إزالة الاستقطاب الانتقائي بمساعدة الموائع الدقيقة للميتوكوندريا المحورية

Summary

يصف البروتوكول الحالي بذر وتلطيخ الميتوكوندريا العصبية في غرف الموائع الدقيقة. يسمح تدرج الضغط السائل في هذه الغرف بالمعالجة الانتقائية للميتوكوندريا في المحاور لتحليل خصائصها استجابة للتحديات الدوائية دون التأثير على حجرة جسم الخلية.

Abstract

الميتوكوندريا هي المورد الرئيسي ل ATP (أدينوسين ثلاثي الفوسفات) في الخلايا العصبية. ضعف الميتوكوندريا هو نمط ظاهري شائع في العديد من الأمراض التنكسية العصبية. بالنظر إلى البنية المعقدة لبعض المحاور العصبية وطولها الشديد، فليس من المستغرب أن تواجه الميتوكوندريا في المحاور بيئات مختلفة مقارنة بنظيراتها في جسم الخلية. ومن المثير للاهتمام ، أن خلل الميتوكوندريا المحورية غالبا ما يسبق التأثيرات على جسم الخلية. لنمذجة الخلل الوظيفي للميتوكوندريا المحورية في المختبر ، تسمح أجهزة الموائع الدقيقة بمعالجة الميتوكوندريا المحورية دون التأثير على الميتوكوندريا السومية. يمنع تدرج الضغط السائل في هذه الغرف انتشار الجزيئات ضد التدرج ، مما يسمح بتحليل خصائص الميتوكوندريا استجابة للتحديات الدوائية المحلية داخل المحاور. يصف البروتوكول الحالي بذر الخلايا العصبية الحصين المنفصلة في أجهزة الموائع الدقيقة ، وتلطيخها بصبغة حساسة ذات إمكانات غشائية ، والعلاج بسم الميتوكوندريا ، والتحليل المجهري اللاحق. يمكن تطبيق هذه الطريقة متعددة الاستخدامات لدراسة البيولوجيا المحورية على العديد من الاضطرابات الدوائية وقراءات التصوير ، وهي مناسبة للعديد من الأنواع الفرعية العصبية.

Introduction

الميتوكوندريا هي الموردين الرئيسيين ل ATP (أدينوسين ثلاثي الفوسفات) في الخلايا العصبية. نظرا لأن صحة الخلايا العصبية مرتبطة ارتباطا وثيقا بوظيفة الميتوكوندريا ، فليس من المستغرب أن يرتبط التنظيم المختل لهذه العضيات بظهور العديد من الأمراض التنكسية العصبية ، بما في ذلك مرض باركنسون¹. علاوة على ذلك ، تم استخدام تسمم الميتوكوندريا بنجاح لنمذجة أعراض باركنسون في الحيوانات². في كل من النماذج الحيوانية والأمراض البشرية ، يبدأ زوال الخلايا العصبية في الأجزاء البعيدة ^3,4 ، مما يشير إلى أن الميتوكوندريا المحورية قد تكون أكثر عرضة للإهانات. ومع ذلك ، فإن بيولوجيا الميتوكوندريا في المحاور ليست مفهومة جيدا بسبب الصعوبات المرتبطة بالعلاج المستهدف وتحليل الميتوكوندريا المحورية دون اضطراب متزامن في عمليات جسم الخلية.

تسمح التطورات الحديثة في تقنيات زراعة الخلايا العصبية المنفصلة في المختبر الآن بالفصل السائل للمحاور العصبية وأجسام الخلايا من خلال أجهزة الموائع الدقيقة⁵. كما هو موضح في الشكل 1A ، تتميز هذه الأجهزة بأربعة آبار وصول (a / h و c / i) ، مع قناتين تربطان كل زوج (d و f). ترتبط القنوات الكبيرة ببعضها البعض بواسطة سلسلة من القنوات الدقيقة بطول 450 ميكرومتر (e). تخلق الاختلافات المتعمدة في مستويات التعبئة بين الغرفتين تدرجا لضغط السائل (الشكل 1 ب) يمنع انتشار الجزيئات الصغيرة من القناة ذات مستوى السائل المنخفض إلى الجانب الآخر (الشكل 1 ج ، موضح بصبغة تريبان الزرقاء).

