דה-פולריזציה סלקטיבית בסיוע מיקרופלואידיקה של מיטוכונדריה אקסונאלית

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר זריעה והכתמה של מיטוכונדריה עצבית בתאים מיקרופלואידיים. שיפוע הלחץ הנוזלי בתאים אלה מאפשר טיפול סלקטיבי במיטוכונדריה באקסונים כדי לנתח את תכונותיהם בתגובה לאתגרים פרמקולוגיים מבלי להשפיע על תא גוף התא.

Abstract

מיטוכונדריה הם הספקים העיקריים של ATP (אדנוזין טריפוספט) בתאי עצב. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה הוא פנוטיפ נפוץ במחלות נוירודגנרטיביות רבות. בהתחשב בארכיטקטורה המשוכללת ובאורך הקיצוני של חלק מהאקסונים, אין זה מפתיע שהמיטוכונדריה באקסונים יכולה לחוות סביבות שונות בהשוואה למקביליהם בגוף התא. באופן מעניין, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה האקסונלית לעתים קרובות קודם להשפעות על גוף התא. כדי ליצור מודלים של תפקוד לקוי של המיטוכונדריה במבחנה, התקנים מיקרופלואידיים מאפשרים טיפול במיטוכונדריה אקסונאלית מבלי להשפיע על המיטוכונדריה הסומאלית. שיפוע הלחץ הנוזלי בתאים אלה מונע דיפוזיה של מולקולות כנגד השיפוע, ובכך מאפשר ניתוח של תכונות המיטוכונדריה בתגובה לאתגרים פרמקולוגיים מקומיים בתוך האקסונים. הפרוטוקול הנוכחי מתאר זריעה של נוירונים מנותקים בהיפוקמפוס במכשירים מיקרופלואידיים, הכתמה בצבע רגיש פוטנציאלי לממברנה, טיפול ברעלן מיטוכונדריאלי, והניתוח המיקרוסקופי שלאחר מכן. שיטה רב-תכליתית זו לחקר הביולוגיה האקסונאלית יכולה להיות מיושמת על הפרעות פרמקולוגיות רבות וקריאות הדמיה, והיא מתאימה למספר תת-סוגים עצביים.

Introduction

מיטוכונדריה הם הספקים העיקריים של ATP (אדנוזין טריפוספט) בתאי עצב. מכיוון שבריאות עצבית קשורה קשר הדוק לתפקוד המיטוכונדריה, אין זה מפתיע כי ויסות לא מתפקד של אברונים אלה נקשר עם הופעת מחלות נוירודגנרטיביות שונות, כולל מחלת פרקינסון¹. יתר על כן, שיכרון מיטוכונדריאלי שימש בהצלחה למודל תסמיני פרקינסון בבעלי חיים². הן במודלים של בעלי חיים והן במחלות אנושיות, מותם של תאי עצב מתחיל בחלקים הדיסטליים ^3,4, מה שמרמז על כך שהמיטוכונדריה האקסונלית עשויה להיות רגישה יותר לעלבונות. עם זאת, הביולוגיה של המיטוכונדריה באקסונים אינה מובנת היטב בשל הקשיים הקשורים לטיפול ממוקד וניתוח של מיטוכונדריה אקסונאלית ללא הפרעה בו זמנית של תהליכים בגוף התא.

ההתקדמות האחרונה בטכניקות culturing של נוירונים מנותקים במבחנה מאפשרת כעת הפרדה נוזלית של אקסונים וגופי תאים באמצעות התקנים מיקרופלואידיים⁵. כפי שמתואר באיור 1A, המכשירים האלה כוללים ארבע בארות גישה (a/h ו-c/i), עם שני ערוצים המחברים כל זוג (d ו-f). הערוצים הגדולים מחוברים זה לזה בסדרה של מיקרו-ערוצים באורך 450 מיקרומטר (e). הבדלים מכוונים ברמות המילוי בין שני התאים יוצרים שיפוע לחץ נוזל (איור 1B) שמונע דיפוזיה של מולקולות קטנות מהתעלה עם רמת נוזל נמוכה יותר לצד השני (איור 1C, מודגם בצבע כחול טריפאן).

