלון נפתח הכולל את המידות. העתק והדבק מדידות אלה בגיליון אלקטרוני.
    4. להפחתת אות הרקע, בחרו אזור קטן שאינו פלואורסצנטי בתמונה. נווט אל נתח > מדידה עבור אזור זה. יופיע חלון נפתח הכולל את המידות. העתק והדבק את הפלט בגיליון אלקטרוני.
    5. הכפל את שטח התא שנבחר בפלואורסצנטיות הממוצעת של קריאות רקע, והפחת את הסכום מהצפיפות המשולבת כדי לחשב את סך הפלואורסצנטיות של התא המתוקן (CTCF). חזור על השלבים לעיל עבור כל התמונות המעניינות, תוך שמירה על רשומות בגיליון אלקטרוני או בחבילת תוכנה סטטיסטית (ראה טבלת חומרים).

3. כדאיות תא NEC-in-a-צלחת Apical-out

  1. טיפולים אנטרואידים
    1. צור מודל NEC-in-a-dish במשך 24 שעות, כמו בשלב 1.
    2. הפשרת ריאגנט בדיקת כדאיות התא למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. ביום הבדיקה, הביאו את המגיב ל-RT 30 דקות לפני השימוש. הפוך את המגיב כדי לערבב.
    3. לפני ביצוע הבדיקה, הסר 100 μL של מדיה מכל באר, והשאיר את 400 μL הנותרים. הוסף 400 μL של ריאגנט בדיקת כדאיות התא לכל באר.
    4. ערבבו היטב את התוכן על שייקר צלחת ב-RT למשך 5 דקות ב-200 סל"ד כדי לגרום לתזה של התאים. לאחר הטלטול, דגרו את הצלחת ב-RT למשך 25 דקות נוספות.
    5. לאחר דגירה של 25 דקות, מערבבים את התוכן של באר אחת באמצעות פיפטינג ומעבירים 200 μL של 800 μL לבאר אחת של 96 בארות, אטום, פוליסטירן, צלחת תחתית ברורה. חזור על 600 μL הנותרים, יצירת ארבעה שכפולים טכניים לכל באר. מעבירים את התכולה הנותרת של כל באר של צלחת 24 בארות לצלחת של 96 בארות באופן זה.
    6. באמצעות קורא צלחות המסוגל להזיז, רשום ערכים באינטגרציה של 0.25 אלפיות השנייה והשווה את הערכים היחסיים בין הטיפולים. לחלופין, יש להשוות את רמת הלומינסנציה של הטיפול לתקן אדנוזין טריפוספט (ATP).

תוצאות

השימוש באנטרוואידים כדי לדגום דלקת מעיים, אפילו בהקשר של דלקת אנטרוקוליטיס נמקית, נפוץ כיום. עם זאת, רוב השיטות המשמשות כיום חסרות גישה לפני השטח האפיקליים של אנטרואידים, מה ששולל את הרלוונטיות הפיזיולוגית של תרכובות המיועדות לשימוש בסופו של דבר כטיפולים אוראליים, או שהן קשות מבחינה טכני?...

Discussion

הפיתוח האחרון של מודלים אנטרואידיים הנגזרים מקריפטות אפיתל מעיים מאפשר רקמה חוץ-גופית רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית שבה ניתן לחקור פתוגנזה אנטרוקוליטיס נמקית. למרות הכללת כל סוגי התאים הממוינים העיקריים של אפיתל המעי, אנטרואידים תלת-ממדיים עדיין כפופים למספר מגבלות משמעותיות. ה?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף ואין להם ניגודי עניינים.

Acknowledgements

תוכן זה הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. HC נתמך על ידי מענק P20GM134973 מהמכונים הלאומיים לבריאות. KB נתמך על ידי מענק של קרן בית החולים לילדים (CHF) וקרן הבריאות הפרסביטריאנית (PHF). אנו מודים למעבדה לביולוגיה מולקולרית ומחקר ציטומטריה ב- OUHSC על השימוש במתקן הליבה, שסיפק הדמיה קונפוקלית.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA, pH 8.0Fisher Scientific15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubesFisher Scientific05-408-129
15 mL Conical tubeVWR89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability AssayPromegaG9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well MicroplatesFisher Scientific07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mmThermo Scientific102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo ScientificA-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugateSigma-AldrichAP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES bufferSTEMCELL Technologies36254
E-cadherin antibody (7H12)Novus BiologicalsNBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9Millipore Sigma1004960700
GlycerolSigma-Aldrich56-81-5
ImageJFijiN/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)STEMCELL Technologies06010
Leica SP8 Confocal MicroscopeLeica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatographyMillipore SigmaL3012-10MG
Microscope SlidesFisher Scientific12-544-7
Normal Donkey SerumSigma-Aldrich566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom MicroplateThermo Scientific136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4Corning21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlueFisher ScientificP36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]Abcamab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µgBio-Techne210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate ReaderMolecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184LFisher Scientific3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661)Thermo ScientificT3605
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat capThermo ScientificAB0350
Tween-20Sigma-Aldrich9005-64-5

