In vitro Modello enteroide apical-out di enterocolite necrotizzante

Riepilogo

Questo protocollo descrive un modello di enterocolite necrotizzante apicale (NEC) in un piatto che utilizza enteroidi intestinali piccoli con polarità invertita, consentendo l'accesso alla superficie apicale. Forniamo un protocollo di colorazione immunofluorescente per rilevare l'interruzione epiteliale correlata al NEC e un metodo per determinare la vitalità degli enteroidi apicali-out sottoposti al protocollo NEC-in-a-dish.

Abstract

L'enterocolite necrotizzante (NEC) è una malattia devastante che colpisce i neonati pretermine, caratterizzata da infiammazione intestinale e necrosi. Gli enteroidi sono recentemente emersi come un sistema promettente per modellare le patologie gastrointestinali. Tuttavia, i metodi attualmente utilizzati per la manipolazione enteroide non hanno accesso alla superficie apicale dell'epitelio (tridimensionale [3D]) o richiedono molto tempo e risorse (monostrati bidimensionali [2D]). Questi metodi spesso richiedono passaggi aggiuntivi, come la microiniezione, affinché il modello diventi fisiologicamente traducibile. Qui, descriviamo un protocollo fisiologicamente rilevante e poco costoso per studiare NEC in vitro invertendo la polarità enteroide, con conseguente superficie apicale rivolta verso l'esterno (apical-out). Viene inoltre fornito un protocollo di colorazione immunofluorescente per esaminare l'integrità della barriera enteroide e l'espressione proteica giunzionale in seguito all'esposizione al fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) o al lipopolisaccaride (LPS) in condizioni normossiche o ipossiche. Viene inoltre valutata la vitalità di enteroidi 3D apical-out esposti a LPS normossici o ipossici o TNF-α per 24 ore. Gli enteroidi esposti a LPS o TNF-α, in combinazione con ipossia, hanno mostrato un'interruzione dell'architettura epiteliale, una perdita di espressione della proteina di giunzione aderente e una riduzione della vitalità cellulare. Questo protocollo descrive un nuovo modello apical-out NEC-in-a-dish che presenta una piattaforma fisiologicamente rilevante ed economica per identificare potenziali bersagli epiteliali per le terapie NEC e studiare la risposta intestinale pretermine alle terapie.

Introduzione

L'enterocolite necrotizzante (NEC), una grave malattia infiammatoria dell'intestino tenue che si verifica fino al 10% dei neonati pretermine, è comunemente associata ad elevata morbilità e mortalità ^1,2. I tassi di mortalità che si avvicinano al 50% nei neonati con peso alla nascita molto basso (<1500 g), che richiedono un intervento chirurgico, non sono rari³. Mentre l'esatta eziologia di NEC non è attualmente compresa, si ritiene che i fattori di rischio, come l'alimentazione artificiale, si aggravino con anomalie fisiologiche, come la disbiosi, un epitelio intestinale immaturo e una barriera intestinale disfunzionale, nello sviluppo della malattia ^2,4. Nonostante gli sforzi significativi, nell'ultimo decennio si sono verificati pochi progressi nella prevenzione o nel trattamento del NEC⁵. È necessario un nuovo metodo in vitro per studiare la NEC e la disfunzione della barriera epiteliale intestinale associata per far progredire la comprensione della patogenesi della malattia, poiché i risultati dei modelli animali hanno, finora, tradotto male al letto^{del paziente 6}.