לאחרונה השתמשנו בהתקנים מיקרופלואידיים כדי לחקור את דרישות התרגום המקומיות במיטופגיה אקסונאלית, הסרה סלקטיבית של מיטוכונדריה פגומה⁶. בפרוטוקול הנוכחי מוצגים צעדים שונים לגרימת נזק מיטוכונדריאלי מקומי באמצעות טיפול סלקטיבי באקסונים באמצעות מעכב קומפלקס מיטוכונדריאלי III Antimycin A ^6,7.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות של ממשלת בוואריה עילית. הנוירונים הראשוניים הוכנו מעוברי עכברים מסוג E16.5 C57BL/6 משני המינים בשיטות סטנדרטיות כפי שתואר קודם^{לכן 6}.

1. הרכבה של המכשיר המיקרופלואידי

1. מצפים צלחת תרבית רקמה אחת בעלת תחתית זכוכית של שש בארות בריכוז סופי של 20 מיקרוגרם/מ"ל של פולי-D-ליזין ו-3.4 מיקרוגרם/מ"ל של למינין ב-PBS (תמיסת מלח עם מאגרי פוספט) (ראו טבלת חומרים).
2. לדגור על הצלחת המצופה למשך הלילה בחושך בטמפרטורת החדר.
   הערה: ניתן לבצע ציפוי גם בטמפרטורה של 37°C למשך 1-2 שעות. בחירת הציפוי תלויה בסוג התא המשמש.
3. לאחר הציפוי, הביאו את שש הצלחות למכסה המנוע הסטרילי ושטפו אותן פעמיים עם ddH₂O סטרילי.
   הערה: אין לשטוף עם מאגרים המכילים מלח, כגון PBS, שכן גבישי מלח יפריעו להיווצרות כלבי הים.
4. אפשרו לצלחת להתייבש במצב מוטה למשך 3-5 דקות. הסר עודפי מים על ידי שאיבה ואקום או פיפטציה.
5. השרו את התא המיקרופלואידי ב-80% אתנול.
   הערה: התא המיקרופלואידי התקבל ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים).
6. אפשרו לתא המיקרופלואידי להתייבש במשך 3-5 דקות במצב מוטה. הסר עודפי אתנול על ידי ואקום, יניקה או פיפטציה.
7. כאשר יבש לחלוטין, מניחים את התא המיקרופלואידי במרכז הבאר.
   הערה: ניתן לראות את היווצרות האטם כשינוי בתכונות רפלקטיביות עם הרחקת האוויר מהממשק בין הצלחת למכשיר הסיליקון. גם הצלחת וגם התא המיקרופלואידי חייבים להיות יבשים לחלוטין לפני ההרכבה כדי ליצור אטימה טובה. עם זאת, יש למזער את זמן הייבוש ככל האפשר כדי להבטיח דבקות נכונה בתאים. לכן, הבארות והתאים חייבים להיבדק חזותית עבור טיפות נוזליות שנותרו. אם אין טיפות גלויות, מיד להרכיב את התאים.
8. הקש בעדינות על התא המיקרופלואידי בגבולותיו ועל חלק המיקרו-חריץ באמצע לחיבור תקין לצלחת הזכוכית.