استخدمنا مؤخرا أجهزة الموائع الدقيقة لدراسة متطلبات الترجمة المحلية في mitophagy المحورية ، الإزالة الانتقائية للميتوكوندريا^{التالفة 6}. في البروتوكول الحالي ، يتم تقديم خطوات مختلفة للحث على تلف الميتوكوندريا المحلي من خلال المعالجة الانتقائية للمحاور باستخدام مثبط مركب الميتوكوندريا III Antimycin A ^6,7.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة لحكومة بافاريا العليا. تم تحضير الخلايا العصبية الأولية من أجنة الفئران البرية E16.5 C57BL / 6 من كلا الجنسين باتباع الطرق القياسية كما هو موضح سابقا⁶.

1. تجميع جهاز الموائع الدقيقة

1. قم بتغطية صفيحة زراعة الأنسجة ذات القاع الزجاجي المكونة من ستة آبار بتركيز نهائي قدره 20 ميكروغرام / مل من Poly-D-Lysine و 3.4 ميكروغرام / مل من Laminin في PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) (انظر جدول المواد).
2. احتضان اللوحة المطلية طوال الليل في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: يمكن أيضا إجراء الطلاء عند 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة. يعتمد اختيار الطلاء على نوع الخلية المستخدمة.
3. بعد الطلاء ، أحضر الألواح المكونة من ستة آبار إلى الغطاء المعقم واغسلها مرتين باستخدام ddH₂O المعقم.
   ملاحظة: لا تغسل بمخازن تحتوي على الملح مثل PBS ، لأن بلورات الملح سوف تتداخل مع تكوين الختم.
4. اترك الطبق يجف في وضع مائل لمدة 3-5 دقائق. قم بإزالة الماء الزائد عن طريق الشفط الفراغي أو سحب العينات.
5. نقع غرفة الموائع الدقيقة في 80 ٪ من الإيثانول.
   ملاحظة: تم الحصول على غرفة الموائع الدقيقة من مصادر تجارية (انظر جدول المواد).
6. اترك غرفة الموائع الدقيقة تجف لمدة 3-5 دقائق في وضع مائل. قم بإزالة الإيثانول الزائد عن طريق الفراغ أو الشفط أو السحب.
7. عندما تجف تماما ، ضع غرفة الموائع الدقيقة في وسط البئر.
   ملاحظة: يمكن ملاحظة تشكيل الختم كتغيير في الخصائص العاكسة عند استبعاد الهواء من الواجهة بين اللوحة وجهاز السيليكون. يجب أن تكون كل من اللوحة وغرفة الموائع الدقيقة جافة تماما قبل التجميع لإنشاء ختم جيد. ومع ذلك ، يجب تقليل وقت التجفيف قدر الإمكان لضمان الالتزام السليم بالخلايا. لذلك ، يجب فحص الآبار والغرف بصريا بحثا عن قطرات السائل المتبقية. إذا لم تكن هناك قطرات مرئية ، فقم بتجميع الغرف على الفور.
8. اضغط برفق على غرفة الموائع الدقيقة عند حدودها وقسم microgroove في المنتصف للتثبيت المناسب باللوحة الزجاجية.