Un certo numero di modelli in vitro sono stati utilizzati per studiare i meccanismi in gioco durante NEC. La linea cellulare epiteliale intestinale umana, Caco-2, è tra i modelli in vitro più comunemente utilizzati di NEC ^7,8. Le cellule Caco-2 emulano le caratteristiche morfologiche del bordo del pennello dell'intestino tenue, ma, come linea cellulare, non si differenziano nell'ampia varietà di tipi di cellule in vivo, comprese le cellule caliciformi che producono muco, richieste per un modello altamente traducibile. HT-29-MTX, cellule di adenocarcinoma del colon umano, includono un fenotipo misto di enterociti e cellule caliciformi, ma mancano ancora di tipi cellulari basati sulla cripta dell'epitelio intestinale⁹. IEC-6 e IEC-18 sono linee cellulari non trasformate con una morfologia immatura simile a una cripta ileale ma non derivano da tessuto umano, limitando la loro capacità traslazionale. Le linee cellulari intestinali FHs 74-Int e H4 derivano dal tessuto fetale umano e non formano giunzioni strette o monostrati polarizzati^10,11, e quindi sono immature rispetto anche ai neonati più prematuri suscettibili alla NEC. Tipicamente, i modelli in vitro NEC utilizzano trattamenti lipopolisaccaridici (LPS) per indurre il recettore toll-like 4 (TLR4), un recettore importante che avvia l'infiammazione intestinale in NEC¹². Il danno mediato attraverso il trattamento con specie reattive dell'ossigeno (ROS), tipicamente attraverso il perossido di idrogeno, è spesso usato per indurre danni ossidativi simili a NEC e apoptosi^13,14. Come principale motore dell'infiammazione intestinale, il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α), un componente a valle della segnalazione infiammatoria TLR4, è anche comunemente utilizzato in questi modelli in vitro per imitare la patogenesi in vivo ¹⁵.

Gli organoidi, generati da cellule staminali pluripotenti inducibili (iPSC), sono cresciuti in popolarità come modello in vitro dell'intestino grazie alla loro capacità di ricapitolare la complessa architettura in vivo e la composizione del tipo cellulare del tessuto da cui derivano^16,17. Un sistema in vitro correlato, gli enteroidi, sono organoidi derivati da cripte intestinali resecate che sono più facilmente stabiliti e mantenuti rispetto agli organoidi derivati da iPSC. Gli enteroidi sono tipicamente coltivati in una matrice extracellulare tridimensionale (3D) (ECM) con accesso sperimentale limitato alla superficie cellulare basolaterale. Metodi, come la microiniezione^18,19, sono stati sviluppati per superare questa barriera alla superficie apicale^, ma l'accumulo di detriti cellulari e muco all'interno del lume rende la microiniezione sia tecnicamente difficile che incoerente. Poiché le piattaforme di microiniezione robotizzata personalizzate non sono ampiamente accessibili²⁰, la variabilità da laboratorio a laboratorio nelle capacità tecniche e nella tecnica generale diventano variabili significative da superare con i protocolli di microiniezione. Monostrati bidimensionali (2D) derivati da enteroidi 3D dissociati, che comprendono ancora tutti i principali tipi di cellule dell'epitelio intestinale, consentono l'accesso alla superficie apicale ma sono stati tradizionalmente difficili da mantenere senza uno strato di alimentazione di miofibroblasti mesenchimali²¹. Mentre i supporti permeabili alla coltura cellulare possono essere utilizzati per accedere sia al lato apicale che basolaterale dei monostrati enteroidi senza l'uso di miofibroblasti sottostanti, questi inserti richiedono l'escissione e il montaggio della membrana prima dell'uso con modalità quali la microscopia confocale, risultando in un processo tecnicamente più impegnativo e difficile quando si utilizzano metodi di microscopia tradizionali²². NEC è stato modellato in vitro utilizzando enteroidi 3D tradizionali 23,24,25 e supporti permeabili 26,27, e l'infiammazione intestinale è stata recentemente replicata con modelli gut-on-a-chip ^28,29. Mentre i modelli gut-on-a-chip che incorporano la microfluidica sono, di gran lunga, i modelli più avanzati e traducibili, questa tecnologia è costosa, complessa e inaccessibile alla maggior parte dei ricercatori³⁰.

