Aksonal Mitokondrinin Mikroakışkanlar Yardımlı Seçici Depolarizasyonu

Özet

Mevcut protokol, nöronal mitokondrinin mikroakışkan odalarda tohumlanmasını ve boyanmasını tanımlamaktadır. Bu odalardaki akışkan basınç gradyanı, aksonlardaki mitokondrilerin, hücre gövdesi bölmesini etkilemeden farmakolojik zorluklara yanıt olarak özelliklerini analiz etmek için seçici tedavisine izin verir.

Özet

Mitokondri, nöronlardaki ATP'nin (adenozin trifosfat) birincil tedarikçileridir. Mitokondriyal disfonksiyon birçok nörodejeneratif hastalıkta sık görülen bir fenotiptir. Bazı aksonların ayrıntılı mimarisi ve aşırı uzunluğu göz önüne alındığında, aksonlardaki mitokondrilerin hücre gövdesindeki meslektaşlarına kıyasla farklı ortamlar yaşayabilmesi şaşırtıcı değildir. İlginç bir şekilde, aksonal mitokondrinin işlev bozukluğu genellikle hücre gövdesi üzerindeki etkilerden önce gelir. Aksonal mitokondriyal disfonksiyonu in vitro olarak modellemek için, mikroakışkan cihazlar somal mitokondrileri etkilemeden aksonal mitokondrinin tedavisine izin verir. Bu odalardaki akışkan basınç gradyanı, moleküllerin gradyana karşı difüzyonunu önler, böylece aksonlar içindeki lokal farmakolojik zorluklara yanıt olarak mitokondriyal özelliklerin analizine izin verir. Mevcut protokol, ayrışmış hipokampal nöronların mikroakışkan cihazlarda tohumlanmasını, membran potansiyeline duyarlı bir boya ile boyanmasını, mitokondriyal toksin ile tedaviyi ve ardından mikroskobik analizi açıklamaktadır. Aksonal biyolojiyi incelemek için bu çok yönlü yöntem, birçok farmakolojik pertürbasyona ve görüntüleme okumalarına uygulanabilir ve çeşitli nöronal alt tipler için uygundur.

Giriş

Mitokondri, nöronlardaki ATP'nin (adenozin trifosfat) ana tedarikçileridir. Nöronal sağlık mitokondriyal fonksiyonla yakından bağlantılı olduğundan, bu organellerin işlevsiz düzenlenmesinin Parkinson hastalığı¹ de dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıkların başlangıcı ile ilişkili olması şaşırtıcı değildir. Ayrıca, mitokondriyal zehirlenme, hayvanlarda Parkinson semptomlarını modellemek için başarıyla kullanılmıştır². Hem hayvan modellerinde hem de insan hastalığında, nöronların ölümü distal kısımlar ^3,4'te başlar ve aksonal mitokondrinin hakaretlere daha duyarlı olabileceğini ima eder. Bununla birlikte, aksonlardaki mitokondrinin biyolojisi, hücre gövdesi süreçlerinin eşzamanlı olarak bozulması olmadan aksonal mitokondrinin hedeflenen tedavisi ve analizi ile ilgili zorluklar nedeniyle iyi anlaşılmamıştır.

Ayrışmış nöronların in vitro kültürleme tekniklerindeki son gelişmeler artık mikroakışkan cihazlar aracılığıyla aksonların ve hücre cisimlerinin akışkan olarak ayrılmasına izin vermektedir⁵. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, bu cihazlar her bir çifti (d ve f) birbirine bağlayan iki kanala sahip dört erişim kuyusuna (a / s ve c / i) sahiptir. Büyük kanallar birbirine 450 μm uzunluğundaki bir dizi mikro kanal (e) ile bağlanır. İki oda arasındaki dolum seviyelerindeki kasıtlı farklılıklar, küçük moleküllerin daha düşük sıvı seviyesine sahip kanaldan diğer tarafa difüzyonunu önleyen bir sıvı basınç gradyanı oluşturur (Şekil 1B) (Şekil 1C, Tripan mavisi boya ile gösterilmiştir).

Son zamanlarda, aksonal mitofajideki yerel çeviri gereksinimlerini, hasarlı mitokondri 6'nın seçici olarak uzaklaştırılmasını incelemek için mikroakışkan cihazlar^kullandık. Bu protokolde, mitokondriyal kompleks III inhibitörü Antimisin A ^6,7 kullanılarak aksonların seçici tedavisi yoluyla lokal mitokondriyal hasarı indüklemek için farklı adımlar sunulmuştur.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Yukarı Bavyera Hükümeti'nin ilgili yönergeleri ve düzenlemeleri uyarınca gerçekleştirilmiştir. Primer nöronlar, daha önce tarif edildiği gibi standart yöntemler izlenerek her iki cinsiyetten E16.5 C57BL / 6 vahşi tip fare embriyolarından hazırlandı⁶.