2. البذر والحفاظ على الخلايا العصبية

1. اجمع العدد المطلوب من الخلايا العصبية الحصينية المنفصلة لكل حجرة في أنبوب تفاعل سعة 1.5 مل.
   ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، تم زرع 1.5 × 10⁵ خلايا عصبية لكل جهاز للتطبيقات القائمة على التصوير.
2. الخلايا العصبية الطرد المركزي في 1000 × غرام لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
3. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة وأعد تعليق الحبيبات في 8 ميكرولتر من وسائط B27-Neurobasal (انظر جدول المواد).
4. ماصة محلول الخلية في مدخل القناة لغرفة الموائع الدقيقة (ب في الشكل 1 أ).
5. اضغط على الجزء الخلفي من اللوحة للمساعدة في التدفق عبر القناة.
   ملاحظة: يمكن إجراء النقر بقوة تامة دون القلق من كسر الختم.
6. نضح باستخدام ماصة أي تعليق خلوي متبقي عند مخرج القناة (g في الشكل 1A) لتقليل عدد الخلايا خارج القناة.
7. احتضان غرفة الموائع الدقيقة بالخلايا لمدة 15-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO_2.
8. املأ البئر المحوري العلوي ب 50 ميكرولتر من الوسائط القاعدية العصبية B27 في (ج في الشكل 1 أ).
9. اضغط على الجزء الخلفي من اللوحة للمساعدة في التدفق عبر القناة.
10. املأ الآبار على جانب سوما (أ و ح في الشكل 1 أ) ب 150 ميكرولتر من الوسائط القاعدية العصبية B27 لكل منهما ، مما يخلق فقاعة توتر في الأعلى. حجم الفقاعة حوالي 20 ميكرولتر.
    ملاحظة: إنشاء فقاعة توتر ليس ضروريا لتحقيق عزل السوائل ، ولكنه يوفر رؤية واضحة للحجم الأعلى على جانب سوما.
11. املأ كلا البئرين من الجانب المحوري (c و i في الشكل 1A) ب 100 ميكرولتر من الوسائط القاعدية العصبية B27 لكل منهما.
    ملاحظة: لتعزيز النمو المحوري من خلال الأخاديد الدقيقة ، يوصى بأن تحتوي الآبار الموجودة على جانب سوما على وسائط أكثر من الآبار الموجودة على جانب المحور العصبي. ومع ذلك ، ستنمو المحاور عن طريق الصدفة من خلال الأخاديد الدقيقة حتى بدون اختلافات في الحجم.
12. احتضان غرفة الموائع الدقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ لمدة 7-8 أيام.
    ملاحظة: يمكن عادة ملاحظة نمو المحاور العصبية في الغرفة المحورية بدءا من اليوم في المختبر (DIV) 5. أوقات زراعة أطول ممكنة إذا كانت الثقافات الأكثر نضجا مطلوبة.
13. تغذية الخلايا العصبية كل 2-3 أيام عن طريق إزالة الوسط من البئرين العلويين (أ و ج) واستبداله بوسط B27-Neurobasal جديد حتى تتشكل فقاعة التوتر.

3. تلطيخ مع غشاء الميتوكوندريا صبغة حساسة محتملة

1. في DIV 7-8 ، قم بتقييم أن المحاور العصبية قد نمت من خلال الأخاديد الدقيقة وتمتد إلى المقصورة المحورية أسفل المجهر الضوئي.
   ملاحظة: مراحل DIV مختلفة ممكنة أيضا اعتمادا على العمر المطلوب.
2. قم بإجراء غسلتين باستخدام وسط تصوير مسبق التسخين (37 درجة مئوية) عن طريق إزالة وسط B27-Neurobasal من جميع الآبار وإضافة حوالي 100 ميكرولتر من وسط التصوير إلى الآبار العلوية لكل من القنوات المحورية وقنوات سوما (أ و ج). دع الوسط يتدفق إلى الآبار السفلية (h و i).
   1. قم بإزالة الوسط من الآبار السفلية وأي وسط متبقي في الآبار العلوية ، وكرر مع وسط جديد ، وترك الآبار فارغة في نهاية الغسيل.
      ملاحظة: نظرا للقوة الشعرية العالية في القنوات (d و f) ، سيكون هناك وسيط غسيل متبقي في القنوات لا ينبغي إزالته لمنع الخلايا العصبية من الجفاف. يمكن استخدام أي وسيط تصوير خال من الفينول الأحمر هنا ، على سبيل المثال ، Hibernate E (انظر جدول المواد). إذا لم يتم إعداد المجهر بمصدر CO 2 ، فتأكد من أن وسيط التصوير يستخدم نظام تخزين مؤقت بديل للكربونات / CO₂ (على سبيل المثال ، HEPES) ⁸.
3. تمييع 1 mM رباعي ميثيل رودامين إيثيل استر (TMRE ، أحمر ، انظر جدول المواد) مخزون إلى 5 نانومتر في وسط التصوير.
   ملاحظة: لا تتجاوز 1٪ DMSO في التخفيف النهائي لتجنب السمية.
4. أضف 100 ميكرولتر من تخفيف 5 نانومتر TMRE إلى كل من الآبار العلوية الجسدية والمحورية (a و c) ، واترك الوسط يتدفق عبر كل من المقصورات الجسدية والمحورية حتى يكون هناك حجم متساو في جميع الآبار. املأ الوسط المحتوي على TMRE.
5. ضع الخلايا العصبية مرة أخرى في غرفة بيئة خاضعة للرقابة (37 درجة مئوية و 5٪ CO₂) لمدة 25 دقيقة.
6. قم بإجراء غسلتين باستخدام وسيط التصوير قبل التسخين (37 درجة مئوية) كما هو موضح من قبل (الخطوة 3.2). في الغسيل الأخير ، املأ 100 ميكرولتر في كل بئر وقم بإنشاء فقاعة توتر للوسط على الآبار الجسدية (أ و ج).

4. تصوير الخلايا الحية

ملاحظة: تم الحصول على الصور الثابتة المعروضة على مجهر متحد البؤر للقرص الدوار ، باستخدام هدف غمر 40x NA 1.25 (انظر جدول المواد). تم اختيار وقت التعرض 200 مللي ثانية و 10٪ من طاقة الليزر للقناة الحمراء ووقت التعرض 500 مللي ثانية ل Brightfield. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام المجاهر المقلوبة المنتظمة أو واسعة المجال لدراسة شدة TMRE.

1. صورة الخلايا مع المجهر المقلوب.
2. تأكد من أن المجهر مجهز بحاضنة مرحلة للحفاظ على الثقافة العصبية عند 37 درجة مئوية طوال التجربة.
3. حدد منطقة ذات أهمية في المقصورة الجسدية ، واتبعها من خلال الأخاديد الدقيقة في المقصورة المحورية. تأكد من أن الأخاديد الدقيقة التي تم تصويرها تتطابق مع تلك الموجودة في المقصورات الجسدية والمحورية (لتسهيل مقارنة خط الأساس وما بعد المعالجة).
4. التقط صورا مضان باستخدام الإثارة عند 561 نانومتر والانبعاث عند 625 نانومتر لإشارة التألق الحمراء.
5. الحصول على الصور.
6. للحث على إزالة استقطاب الميتوكوندريا ، أضف 20 ميكرومتر Antimycin A (انظر جدول المواد) في وسط التصوير إلى المقصورة المحورية. لضمان اختلاف الحجم بين غرف سوما وغرف محورية ، تحقق من وجود فقاعة توتر على الجانب الجسدي (يساوي الحجم >110 ميكرولتر).
   1. قم بإزالة كل وسيط التصوير من البئر السفلي للجانب المحوري (i) ، باستثناء الوسيط الموجود داخل القناة (f). أضف 160 ميكرولتر من 20 ميكرومتر Antimycin A إلى البئر المحوري العلوي (c) واتركه يتدفق عبر القناة حتى يكون هناك حجم متساو في كلا البئرين المحوريين. تبلغ الأحجام في الآبار المحورية حوالي 80 ميكرولتر لكل بئر.
      ملاحظة: تأكد من أن الحجم في الآبار المحورية أصغر منه في الآبار الجسدية لضمان ضغط السائل المناسب. يوصى باختلاف لا يقل عن 10 ميكرولتر (10٪ من حجم البئر) ، ولكن من الممكن أيضا وجود اختلافات أعلى.
7. احتضان الخلايا العصبية في غرفة البيئة الخاضعة للرقابة (37 درجة مئوية) لمدة 20-30 دقيقة.
8. كرر التصوير كما هو موضح أعلاه (الخطوات 4.3-4.5). تأكد من تصوير نفس المواضع (يمكن تحديدها بسهولة بواسطة الأخاديد الدقيقة) كما هو الحال أثناء اكتساب خط الأساس.

النتائج

نمت الخلايا العصبية الحصينية الأولية في أجهزة الموائع الدقيقة لمدة 7-8 أيام قبل تلطيخ الميتوكوندريا بالصبغة الحساسة للغشاء (TMRE) لمدة 25 دقيقة في كلتا القناتين. كما هو موضح في الشكل 2 أ ، أدى ذلك إلى تلطيخ متجانس للميتوكوندريا على جانبي الأخاديد الدقيقة ، ومع ذلك لم يكن كافيا ل...

Discussion

يصف البروتوكول الحالي طريقة لزرع وزراعة الخلايا العصبية الحصينية المنفصلة في جهاز الموائع الدقيقة لعلاج الميتوكوندريا المحورية بشكل منفصل. يتم توضيح فائدة هذا النهج مع الصبغة الحساسة للغشاء TMRE ومثبط المركب III Antimycin A (كما هو موضح سابقا⁷) هنا ، ولكن يمكن تكييف هذه الطريقة بسهول...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well Glass bottom plate	Cellvis	P06.1.5H-N	Silicone device
Antimycin A	Sigma	A8674
B27	Gibco	17504044
EVOS M5000 widefield microscope	Thermofischer Scientific	EVOS M5000	fully integrated digital widefield microscope
Hibernate E	BrainBits	HE500
Inverted spinning disk confocal	Nikon	TI2-E + CSU-W1	With incubator chamber
Laminin	Invitrogen	L2020
Microfluidic devices	XONA microfluidics	RD450
Neurobasal medium	Gibco	21103049
Poly-D-Lysine	Sigma	P2636
TMRE	Sigma	87917