I recenti progressi nelle tecniche enteroidi apicali-out hanno permesso un accesso più facile alla superficie apicale degli enteroidi 3D senza rischiare di danneggiare l'integrità strutturale dell'epitelio in vitro ^31,32,33. Gli enteroidi apicali-out condividono la composizione del tipo di cellula e la funzione barriera dell'epitelio intestinale in vivo, ma, a differenza dei tipici enteroidi 3D, le superfici apicali di queste cellule sono rivolte verso il terreno di coltura, consentendo studi più fisiologicamente rilevanti sull'assorbimento dei nutrienti, l'infezione microbica e la secrezione luminale³¹. Un ulteriore vantaggio degli enteroidi apical-out è la capacità di distribuire omogeneamente agenti sperimentali agli enteroidi. Non è richiesta una variazione dei volumi di trattamento in base alle dimensioni degli enteroidi, come avviene con la microiniezione, e la capacità di mantenere questi enteroidi nella coltura in sospensione annulla qualsiasi interferenza ECM sulla diffusione dell'agente sperimentale³².

L'enterocolite necrotizzante è una malattia multifattoriale che coinvolge più tipi di cellule epiteliali intestinali e una varietà di fattori ambientali e fisiopatologici³⁴. La variegata composizione cellulare degli enteroidi intestinali è un netto miglioramento rispetto alle monocolture nella modellazione di una malattia complessa come la NEC. È interessante notare che, mentre una singola esposizione infiammatoria è spesso sufficiente per indurre danni in monocolture in vitro , gli enteroidi, come con i modelli murini²³, sembrano richiedere un minimo di due componenti infiammatori per indurre danni simili a NEC⁶. Qui, presentiamo un modello apical-out NEC-in-a-dish, utilizzando enteroidi apical-out in combinazione con ipossia (un'importante caratteristica clinica di NEC⁶) e LPS o TNF-α, come modello in vitro migliorato e più fisiologicamente rilevante per studiare le risposte epiteliali all'infiammazione simile a NEC e, potenzialmente, identificare bersagli terapeutici. Descriviamo un protocollo per invertire la polarità degli enteroidi 3D dell'intestino tenue, nonché un protocollo di colorazione immunofluorescente per identificare la rottura della barriera epiteliale e le alterazioni dell'espressione proteica giunzionale. Infine, dimostriamo ulteriormente un semplice saggio di vitalità enteroide per determinare l'impatto del nostro modello NEC-in-a-dish a doppio colpo.

Protocollo

Tutte le procedure animali in questo studio sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Centro di scienze della salute dell'Università dell'Oklahoma. Campioni di convenienza dell'intestino tenue da un primate pretermine non umano (NHP, 90% gestazione, babbuino olivastro, Papio anubis) sono stati ottenuti dopo l'eutanasia per uno studio separato (Protocollo #101523-16-039-I).

1. Istituzione del modello NEC-in-a-dish enteroide apical-out

1. Preparazione di trattamenti con mezzi e enteroidi
   NOTA: Una volta preparato seguendo la tecnica asettica standard, il supporto può essere conservato a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
   1. Preparare terreni privi di antibiotici (AFM) mescolando 50 ml di terreno di crescita organoide umano con 50 ml di integratore di organoidi (vedere Tabella dei materiali). Preparare 5 mM di acido etilendiamminotetraacetico/1x soluzione salina tamponata con fosfato (EDTA/PBS) aggiungendo 100 μL di 0,5 M EDTA a 9.900 μL di PBS.
   2. Chill Dulbecco modificato eagle's medium/nutrient Ham's mixture F12 + 15 mM HEPES Buffer (DMEM/F12) a 2-8 °C.
   3. Preparare la soluzione madre di TNF-α sospendendo 100 μg di polvere di TNF-α in 1 mL di 1x PBS. Diluire ulteriormente lo stock di TNF-α a concentrazioni di 20 ng/mL e 50 ng/mL utilizzando AFM come solvente. Preparare la soluzione madre di LPS sospendendo 2 mg di LPS in 1 mL di 1x PBS. Diluire ulteriormente LPS stock a 100 μg/mL e 200 μg/mL utilizzando AFM come solvente.
2. Invertire la polarità degli enteroidi 3D
   NOTA: La seguente procedura è destinata all'inversione di una singola piastra di coltura tissutale a fondo piatto a 24 pozzetti in due piastre di coltura tissutale a 24 pozzetti a bassissimo attacco. Le piastre di coltura tissutale devono essere riscaldate a 37 °C per almeno 30 minuti prima dell'uso. La derivazione di enteroidi 3D basolateral-out è stata ottenuta come descritto in precedenza da molti gruppi^35,36, con lievi modifiche per i mezzi (dettagliato sopra). La procedura generale di derivazione enteroide non differisce da quella umana. In breve, il tessuto asportato viene lavato, tagliato in piccoli frammenti e incubato nel tampone di distruzione cellulare. La soluzione cellulare viene quindi eseguita attraverso un filtro cellulare da 70 μM, risultando in cripte placcate ad alta densità.
   1. Aspirare i mezzi da ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti di enteroidi basolaterali 3D stabiliti.
   2. Aggiungere 500 μL di EDTA/PBS ghiacciato da 5 mM a ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti e interrompere meccanicamente delicatamente l'estratto della membrana basale / cupola ECM pipettando su e giù con una pipetta p200 almeno 5x-6x.
   3. Trasferire il contenuto di quattro pozzetti in un tubo conico da 15 ml e aggiungere 8 ml di EDTA/PBS ghiacciato al tubo conico. Trasferire i restanti 20 pozzi nello stesso modo.
   4. Incubare tubi conici da 15 mL a 4 °C per 1 h su piattaforma rotante o agitatore a 330 giri/min. Dopo 1 ora di incubazione, centrifugare i tubi conici a 300 x g per 3 minuti a 4 °C. Rimuovere e scartare il surnatante da ogni tubo.
   5. Unire e lavare i pellet cellulari con 5 ml di DMEM/F12 e distribuire la sospensione cellulare in due tubi conici da 15 ml.
   6. Pellettare le celle centrifugando a 300 x g per 3 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e aggiungere 12 ml di AFM a ciascun tubo, assicurandosi che i pellet cellulari siano risospesi.
   7. Pipettare 500 μL della sospensione enteroide in ciascun pozzetto di due piastre di attacco ultra-basse da 24 pozzetti.
   8. Incubare le piastre a 37 °C e 5% di CO 2 per_2-5 giorni o fino a quando gli enteroidi non hanno invertito la polarità.
   9. Per verificare l'inversione enteroide, stabilire prima la colorazione immunofluorescente di conferma e il tempo medio di inversione (~ 3 giorni), quindi confermare l'inversione di polarità utilizzando una visualizzazione di base al microscopio ottico. Gli enteroidi apicali-out sono molto cellulari nell'aspetto, mentre gli enteroidi basolaterali sono spesso dominati dalla presenza di un grande lume centrale o gemmazione (vedi Figura supplementare 1).
      NOTA: una volta che la procedura è stata standardizzata, il tasso di conversione in apical-out supera in genere il 95%. L'uso di enteroidi apical-out è inteso come un esperimento terminale, anche se è teoricamente possibile far passare enteroidi apical-out in un piccolo numero di enteroidi basolaterali-out.
3. Apical-out NEC-in-a-dish
   NOTA: Una volta che gli enteroidi hanno invertito la polarità, utilizzare rapidamente le colture negli esperimenti successivi, poiché la loro longevità nella conformazione apical-out non è stata confermata oltre i 3-4 giorni. Per il seguente modello NEC-in-a-dish, gli enteroidi sono stati trattati per 24 ore, quindi raccolti immediatamente dopo e conservati per esperimenti a valle.
   1. Una volta che gli enteroidi hanno invertito visivamente la polarità con almeno il 95% di efficienza, rimuovere le piastre dall'incubatore e raccogliere otto pozzetti di una piastra a 24 pozzetti in un tubo conico da 15 ml. Poiché gli enteroidi apical-out sono in sospensione, è sufficiente pipettare la soluzione enteroid/media. Centrifugare il tubo da 15 mL a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
   2. Una volta che le cellule sono pellettizzate, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 4 ml di AFM miscelato con il volume desiderato (10 μL qui per abbinare il massimo volume di trattamento aggiunto) di 1x PBS (controllo).
   3. Pipettare 500 μL di sospensione enteroide/PBS/AFM in otto pozzetti di una piastra di attacco ultra-bassa a 24 pozzetti e incubare la piastra a 37 °C e al 5% di CO₂ per 24 ore.
   4. Ripetere i passaggi 1.3.1.-1.3.3. per i trattamenti con TNF-α (20 ng/mL e 50 ng/mL) e LPS (100 μg/mL e 200 μg/mL) alla normossia. Per tutti i trattamenti per l'ipossia, ripetere i passaggi 1.3.1.-1.3.3., ma porre la piastra in un'incubatrice separata a 37 °C, 5% CO 2 e 1% O₂ per 24 ore.
      NOTA: Passo 1.3.4. può essere eseguita contemporaneamente ai passaggi 1.3.1.-1.3.3, ma, per chiarezza, la procedura di cui sopra è stata separata dal trattamento al fine di ridurre la complessità.

2. Colorazione immunofluorescente e microscopia confocale

1. Preparazione di soluzioni coloranti
   1. Preparare Triton X-100 allo 0,1% miscelando 7 μL di Triton X-100 in 1x PBS fino a un volume finale di 7 ml. Preparare PBST (PBS-Tween) aggiungendo 30 μL di Tween-20 a 1x PBS a un volume finale di 30 ml.
   2. Preparare il 10% di siero normale d'asina (NDS)/PBST aggiungendo 700 μL di NDS a 6,3 ml di PBST. Preparare NDS/PBST all'1% aggiungendo 70 μL di NDS al PBST per un volume finale di 7 ml.
      NOTA: Il siero d'asino è stato usato qui per correlare con l'ospite anticorpale secondario. Tuttavia, le specie di siero bloccante devono corrispondere alle specie di anticorpi secondari per bloccare correttamente il legame non specifico.
2. Colorazione (Giorno 1)
   1. Trasferire il contenuto di quattro pozzetti di una piastra da 24 pozzetti in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Ripetere l'operazione per tutti i pozzetti/trattamenti desiderati, con ogni trattamento in una provetta separata. Centrifugare i tubi a 300 x g per 4 minuti a 4 °C. Una volta che gli enteroidi sono pellettati, rimuovere il surnatante.
   2. Risospendere i pellet cellulari in 300 μL di fissativo di formaldeide al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente (RT). Dopo 30 minuti, centrifugare i tubi a 300 x g per 4 minuti a 4 °C, rimuovere il surnatante e lavare il pellet con 500 μL di sterile, RT 1x PBS.
   3. Centrifugare i tubi a 300 x g per 4 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e aggiungere 500 μL di Triton X-100 allo 0,1%, quindi lasciare riposare per 1 ora a RT.
   4. Dopo 1 ora, centrifugare le provette a 300 x g per 4 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Lavare con 500 μL di 1x PBS e posizionare i tubi su un rotatore o agitatore a 200 rpm per 15 minuti a 2-8 °C. Ripeti questo per un totale di 4x.
   5. Centrifugare i tubi a 300 x g per 4 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Aggiungere 500 μL di NDS/PBST al 10% e incubare a RT per 45 minuti. Durante l'incubazione, preparare soluzioni di anticorpi primari combinando 20 μL di anticorpo anti-villina ricombinante, 10 μL di anticorpo E-caderina e 1970 μL di NDS/PBST all'1% per otto pozzetti di una piastra da 24 pozzetti.
   6. Dopo i 45 minuti di incubazione, centrifugare le provette a 300 x g per 4 minuti a 4 °C. Posizionare i tubi sul ghiaccio. Rimuovere il surnatante e sostituirlo con 250 μL di soluzione anticorpale primaria. Incubare le provette per una notte a 2-8 °C.
3. Colorazione (Giorno 2)
   1. Centrifugare i tubi a 300 x g per 4 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Aggiungere 250-500 μL di PBST a ciascun tubo, a seconda delle dimensioni del pellet, e posizionare sul rotatore o agitatore a 200 giri / min per 1 ora a 2-8 °C. Ripetere il lavaggio PBST 4x.
   2. Preparare la soluzione anticorpale secondaria aggiungendo 52 μL di Cy3 asino anti-coniglio IgG (H + L) al 50% di glicerolo e 5,2 μL di 488 anticorpi secondari verde fluorescente anti-topo asino a 5142,8 μL di NDS / PBST all'1%.
   3. Dopo l'ultimo lavaggio e centrifugazione PBST, rimuovere il surnatante dai tubi. Erogare 200 μL di soluzione anticorpale secondaria a ciascuna provetta e incubare al buio per una notte a 2-8 °C.
4. Montaggio di enteroidi apicali-out colorati (Giorno 1)
   1. Portare il montante a base di glicerolo contenente colorante nucleare blu a RT in 1 ora.
   2. Centrifugare i tubi a 300 x g per 4 minuti a 4 °C. Rimuovere 100 μL del surnatante e risospendere le cellule nei restanti ~100 μL di surnatante. Trasferire la sospensione cellulare in provette da 0,5 ml.
   3. Centrifugare i tubi in una mini centrifuga per 20 s per pellettare le celle. Rimuovere il surnatante e risospendere i pellet cellulari in 100 μL di colorazione di acido nucleico rosso lontano. Incubare i tubi a RT per 10 minuti.
   4. Centrifugare i tubi in una mini centrifuga per 20 s per pellettare le celle. Rimuovere il surnatante e risospendere i pellet cellulari in 100 μL di 1x PBS. Ripetere per un secondo lavaggio.
   5. Centrifugare i tubi in una mini centrifuga per 20 s per pellettare le celle e rimuovere 70 μL del surnatante. Risospendere le celle nel volume rimanente di PBS e trasferire il contenuto in un coprivetrino etichettato (24 mm x 60 mm).
   6. Applicare 75 μL di montante direttamente sul campione e rimuovere eventuali bolle con una punta di pipetta. Lasciare che i coprivetrini si polimerizzino durante la notte (18-24 h) a RT al buio.
5. Montaggio di enteroidi apicali-out colorati (Giorno 2)
   1. Dopo la polimerizzazione durante la notte, applicare uno strato sottile (~ 15 μL) di glicerolo sui vetrini. Montare il vetrino sul vetrino e premere delicatamente in posizione. Tocca per rimuovere eventuali bolle tra la copertina e la diapositiva.
   2. Lasciare che il coprislip si posizioni su RT al buio per un minimo di 2 ore, prima di scattare immagini con un ingrandimento 20x con un microscopio confocale. Per la visualizzazione microscopica degli enteroidi utilizzando vari metodi di acquisizione confocale, fare riferimento a Lallemant et ^al.37.
6. Quantificazione immunofluorescente
   NOTA: questo metodo determina la fluorescenza totale corretta rimuovendo il segnale di fondo utilizzando il software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).
   1. Aprire le immagini confocali in ImageJ e delineare l'area desiderata con lo strumento regione di interesse (ROI).
   2. Impostare i parametri definiti dall'utente passando a Analizza > Imposta misure. Selezionare Area > Densità integrata > Valore medio grigio nella scheda Impostazioni.
   3. Passare ad Analizza > misura. Apparirà una finestra pop-up contenente le misure. Copia e incolla queste misurazioni in un foglio di calcolo.
   4. Per sottrarre il segnale di sfondo, selezionare una piccola area non fluorescente dell'immagine. Passare ad Analizza > misura per quell'area . Apparirà una finestra pop-up contenente le misure. Copia e incolla l'output in un foglio di calcolo.
   5. Moltiplicare l'area della cella selezionata per la fluorescenza media delle letture di fondo e sottrarre la somma dalla densità integrata per calcolare la fluorescenza cellulare totale corretta (CTCF). Ripetere i passaggi precedenti per tutte le immagini di interesse, mantenendo i record in un foglio di calcolo o in un pacchetto software statistico (vedere Tabella dei materiali).