References

  1. Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: an immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  3. Bazacliu, C., Neu, J. Necrotizing enterocolitis: long term complications. Current Pediatric Reviews. 15 (2), 115-124 (2019).
  4. Lim, J. C., Golden, J. M., Ford, H. R. Pathogenesis of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatric Surgery International. 31 (6), 509-518 (2015).
  5. Neu, J. Necrotizing enterocolitis: the future. Neonatology. 117 (2), 240-244 (2020).
  6. Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
  7. Emami, C. N., Mittal, R., Wang, L., Ford, H. R., Prasadarao, N. V. Recruitment of dendritic cells is responsible for intestinal epithelial damage in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by Cronobacter sakazakii. Journal of Immunology. 186 (12), 7067-7079 (2011).
  8. Chen, L., et al. Human β-defensin-3 reduces excessive autophagy in intestinal epithelial cells and in experimental necrotizing enterocolitis. Scientific Reports. 9 (1), 19890 (2019).
  9. De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
  10. Gimeno-Alcañiz, J. V., Collado, M. C. Impact of human milk on the transcriptomic response of fetal intestinal epithelial cells reveals expression changes of immune-related genes. Food & Function. 10 (1), 140-150 (2019).
  11. Claud, E. C., Savidge, T., Walker, W. A. Modulation of human intestinal epithelial cell IL-8 secretion by human milk factors. Pediatric Research. 53 (3), 419-425 (2003).
  12. De Plaen, I. G. Inflammatory signaling in necrotizing enterocolitis. Clinics in Perinatology. 40 (1), 109-124 (2013).
  13. Subramanian, S., Geng, H., Tan, X. D. Cell death of intestinal epithelial cells in intestinal diseases. Sheng Li Xue Ba : [Acta Physiologica Sinica]. 72 (3), 308-324 (2020).
  14. Li, B., et al. Intestinal epithelial cell injury is rescued by hydrogen sulfide. Journal of Pediatric Surgery. 51 (5), 775-778 (2016).
  15. Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum reduces apoptosis in the intestinal epithelium in necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (5), 1118-1127 (2010).
  16. Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology - a review of methods. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
  17. Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (12), 1359-1363 (2012).
  18. Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of helicobacter pylori. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (105), e53359 (2015).
  19. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  20. Williamson, I. A., et al. A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
  21. Moorefield, E. C., Blue, R. E., Quinney, N. L., Gentzsch, M., Ding, S. Generation of renewable mouse intestinal epithelial cell monolayers and organoids for functional analyses. BMC Cell Biology. 19 (1), 15 (2018).
  22. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  23. Werts, A. D., et al. A novel role for necroptosis in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 403-423 (2020).
  24. Li, B., et al. Intestinal epithelial tight junctions and permeability can be rescued through the regulation of endoplasmic reticulum stress by amniotic fluid stem cells during necrotizing enterocolitis. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 35 (1), 21265 (2021).
  25. Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. JoVE:Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
  26. Senger, S., et al. Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
  27. Li, B., et al. Activation of Wnt signaling by amniotic fluid stem cell-derived extracellular vesicles attenuates intestinal injury in experimental necrotizing enterocolitis. Cell Death & Disease. 11 (9), 750 (2020).
  28. Beaurivage, C., et al. Development of a human primary gut-on-a-chip to model inflammatory processes. Scientific Reports. 10 (1), 21475 (2020).
  29. Jeon, M. S., et al. Contributions of the microbiome to intestinal inflammation in a gut-on-a-chip. Nano Convergence. 9 (1), 8 (2022).
  30. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
  31. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
  32. Co, J. Y., Margalef-Català, M., Monack, D. M., Amieva, M. R. Controlling the polarity of human gastrointestinal organoids to investigate epithelial biology and infectious diseases. Nature Protocols. 16 (11), 5171-5192 (2021).
  33. Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).
  34. Li, B., et al. Neonatal intestinal organoids as an ex vivo approach to study early intestinal epithelial disorders. Pediatric Surgery International. 35 (1), 3-7 (2019).
  35. Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue. Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).
  36. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (97), e52483 (2015).
  37. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
  38. Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
  39. Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372 (2020).
  40. Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
  41. Schneider, M. R., et al. A key role for E-cadherin in intestinal homeostasis and Paneth cell maturation. PLoS One. 5 (12), 14325 (2010).
  42. Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum improves intestinal integrity in a rat model of necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (5), 940-949 (2009).
  43. Khailova, L., et al. Changes in hepatic cell junctions structure during experimental necrotizing enterocolitis: effect of EGF treatment. Pediatric Research. 66 (2), 140-144 (2009).
  44. Ravisankar, S., et al. Necrotizing enterocolitis leads to disruption of tight junctions and increase in gut permeability in a mouse model. BMC Pediatrics. 18 (1), 372 (2018).
  45. Han, X., et al. Creating a more perfect union: modeling intestinal bacteria-epithelial interactions using organoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 769-782 (2021).
  46. Joo, S. S., et al. Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study. Animals: An Open Access Journal from MDPI. 12 (3), 372 (2022).
  47. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocols. 2 (4), 100951 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved