In vitro Modèle entéroïde apical-out de l’entérocolite nécrosante

Résumé

Ce protocole décrit un modèle apico-out d’entérocolite nécrosante (ECN) dans une boîte utilisant des entéroïdes intestinaux grêles à polarité inversée, permettant l’accès à la surface apicale. Nous fournissons un protocole de coloration immunofluorescente pour détecter la perturbation épithéliale liée à l’ECN et une méthode pour déterminer la viabilité des entéroïdes à sortie apicale soumis au protocole NEC-in-a-dish.

Résumé

L’entérocolite nécrosante (ECN) est une maladie dévastatrice qui touche les nouveau-nés prématurés, caractérisée par une inflammation intestinale et une nécrose. Les entéroïdes sont récemment apparus comme un système prometteur pour modéliser les pathologies gastro-intestinales. Cependant, les méthodes actuellement utilisées pour la manipulation entéroïde n’ont pas accès à la surface apicale de l’épithélium (tridimensionnel [3D]) ou sont longues et gourmandes en ressources (monocouches bidimensionnelles [2D]). Ces méthodes nécessitent souvent des étapes supplémentaires, telles que la micro-injection, pour que le modèle devienne physiologiquement transposable. Ici, nous décrivons un protocole physiologiquement pertinent et peu coûteux pour étudier l’ECN in vitro en inversant la polarité entéroïde, ce qui donne à la surface apicale tournée vers l’extérieur (apical-out). Un protocole de coloration immunofluorescente pour examiner l’intégrité de la barrière entéroïde et l’expression des protéines jonctionnelles après une exposition au facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) ou au lipopolysaccharide (LPS) dans des conditions normoxiques ou hypoxiques est également fourni. La viabilité des entéroïdes 3D exposés au LPS normoxique ou hypoxique ou au TNF-α pendant 24 heures est également évaluée. Les entéroïdes exposés au LPS ou au TNF-α, en combinaison avec l’hypoxie, présentaient une perturbation de l’architecture épithéliale, une perte de l’expression de la protéine de jonction adhérente et une réduction de la viabilité cellulaire. Ce protocole décrit un nouveau modèle d’ECN dans une boîte qui présente une plate-forme physiologiquement pertinente et rentable pour identifier les cibles épithéliales potentielles pour les thérapies NEC et étudier la réponse intestinale prématurée aux traitements.

Introduction

L’entérocolite nécrosante (ECN), une maladie inflammatoire grave de l’intestin grêle survenant chez jusqu’à 10 % des nouveau-nés prématurés, est généralement associée à une morbidité et une mortalité élevées ^1,2. Les taux de mortalité approchant les 50% chez les nourrissons de très faible poids de naissance (<1500 g), nécessitant une intervention chirurgicale, ne sont pas rares³. Bien que l’étiologie exacte de l’ECN ne soit pas actuellement comprise, on pense que les facteurs de risque, tels que l’alimentation au lait maternisé, s’ajoutent à des anomalies physiologiques, telles que la dysbiose, un épithélium intestinal immature et une barrière intestinale dysfonctionnelle, dans le développement de la maladie ^2,4. Malgré des efforts importants, peu de progrès ont été réalisés dans la prévention ou le traitement de l’ECN au cours de la dernière décennie⁵. Une nouvelle méthode in vitro pour étudier l’ECN et le dysfonctionnement de la barrière épithéliale intestinale associée est nécessaire pour faire progresser la compréhension de la pathogenèse de la maladie, car les résultats des modèles animaux ont, jusqu’à présent, mal transposé au chevet du patient⁶.