3. Vitalità cellulare NEC-in-a-dish apical-out

1. Trattamenti enteroidi
   1. Stabilire un modello NEC-in-a-dish apical-out per 24 ore, come nel passaggio 1.
   2. Saggio di vitalità cellulare reagente per la notte a 4 °C. Il giorno del test, portare il reagente a RT 30 minuti prima dell'uso. Capovolgere il reagente per miscelare.
   3. Prima di eseguire il test, rimuovere 100 μL di terreno da ciascun pozzetto, lasciando i restanti 400 μL. Aggiungere 400 μL di reagente di analisi di vitalità cellulare a ciascun pozzetto.
   4. Mescolare energicamente bene il contenuto su uno shaker a piastre a RT per 5 minuti a 200 giri / min per indurre la lisi cellulare. Dopo l'agitazione, incubare la piastra a RT per altri 25 minuti.
   5. Dopo 25 minuti di incubazione, mescolare il contenuto di un pozzetto tramite pipettaggio e trasferire 200 μL degli 800 μL in un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, opaca, in polistirene, con fondo chiaro. Ripetere l'operazione per i restanti 600 μL, creando quattro repliche tecniche per pozzetto. Trasferire il contenuto rimanente di ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti in una piastra a 96 pozzetti in questo modo.
   6. Utilizzando un lettore di piastre in grado di luminescenza, registrare i valori a 0,25 ms di integrazione e confrontare i valori relativi tra i trattamenti. In alternativa, confrontare la luminescenza del trattamento con uno standard di adenosina trifosfato (ATP).

Risultati

L'uso di enteroidi per modellare l'infiammazione intestinale, anche nel contesto dell'enterocolite necrotizzante, è ora comune. Tuttavia, la maggior parte dei metodi attualmente utilizzati non hanno accesso alla superficie apicale degli enteroidi, negando la rilevanza fisiologica dei composti destinati all'eventuale uso come terapie orali, o sono tecnicamente difficili e richiedono tempo, come con i monostrati derivati dagli enteroidi. Per aumentare l'utilità degli attuali modelli enteroidi in vitro di NEC, ab...

Discussione

Il recente sviluppo di modelli enteroidi derivati da cripte epiteliali intestinali consente un tessuto in vitro più fisiologicamente rilevante in cui studiare la patogenesi dell'enterocolite necrotizzante. Nonostante includano tutti i principali tipi di cellule differenziate dell'epitelio intestinale, gli enteroidi 3D sono ancora soggetti a diverse limitazioni significative. Gli enteroidi convenzionali basolaterali-out sono sospesi in cupole di idrogel ECM 3D, la cui composizione e densità possono limitare la ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0	Fisher Scientific	15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
15 mL Conical tube	VWR	89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates	Fisher Scientific	07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mm	Thermo Scientific	102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate	Sigma-Aldrich	AP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer	STEMCELL Technologies	36254
E-cadherin antibody (7H12)	Novus Biologicals	NBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Millipore Sigma	1004960700
Glycerol	Sigma-Aldrich	56-81-5
ImageJ	Fiji	N/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	STEMCELL Technologies	06010
Leica SP8 Confocal Microscope	Leica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography	Millipore Sigma	L3012-10MG
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-7
Normal Donkey Serum	Sigma-Aldrich	566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate	Thermo Scientific	136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4	Corning	21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Fisher Scientific	P36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]	Abcam	ab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg	Bio-Techne	210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L	Fisher Scientific	3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661)	Thermo Scientific	T3605
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat cap	Thermo Scientific	AB0350
Tween-20	Sigma-Aldrich	9005-64-5