1. Mikroakışkan cihazın montajı

1. PBS'de (fosfat tamponlu salin) 20 μg / mL Poli-D-Lizin ve 3.4 μg / mL Laminin nihai konsantrasyonu ile altı kuyucuklu bir cam tabanlı doku kültürü plakasını kaplayın (bkz.
2. Kaplanmış plakayı oda sıcaklığında karanlıkta gece boyunca inkübe edin.
   NOT: Kaplama, 37 °C'de 1-2 saat boyunca da yapılabilir. Kaplamanın seçimi, kullanılan hücre tipine bağlıdır.
3. Kaplamadan sonra, altı delikli plakaları steril davlumbaza getirin ve steril ddH₂O ile iki kez yıkayın.
   NOT: PBS gibi tuz içeren tamponlarla yıkamayın, çünkü tuz kristalleri conta oluşumuna müdahale edecektir.
4. Plakanın 3-5 dakika boyunca eğimli bir konumda kurumasını bekleyin. Fazla suyu vakum emme veya pipetleme ile temizleyin.
5. Mikroakışkan odasını %80 etanol ile ıslatın.
   NOT: Mikroakışkan haznesi ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).
6. Mikroakışkan haznenin eğimli bir konumda 3-5 dakika kurumasını bekleyin. Fazla etanolün vakum, emme veya pipetleme yoluyla çıkarılması.
7. Tamamen kuruduğunda, mikroakışkan odayı kuyunun ortasına yerleştirin.
   NOT: Contanın oluşumu, plaka ile silikon cihaz arasındaki arayüzden havanın çıkarılması üzerine yansıtıcı özelliklerde bir değişiklik olarak gözlemlenebilir. Hem plaka hem de mikroakışkan hazne, iyi bir sızdırmazlık oluşturmak için montajdan önce tamamen kuru olmalıdır. Bununla birlikte, hücrelere uygun yapışmayı sağlamak için kuruma süresinin mümkün olduğunca en aza indirilmesi gerekir. Bu nedenle, kuyular ve odalar kalan sıvı damlacıkları için görsel olarak incelenmelidir. Hiçbir damlacık görünmüyorsa, odaları hemen monte edin.
8. Cam plakaya düzgün bir şekilde tutturulması için kenarlıklarındaki mikroakışkan haznesine ve ortasındaki mikro oluk bölümüne hafifçe dokunun.

2. Nöronların tohumlanması ve bakımı

1. 1.5 mL'lik bir reaksiyon tüpünde oda başına istenen sayıda ayrışmış hipokampal nöron toplayın.
   NOT: Bu çalışmada, görüntüleme tabanlı uygulamalar için cihaz başına 1.5 x 10⁵ nöron tohumlanmıştır.
2. Nöronları oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüj yapın.
3. Süpernatantı bir pipetle atın ve peleti 8 μL B27-Nörobazal ortamda yeniden askıya alın (bkz.
4. Hücre çözeltisini mikroakışkan haznenin kanal girişine pipetleyin (Şekil 1A'da b).
5. Kanaldan akışa yardımcı olmak için plakanın arkasına dokunun.
   NOT: Dokunma, contanın kırılacağından endişe etmeden oldukça güçlü bir şekilde yapılabilir.
6. Kanal dışındaki hücre sayısını azaltmak için kanalın çıkışında kalan hücre süspansiyonunu (Şekil 1A'daki g) pipetle aspire edin.
7. Mikroakışkan odasını hücrelerle 37 ° C'de 15-20 dakika ve% 5 CO_{2'de inkübe edin.}
8. Üst aksonal kuyuyu 50 μL B27-Nörobazal ortam ile doldurun (Şekil 1A'daki c).
9. Kanaldan akışa yardımcı olmak için plakanın arkasına dokunun.
10. Soma tarafındaki kuyucukları (Şekil 1A'daki a ve h) her biri 150 μL B27-Nörobazal medya ile doldurun ve üstte bir gerilim balonu oluşturun. Balonun hacmi yaklaşık 20 μL'dir.
    NOT: Akışkan izolasyon elde etmek için bir gerilim kabarcığı oluşturmak gerekli değildir, ancak soma tarafındaki daha yüksek hacmin net bir görüntüsünü sağlar.
11. Aksonal tarafın her iki kuyusunu da (Şekil 1A'daki c ve i) her biri 100 μL B27-Nörobazal medya ile doldurun.
    NOT: Mikro oluklar yoluyla aksonal büyümeyi teşvik etmek için, soma tarafındaki kuyucukların akson tarafındaki kuyulardan daha fazla ortam içermesi önerilir. Bununla birlikte, aksonlar tesadüfen hacim farklılıkları olmadan bile mikro oluklar boyunca büyüyeceklerdir.
12. Mikroakışkan odasını 7-8 gün boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de inkübe edin.
    NOT: Aksonların aksonal kamaraya doğru büyümesi genellikle in vitro (DIV) 5 gününden itibaren gözlemlenebilir. Daha olgun kültürler isteniyorsa daha uzun kültürleme süreleri mümkündür.
13. Her 2-3 günde bir, ortamı iki üst kuyucuktan (a ve c) çıkararak ve bir gerilim kabarcığı oluşana kadar taze B27-Nörobazal ortam ile değiştirerek nöronları besleyin.