Un certain nombre de modèles in vitro ont été utilisés pour étudier les mécanismes en jeu pendant l’ECN. La lignée cellulaire épithéliale intestinale humaine, Caco-2, est parmi les modèles in vitro les plus couramment utilisés de NEC ^7,8. Les cellules Caco-2 émulent les caractéristiques morphologiques de l’intestin grêle, mais, en tant que lignée cellulaire, ne se différencient pas dans la grande variété de types de cellules in vivo, y compris les cellules caliciformes productrices de mucus, nécessaires pour un modèle hautement traduisible. HT-29-MTX, cellules d’adénocarcinome du côlon humain, comprennent un phénotype mixte d’entérocyte et de cellules caliciformes, mais manquent encore de types cellulaires à base de cryptes de l’épithélium intestinal⁹. IEC-6 et IEC-18 sont des lignées cellulaires non transformées avec une morphologie immature semblable à une crypte iléale mais ne sont pas dérivées de tissus humains, ce qui limite leur capacité de traduction. Les lignées cellulaires intestinales FHs 74-Int et H4 sont dérivées de tissus fœtaux humains et ne forment pas de jonctions serrées ou de monocouches polarisées^10,11, et sont donc immatures par rapport aux nourrissons les plus prématurés sensibles à l’ECN. En règle générale, les modèles in vitro d’ECN utilisent des traitements lipopolysaccharidiques (LPS) pour induire le récepteur 4 de type Toll (TLR4), un récepteur majeur initiant l’inflammation intestinale dans NEC¹². Les dommages induits par le traitement des espèces réactives de l’oxygène (ROS), généralement par le peroxyde d’hydrogène, sont souvent utilisés pour induire des dommages oxydatifs de type NEC et l’apoptose^13,14. En tant que principal moteur de l’inflammation intestinale, le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α), un composant en aval de la signalisation inflammatoire TLR4, est également couramment utilisé dans ces modèles in vitro pour imiter la pathogenèse in vivo ¹⁵.

Les organoïdes, générés à partir de cellules souches pluripotentes inductibles (CSPi), ont gagné en popularité en tant que modèle in vitro de l’intestin en raison de leur capacité à récapituler l’architecture complexe in vivo et la composition de type cellulaire du tissu dont ils sont dérivés^16,17. Un système in vitro apparenté, les entéroïdes, sont des organoïdes dérivés de cryptes intestinales réséquées qui sont plus faciles à établir et à maintenir que les organoïdes dérivés de CSPi. Les entéroïdes sont généralement cultivés dans une matrice extracellulaire (ECM) tridimensionnelle (3D) avec un accès expérimental limité à la surface cellulaire basolatérale. Des méthodes, telles que la microinjection^18,19, ont été développées pour surmonter cette barrière à la surface apicale^, mais l’accumulation de débris cellulaires et de mucus dans la lumière rend la micro-injection à la fois techniquement difficile et incohérente. Comme les plates-formes de micro-injection robotique personnalisées ne sont pas largement accessibles²⁰, la variabilité de la capacité technique et de la technique générale d’un laboratoire à l’autre devient une variable importante à surmonter avec les protocoles de micro-injection. Les monocouches bidimensionnelles (2D) dérivées d’entéroïdes 3D dissociés, comprenant encore tous les principaux types cellulaires de l’épithélium intestinal, permettent d’accéder à la surface apicale mais ont toujours été difficiles à maintenir sans couche nourricière de myofibroblastes mésenchymateux²¹. Alors que des supports perméables à la culture cellulaire peuvent être utilisés pour accéder aux côtés apical et basolatéral des monocouches entéroïdes sans utiliser de myofibroblastes sous-jacents, ces inserts nécessitent l’excision et le montage de la membrane avant utilisation avec des modalités telles que la microscopie confocale, ce qui entraîne un processus plus exigeant et plus difficile sur le plan technique lors de l’utilisation de méthodes de microscopie traditionnelles²². NEC a été modélisé in vitro en utilisant des entéroïdes 3D traditionnels 23,24,25 et des supports perméables 26,27, et l’inflammation intestinale a récemment été reproduite avec des modèles intestin-sur-puce ^28,29. Bien que les modèles gut-on-a-chip intégrant la microfluidique soient, de loin, les modèles les plus avancés et les plus traduisibles, cette technologie est coûteuse, complexe et inaccessible à la plupart des chercheurs³⁰.

Les progrès récents dans les techniques d’entéroïdes apicals ont permis un accès plus facile à la surface apicale des entéroïdes 3D sans risquer d’endommager l’intégrité structurelle de l’épithélium in vitro ^31,32,33. Les entéroïdes à sortie apicale partagent la composition de type cellulaire et la fonction barrière de l’épithélium intestinal in vivo, mais, contrairement aux entéroïdes 3D typiques, les surfaces apicales de ces cellules font face au milieu de culture, ce qui permet des études plus pertinentes sur le plan physiologique sur l’absorption des nutriments, l’infection microbienne et la sécrétion luminale³¹. Un avantage supplémentaire des entéroïdes à élimination apicale est la capacité de distribuer de manière homogène des agents expérimentaux aux entéroïdes. Il n’est pas nécessaire de faire varier les volumes de traitement en fonction de la taille des entéroïdes, comme c’est le cas avec la micro-injection, et la capacité de maintenir ces entéroïdes en culture en suspension annule toute interférence ECM sur la diffusion expérimentale de l’agent³².

L’entérocolite nécrosante est une maladie multifactorielle impliquant plusieurs types de cellules épithéliales intestinales et divers facteurs environnementaux et physiopathologiques³⁴. La composition cellulaire variée des entéroïdes intestinaux est une nette amélioration par rapport aux monocultures dans la modélisation d’une maladie complexe telle que l’ECN. Il est intéressant de noter que, alors qu’une seule exposition inflammatoire est souvent suffisante pour induire des dommages dans les monocultures in vitro , les entéroïdes, comme avec les modèles murins²³, semblent nécessiter au moins deux composants inflammatoires pour induire des dommages de type NEC⁶. Ici, nous présentons un modèle de NEC-in-a-dish apical-out, utilisant des entéroïdes apical-out en combinaison avec l’hypoxie (une caractéristique clinique importante de NEC⁶) et le LPS ou le TNF-α, comme un modèle in vitro amélioré et physiologiquement plus pertinent pour étudier les réponses épithéliales à l’inflammation de type NEC et, potentiellement, identifier des cibles thérapeutiques. Nous décrivons un protocole pour inverser la polarité des entéroïdes 3D de l’intestin grêle, ainsi qu’un protocole de coloration immunofluorescente pour identifier la perturbation de la barrière épithéliale et les altérations de l’expression des protéines jonctionnelles. Enfin, nous démontrons en outre un test de viabilité entéroïde simple pour déterminer l’impact de notre modèle NEC-in-a-dish à double coup et à sortie apicale.

Protocole

Toutes les procédures animales de cette étude ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Centre des sciences de la santé de l’Université de l’Oklahoma. Des échantillons de commodité de l’intestin grêle provenant d’un primate non humain prématuré (PSN, gestation à 90%, babouin olive, Papio anubis) ont été obtenus après euthanasie pour une étude distincte (Protocole #101523-16-039-I).

1. Mise en place d’un modèle d’entéroïde à l’apocale NEC dans une boîte

1. Préparation des milieux et des traitements entéroïdes
   REMARQUE: Une fois préparé selon la technique aseptique standard, le support peut être conservé à 4 ° C jusqu’à 1 semaine.
   1. Préparer des milieux sans antibiotiques (AFM) en mélangeant 50 mL de milieux de croissance organoïdes humains avec 50 mL de supplément organoïde (voir le tableau des matières). Préparer 5 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique/1x de solution saline tamponnée au phosphate (EDTA/PBS) en ajoutant 100 μL d’EDTA 0,5 M à 9 900 μL de PBS.
   2. Refroidir le mélange de jambon d’aigle modifié de Dulbecco F12 + 15 mM HEPES Buffer (DMEM/F12) à 2-8 °C.
   3. Préparer la solution mère de α TNF en mettant en suspension 100 μg de poudre de α TNF dans 1 mL de 1x PBS. Diluer davantage le stock de TNF-α à des concentrations de 20 ng/mL et 50 ng/mL en utilisant l’AFM comme solvant. Préparer la solution mère de LPS en suspendant 2 mg de LPS dans 1 mL de 1x PBS. Diluer davantage le LPS mère à 100 μg/mL et 200 μg/mL en utilisant l’AFM comme solvant.
2. Inverser la polarité des entéroïdes 3D
   REMARQUE : La procédure suivante est destinée à l’inversion d’une seule plaque de culture tissulaire à fond plat de 24 puits en deux plaques de culture tissulaire à très faible fixation à 24 puits. Les plaques de culture tissulaire doivent être chauffées à 37 °C pendant au moins 30 minutes avant utilisation. La dérivation d’entéroïdes 3D basolatéraux-out a été réalisée comme décrit précédemment par de nombreux groupes^35,36, avec de légères modifications pour les milieux (détaillé ci-dessus). La procédure générale de dérivation entéroïde ne diffère pas de celle des humains. En bref, les tissus excisés sont lavés, coupés en petits fragments et incubés dans un tampon de perturbation cellulaire. La solution cellulaire est ensuite passée à travers une crépine cellulaire de 70 μM, ce qui donne des cryptes qui sont plaquées à une densité élevée.
   1. Aspirer les milieux de chaque puits d’une plaque de 24 puits d’entéroïdes basolatéraux-out 3D établis.
   2. Ajouter 500 μL d’EDTA/PBS glacé de 5 mM à chaque puits de la plaque de 24 puits et perturber mécaniquement doucement l’extrait de membrane basale / dôme ECM en pipetant de haut en bas avec une pipette p200 d’au moins 5x-6x.
   3. Transférer le contenu de quatre puits dans un tube conique de 15 ml et ajouter 8 mL d’EDTA/PBS glacé dans le tube conique. Transférer les 20 puits restants de la même manière.
   4. Incuber des tubes coniques de 15 mL à 4 °C pendant 1 h sur une plate-forme rotative ou un agitateur à 330 tr/min. Après 1 h d’incubation, centrifuger les tubes coniques à 300 x g pendant 3 min à 4 °C. Retirer et jeter le surnageant de chaque tube.
   5. Combiner et laver les granulés de cellule avec 5 ml de DMEM/F12 et répartir la suspension cellulaire dans deux tubes coniques de 15 mL.
   6. Enduire les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 3 min à 4 °C. Retirez le surnageant et ajoutez 12 ml d’AFM à chaque tube, en veillant à ce que les pastilles de la cellule soient remises en suspension.
   7. Pipeter 500 μL de la suspension entéroïde dans chaque puits de deux plaques de fixation ultra-basses de 24 puits.
   8. Incuber les plaques à 37 °C et 5% de CO 2 pendant₂ à 5 jours ou jusqu’à ce que les entéroïdes aient inversé la polarité.
   9. Pour vérifier l’inversion entéroïde, établissez d’abord la coloration immunofluorescente de confirmation et le délai moyen d’inversion (~ 3 jours), puis confirmez l’inversion de polarité à l’aide d’une visualisation de base au microscope optique. Les entéroïdes de sortie apicole sont très cellulaires en apparence, tandis que les entéroïdes de sortie basolatérale sont souvent dominés par la présence d’une grande lumière centrale ou bourgeonnement (voir la figure supplémentaire 1).
      REMARQUE: Une fois la procédure normalisée, le taux de conversion en apical-out dépasse généralement 95%. L’utilisation d’entéroïdes à sortie apicale est conçue comme une expérience terminale, bien qu’il soit théoriquement possible de faire passer des entéroïdes à sortie apicale dans un petit nombre d’entéroïdes à sortie basolatérale.
3. Apical-out NEC-in-a-dish
   REMARQUE: Une fois que les entéroïdes ont inversé la polarité, utilisez rapidement les cultures dans des expériences ultérieures, car leur longévité dans la conformation apicale n’a pas été confirmée au-delà de 3-4 jours. Pour le modèle NEC-in-dish suivant, les entéroïdes ont été traités pendant 24 heures, puis collectés immédiatement après et conservés pour des expériences en aval.
   1. Une fois que les entéroïdes ont visuellement inversé la polarité avec une efficacité d’au moins 95%, retirez les plaques de l’incubateur et recueillez huit puits d’une plaque de 24 puits dans un tube conique de 15 mL. Comme les entéroïdes à élimination apicale sont en suspension, il suffit de pipeter la solution entéroïde/média. Centrifuger le tube de 15 mL à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
   2. Une fois les cellules enrobées, retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 4 mL d’AFM mélangé au volume désiré (10 μL ici pour correspondre au volume de traitement le plus élevé ajouté) de 1x PBS (témoin).
   3. Pipeter 500 μL de suspension entéroïde/PBS/AFM dans huit puits d’une plaque de fixation ultra-basse de 24 puits et incuber la plaque à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 24 h.
   4. Répétez les étapes 1.3.1.-1.3.3. pour les traitements au TNF-α (20 ng/mL et 50 ng/mL) et au LPS (100 μg/mL et 200 μg/mL) à la normoxie. Pour tous les traitements contre l’hypoxie, répéter les étapes 1.3.1.-1.3.3., mais placer la plaque dans un incubateur séparé à 37 °C, 5 % de CO₂ et 1 % d’O2 pendant 24 h.
      NOTE: Étape 1.3.4. peut être effectuée simultanément avec les étapes 1.3.1.-1.3.3, mais, pour plus de clarté, la procédure ci-dessus a été séparée par traitement afin de réduire la complexité.

2. Coloration par immunofluorescence et microscopie confocale

1. Préparation de solutions de coloration
   1. Préparer le Triton X-100 à 0,1 % en mélangeant 7 μL de Triton X-100 dans 1 PBS jusqu’à obtenir un volume final de 7 mL. Préparer le PBST (PBS-Tween) en ajoutant 30 μL de Tween-20 à 1x PBS pour obtenir un volume final de 30 mL.
   2. Préparer 10 % de sérum normal d’âne (PDN)/PBST en ajoutant 700 μL de NDS à 6,3 mL de PBST. Préparer 1 % de PDN/PBST en ajoutant 70 μL de NDS au PBST jusqu’à un volume final de 7 mL.
      REMARQUE: Le sérum d’âne a été utilisé ici pour établir une corrélation avec l’hôte anticorps secondaire. Cependant, les espèces de sérum bloquant doivent correspondre aux espèces d’anticorps secondaires afin de bloquer correctement la liaison non spécifique.
2. Coloration (Jour 1)
   1. Transférer le contenu de quatre puits d’une plaque de 24 puits dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Répéter pour tous les puits/traitements souhaités, chaque traitement étant effectué dans un tube séparé. Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 4 min à 4 °C. Une fois les entéroïdes enrobés, retirez le surnageant.
   2. Resuspendre les pastilles de la cellule dans 300 μL de fixateur de formaldéhyde à 4% pendant 30 min à température ambiante (RT). Après 30 min, centrifuger les tubes à 300 x g pendant 4 min à 4 °C, retirer le surnageant et laver la pastille avec 500 μL de RT 1x PBS stérile.
   3. Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 4 min à 4 °C. Retirer le surnageant et ajouter 500 μL de Triton X-100 à 0,1%, et laisser reposer pendant 1 h à TA.
   4. Après 1 h, centrifuger les tubes à 300 x g pendant 4 min à 4 °C et retirer le surnageant. Laver avec 500 μL de 1x PBS et placer les tubes sur un rotateur ou un agitateur à 200 tr/min pendant 15 min à 2-8 °C. Répétez cette opération un total de 4x.
   5. Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 4 min à 4 °C et retirer le surnageant. Ajouter 500 μL de NDS/PBST à 10 % et incuber à TA pendant 45 min. Pendant l’incubation, préparer des solutions d’anticorps primaires en combinant 20 μL d’anticorps anti-villosités recombinants, 10 μL d’anticorps E-cadhérine et 1970 μL de NDS/PBST à 1 % pour huit puits d’une plaque de 24 puits.
   6. Après 45 min d’incubation, centrifuger les tubes à 300 x g pendant 4 min à 4 °C. Placez les tubes sur de la glace. Retirer le surnageant et le remplacer par 250 μL de solution d’anticorps primaires. Incuber les tubes pendant une nuit à 2-8 °C.
3. Coloration (Jour 2)
   1. Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 4 min à 4 °C et retirer le surnageant. Ajouter 250-500 μL de PBST à chaque tube, selon la taille de la pastille, et placer sur le rotateur ou l’agitateur à 200 tr/min pendant 1 h à 2-8 °C. Répétez le lavage PBST 4x.
   2. Préparer la solution d’anticorps secondaires en ajoutant 52 μL d’IgG anti-lapin Cy3 (H + L) à 50% de glycérol et 5,2 μL d’âne anti-souris vert fluorescent 488 anticorps secondaires à 5142,8 μL de NDS/PBST à 1%.
   3. Après le dernier lavage et centrifugation PBST, retirer le surnageant des tubes. Distribuer 200 μL de solution d’anticorps secondaires à chaque tube et incuber dans l’obscurité pendant une nuit à 2-8 °C.
4. Montage d’entéroïdes apicals tachés (Jour 1)
   1. Apportez à TA un support à base de glycérol contenant un colorant nucléaire bleu pendant 1 h.
   2. Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 4 min à 4 °C. Retirer 100 μL du surnageant et remettre en suspension les cellules dans les ~100 μL restants du surnageant. Transférer la suspension cellulaire dans des tubes de 0,5 mL.
   3. Centrifuger les tubes dans une mini-centrifugeuse pendant 20 s pour granuler les cellules. Retirez le surnageant et remettez en suspension les pastilles cellulaires dans 100 μL de coloration d’acide nucléique rouge lointain. Incuber les tubes à TA pendant 10 min.
   4. Centrifuger les tubes dans une mini-centrifugeuse pendant 20 s pour granuler les cellules. Retirer le surnageant et remettre en suspension les pastilles de la cellule dans 100 μL de 1x PBS. Répétez pour un deuxième lavage.
   5. Centrifuger les tubes dans une mini-centrifugeuse pendant 20 s pour granuler les cellules et éliminer 70 μL du surnageant. Remettez en suspension les cellules dans le volume restant du PBS et transférez le contenu sur une feuille de couverture étiquetée (24 mm x 60 mm).
   6. Appliquez 75 μL de support directement sur l’échantillon et retirez les bulles à l’aide d’un embout de pipette. Laisser durcir les lames de couverture pendant la nuit (18-24 h) à RT dans l’obscurité.
5. Montage d’entéroïdes apicals tachés (Jour 2)
   1. Après séchage pendant la nuit, appliquez une fine couche (~ 15 μL) de glycérol sur les lames de couverture. Montez le couvercle sur la lame de verre et appuyez doucement en place. Appuyez pour supprimer les bulles entre le bordereau de couverture et la glissière.
   2. Laisser la lame-couverture durcir à RT dans l’obscurité pendant au moins 2 heures, avant d’imager à un grossissement de 20x avec un microscope confocal. Pour la visualisation microscopique des entéroïdes à l’aide de diverses méthodes d’acquisition confocale, se reporter à Lallemant et ^coll.37.
6. Quantification par immunofluorescence
   REMARQUE: Cette méthode détermine la fluorescence totale corrigée en supprimant le signal de fond à l’aide du logiciel ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).
   1. Ouvrez les images confocales dans ImageJ et délimitez la zone souhaitée avec l’outil de région d’intérêt (ROI).
   2. Définissez les paramètres définis par l’utilisateur en accédant à Analyser > Définir les mesures. Sélectionnez Zone > Densité intégrée > Valeur moyenne de gris sous l’onglet Paramètres.
   3. Naviguez jusqu’à Analyser > mesurer. Une fenêtre pop-up apparaîtra contenant les mesures. Copiez et collez ces mesures dans une feuille de calcul.
   4. Pour soustraire le signal d’arrière-plan, sélectionnez une petite zone non fluorescente de l’image. Accédez à Analyser > mesure pour cette région. Une fenêtre pop-up apparaîtra contenant les mesures. Copiez et collez la sortie dans une feuille de calcul.
   5. Multipliez la surface de la cellule sélectionnée par la fluorescence moyenne des lectures de fond et soustrayez la somme de la densité intégrée pour calculer la fluorescence totale corrigée des cellules (CTCF). Répétez les étapes ci-dessus pour toutes les images d’intérêt, tout en conservant les enregistrements dans une feuille de calcul ou un logiciel statistique (voir le tableau des matériaux).

3. Viabilité des cellules NEC-in-a-dish

1. Traitements entéroïdes
   1. Établir un modèle de NEC-in-dish apical-out pendant 24 h, comme à l’étape 1.
   2. Décongeler le réactif de dosage de viabilité cellulaire pendant une nuit à 4 °C. Le jour du dosage, porter le réactif à TA 30 min avant utilisation. Retourner le réactif pour mélanger.
   3. Avant d’effectuer l’essai, retirez 100 μL de milieu de chaque puits, en laissant les 400 μL restants. Ajouter 400 μL de réactif d’essai de viabilité cellulaire à chaque puits.
   4. Bien mélanger vigoureusement le contenu sur un agitateur à plaques à TA pendant 5 min à 200 tr/min pour induire la lyse cellulaire. Après agitation, incuber la plaque à TA pendant 25 minutes supplémentaires.
   5. Après 25 minutes d’incubation, mélanger le contenu d’un puits par pipetage et transférer 200 μL des 800 μL dans un seul puits d’une plaque opaque à fond clair en polystyrène opaque de 96 puits. Répéter pour les 600 μL restants, en créant quatre répétitions techniques par puits. Transférer ainsi le contenu restant de chaque puits de la plaque de 24 puits dans une plaque de 96 puits.
   6. À l’aide d’un lecteur de plaques capable de luminescence, enregistrez les valeurs à 0,25 ms d’intégration et comparez les valeurs relatives entre les traitements. Alternativement, comparez la luminescence de traitement à une norme d’adénosine triphosphate (ATP).

Résultats

L’utilisation d’entéroïdes pour modéliser l’inflammation intestinale, même dans le contexte d’une entérocolite nécrosante, est maintenant courante. Cependant, la plupart des méthodes actuellement utilisées soit n’ont pas accès à la surface apicale des entéroïdes, ce qui annule la pertinence physiologique des composés destinés à une utilisation éventuelle comme traitements oraux, soit sont techniquement difficiles et prennent beaucoup de temps, comme dans le cas des monocouches dérivées d’ent...

Discussion

Le développement récent de modèles entéroïdes dérivés de cryptes épithéliales intestinales permet d’obtenir un tissu in vitro plus pertinent sur le plan physiologique dans lequel étudier la pathogenèse de l’entérocolite nécrosante. Bien qu’ils incluent tous les principaux types de cellules différenciées de l’épithélium intestinal, les entéroïdes 3D sont toujours soumis à plusieurs limitations importantes. Les entéroïdes conventionnels à sortie basolatérale sont suspendus dans des ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0	Fisher Scientific	15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
15 mL Conical tube	VWR	89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates	Fisher Scientific	07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mm	Thermo Scientific	102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate	Sigma-Aldrich	AP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer	STEMCELL Technologies	36254
E-cadherin antibody (7H12)	Novus Biologicals	NBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Millipore Sigma	1004960700
Glycerol	Sigma-Aldrich	56-81-5
ImageJ	Fiji	N/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	STEMCELL Technologies	06010
Leica SP8 Confocal Microscope	Leica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography	Millipore Sigma	L3012-10MG
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-7
Normal Donkey Serum	Sigma-Aldrich	566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate	Thermo Scientific	136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4	Corning	21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Fisher Scientific	P36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]	Abcam	ab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg	Bio-Techne	210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L	Fisher Scientific	3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661)	Thermo Scientific	T3605
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat cap	Thermo Scientific	AB0350
Tween-20	Sigma-Aldrich	9005-64-5