2. זריעה ותחזוקה של נוירונים

1. אסוף את המספר הרצוי של נוירונים מנותקים בהיפוקמפוס בכל תא בצינור תגובה של 1.5 מ"ל.
   הערה: עבור המחקר הנוכחי, 1.5 x 10⁵ נוירונים נזרעו לכל מכשיר עבור יישומים מבוססי הדמיה.
2. נוירונים צנטריפוגים ב 1000 x g במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.
3. יש להשליך את הסופר-נאטנט בעזרת פיפטה ולהשהות את הכדור ב-8 מיקרון של מדיה B27-Neurobasal (ראו טבלת חומרים).
4. צלע את תמיסת התא לתוך פתח התעלה של התא המיקרופלואידי (b באיור 1A).
5. הקש על גב הלוח כדי לסייע בזרימה דרך הערוץ.
   הערה: הקשה יכולה להיעשות די בכוח מבלי לחשוש שהאטם יישבר.
6. שאפו עם פיפטה על כל תרחיף התאים שנותר ביציאה מהתעלה (g באיור 1A) כדי להקטין את מספר התאים מחוץ לערוץ.
7. דגירה של החדר המיקרופלואידי עם תאים למשך 15-20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO_2.
8. מלאו את הבאר האקסונאלית העליונה ב-50 μL של מדיה B27-Neurobasal (c באיור 1A).
9. הקש על גב הלוח כדי לסייע בזרימה דרך הערוץ.
10. מלאו בארות בצד הסומה (a ו-h באיור 1A) ב-150 μL של מדיה B27-Neurobasal כל אחת, ויצרו בועת מתח למעלה. נפח הבועה הוא כ 20 μL.
    הערה: יצירת בועת מתח אינה הכרחית כדי להשיג בידוד נוזלי, אך היא מספקת תמונה ברורה של הנפח הגבוה יותר בצד הסומא.
11. מלאו את שתי הבארות של הצד האקסונאלי (c ו-i באיור 1A) ב-100 μL של מדיה B27-Neurobasal כל אחת.
    הערה: כדי לקדם צמיחה אקסונאלית דרך המיקרוגרובים, מומלץ שהבארות בצד הסומה יכילו יותר מדיה מאשר הבארות בצד האקסון. עם זאת, אקסונים יגדלו במקרה דרך המיקרוגרובים גם ללא הבדלי נפח.
12. לדגום את התא המיקרופלואידי ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 7-8 ימים.
    הערה: בדרך כלל ניתן לראות צמיחה של אקסונים לתוך התא האקסונאלי החל מהיום במבחנה (DIV) 5. זמני גידול ארוכים יותר אפשריים אם רוצים תרבויות בוגרות יותר.
13. הזן נוירונים כל 2-3 ימים על ידי הסרת המדיום משתי הבארות העליונות (a ו- c) והחלפתו במדיום B27-Neurobasal טרי עד ליצירת בועת מתח.

3. הכתמה עם קרום המיטוכונדריה צבע רגיש פוטנציאלי

1. ב-DIV 7-8, העריכו כי האקסונים גדלו דרך המיקרו-חריצים והתרחבו לתוך התא האקסונאלי שמתחת למיקרוסקופ אור.
   הערה: שלבי DIV שונים אפשריים גם הם בהתאם לגיל הרצוי.
2. בצע שתי שטיפות עם מדיום הדמיה מחומם מראש (37 °C) על ידי הסרת המדיום B27-Neurobasal מכל הבארות והוספת כ -100 μL של מדיום ההדמיה לבארות העליונות של הערוצים האקסונאליים והסומא (a ו - c). תנו למדיום לזרום אל הבארות התחתונות (h ו-i).
   1. מוציאים את המדיום מהבארות התחתונות ואת כל שאריות המדיום בבארות העליונות, וחוזרים על הפעולה עם מדיום טרי, ומשאירים את הבארות ריקות בסוף הכביסה.
      הערה: בשל הכוח הנימי הגבוה בתעלות (d ו-f), יישאר אמצעי שטיפה בתעלות שאין להסירו כדי למנוע מהנוירונים להתייבש. ניתן להשתמש בכל אמצעי הדמיה נטול פנול-אדום כאן, למשל, Hibernate E (ראו טבלת חומרים). אם המיקרוסקופ אינו מוגדר עם אספקת CO 2, ודא שאמצעי ההדמיה משתמש במערכת אגירה חלופית כדי קרבונט/CO₂ (לדוגמה, HEPES)⁸.
3. יש לדלל 1 mM טטרה-מתילרהודאמין אתיל אסטר (TMRE, אדום, ראו טבלת חומרים) עד 5 ננומטר במדיום ההדמיה.
   הערה: אין לחרוג מ-1% DMSO בדילול הסופי כדי למנוע רעילות.
4. הוסף 100 μL של דילול TMRE 5 ננומטר הן לבארות העליונות הסומטיות והן לבארות האקסונאליות (a ו - c), ותן למדיום לזרום דרך שני התאים הסומאטיים והאקסונאליים עד שיהיה נפח שווה בכל הבארות. מלאו את המדיום המכיל TMRE.
5. החזירו את הנוירונים לתא סביבה מבוקרת (37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂) למשך 25 דקות.
6. בצע שתי שטיפות עם מדיום ההדמיה שחומם מראש (37 °C) כפי שתואר קודם לכן (שלב 3.2). בכביסה האחרונה, מלאו 100 μL בכל באר וצרו בועת מתח של המדיום על הבארות הסומטיות (a ו - c).

4. הדמיית תאים חיים

הערה: תמונות סטילס שהוצגו נרכשו במיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב, תוך שימוש במטרת טבילה של 40x NA 1.25 (ראו טבלת חומרים). נבחרו זמן חשיפה של 200 אלפיות השנייה ועוצמת לייזר של 10% עבור הערוץ האדום וזמן חשיפה של 500 אלפיות השנייה עבור Brightfield. עם זאת, מיקרוסקופים קונפוקליים רגילים או רחבים הפוכים יכולים לשמש גם כדי לחקור את עוצמת TMRE.

1. דמיינו את התאים במיקרוסקופ הפוך.
2. ודא כי המיקרוסקופ מצויד באינקובטור שלב כדי לשמור על התרבות העצבית ב 37 מעלות צלזיוס לאורך כל הניסוי.
3. בחר אזור עניין בתא הסומטי, ועקוב אחריו דרך המיקרו-גרובים לתוך התא האקסוןאלי. ודא שהמיקרו-גרובים שצולמו תואמים לאלה שבתאים הסומטיים והאקסונאליים (להשוואה קלה יותר בין הבסיס ולאחר הטיפול).
4. צלם תמונות פלואורסצנטיות באמצעות עירור ב-561 ננומטר ופליטה ב-625 ננומטר לאות פלואורסצנטי אדום.
5. רכשו את התמונות.
6. כדי לגרום לדה-פולריזציה של המיטוכונדריה, יש להוסיף 20 μM Antimycin A (ראו טבלת חומרים) במדיום ההדמיה לתא האקסונאלי. כדי להבטיח הפרש נפח בין התאים הסומא והאקסונאליים, בדוק את נוכחותה של בועת מתח בצד הסומטי (שווה לנפח >110 μL).
   1. הסר את כל מדיום ההדמיה מהבאר התחתונה של הצד האקסונאלי (i), למעט המדיום שבתוך הערוץ (f). הוסף 160 μL של 20 μM Antimycin A לבאר האקסונאלית העליונה (c) ותן לה לזרום דרך הערוץ עד שיהיה נפח שווה בשתי הבארות האקסונליות. הנפחים בבארות אקסונאליות הם בערך 80 μL לכל באר.
      הערה: ודא שהנפח בבארות האקסונאליות קטן יותר מאשר בבארות הסומטיות כדי להבטיח לחץ נוזלים תקין. מומלץ הבדל של לפחות 10 μL (10% מנפח הבאר), אך גם הבדלים גבוהים יותר אפשריים.
7. לדגור נוירונים בתא הסביבה המבוקרת (37 מעלות צלזיוס) במשך 20-30 דקות.
8. חזור על ההדמיה כמתואר לעיל (שלבים 4.3-4.5). ודא שאותם מיקומים מצולמים (מזוהים בקלות על ידי המיקרו-גרובים) כמו במהלך הרכישה הבסיסית.

תוצאות

נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס גודלו במכשירים מיקרופלואידיים במשך 7-8 ימים לפני שהמיטוכונדריה הוכתמה בצבע הרגיש לממברנה (TMRE) במשך 25 דקות בשתי הערוצים. כפי שניתן לראות באיור 2A, זה הניב כתמים הומוגניים של המיטוכונדריה משני צידי המיקרו-גרובים, אך לא היה די בכך כדי לאזן את הכתמים...

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לזרוע ולתרבת נוירונים מנותקים בהיפוקמפוס במכשיר מיקרופלואידי לטיפול במיטוכונדריה אקסונאלית בנפרד. התועלת של גישה זו עם הצבע הרגיש לממברנה TMRE ומעכב III המורכב Antimycin A (כפי שהוכח בעבר⁷) מודגמת כאן, אך ניתן להתאים שיטה זו בקלות לצבעים מיטוכונדריאליים אח...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well Glass bottom plate	Cellvis	P06.1.5H-N	Silicone device
Antimycin A	Sigma	A8674
B27	Gibco	17504044
EVOS M5000 widefield microscope	Thermofischer Scientific	EVOS M5000	fully integrated digital widefield microscope
Hibernate E	BrainBits	HE500
Inverted spinning disk confocal	Nikon	TI2-E + CSU-W1	With incubator chamber
Laminin	Invitrogen	L2020
Microfluidic devices	XONA microfluidics	RD450
Neurobasal medium	Gibco	21103049
Poly-D-Lysine	Sigma	P2636
TMRE	Sigma	87917