3. Mitokondriyal membran potansiyel hassas boya ile boyama

1. DIV 7-8'de, aksonların mikro oluklardan büyüdüğünü ve bir ışık mikroskobunun altındaki aksonal bölmeye uzandığını değerlendirin.
   NOT: İstenilen yaşa bağlı olarak farklı DIV aşamaları da mümkündür.
2. B27-Neurobazal ortamı tüm kuyucuklardan çıkararak ve görüntüleme ortamının yaklaşık 100 μL'sini hem aksonal hem de soma kanallarının (a ve c) üst kuyucuklarına ekleyerek önceden ısıtılmış görüntüleme ortamı (37 ° C) ile iki yıkama gerçekleştirin. Ortamın alt kuyucuklara (h ve i) akmasına izin verin.
   1. Ortamı alt kuyucuklardan ve üst kuyucuklardaki artık ortamdan çıkarın ve yıkamanın sonunda kuyucukları boş bırakarak taze ortamla tekrarlayın.
      NOT: Kanallardaki (d ve f) yüksek kılcal kuvvet nedeniyle, nöronların kurumasını önlemek için kanallarda çıkarılmaması gereken kalan bir yıkama ortamı olacaktır. Herhangi bir fenol kırmızısı içermeyen görüntüleme ortamı burada kullanılabilir, örneğin, Hazırda Bekletme E (bkz. Mikroskop bir CO 2 beslemesi ile kurulmamışsa, görüntüleme ortamının karbonat / CO_2'ye (örneğin, HEPES)^8'e alternatif bir tamponlama sistemi kullandığından emin olun.
3. Görüntüleme ortamında 1 mM tetrametilrodamin etil ester (TMRE, kırmızı, bakınız Malzeme Tablosu) stoğunu 5 nM'ye kadar seyreltin.
   NOT: Toksisiteyi önlemek için son seyreltmede %1 DMSO'yu geçmeyin.
4. Hem somatik hem de aksonal üst kuyucuklara (a ve c) 5 nM TMRE seyreltmenin 100 μL'sini ekleyin ve ortamın tüm kuyucuklarda eşit bir hacim olana kadar hem somatik hem de aksonal bölmelerden akmasına izin verin. TMRE içeren ortamla doldurun.
5. Nöronları 25 dakika boyunca kontrollü bir ortam odasına (37 ° C ve% 5 CO₂) geri yerleştirin.
6. Önceden ısıtılmış görüntüleme ortamı (37 °C) ile daha önce açıklandığı gibi iki yıkama yapın (adım 3.2). Son yıkamada, her bir kuyucukta 100 μL ile doldurun ve somatik kuyucuklarda (a ve c) ortamın bir gerilim kabarcığı oluşturun.

4. Canlı hücre görüntüleme

NOT: Gösterilen durağan görüntüler, dönen disk konfokal mikroskopta, 40x NA 1.25 daldırma hedefi kullanılarak elde edilmiştir (bkz. Kırmızı kanal için 200 ms pozlama süresi ve %10 lazer gücü ve parlak alan için 500 ms pozlama süresi seçildi. Bununla birlikte, TMRE yoğunluğunu incelemek için düzenli konfokal veya geniş alan ters mikroskoplar da kullanılabilir.

1. Hücreleri ters çevrilmiş bir mikroskopla görüntüleyin.
2. Mikroskopun, deney boyunca nöronal kültürü 37 ° C'de tutmak için bir sahne inkübatörü ile donatıldığından emin olun.
3. Somatik bölmede ilgilendiğiniz bir bölge seçin ve mikro oluklardan aksonal bölmeye kadar takip edin. Görüntülenen mikro olukların somatik ve aksonal bölmelerdekilerle eşleştiğinden emin olun (daha kolay taban çizgisi ve tedavi sonrası karşılaştırma için).
4. Kırmızı floresan sinyali için 561 nm'de uyarma ve 625 nm'de emisyon kullanarak floresan görüntüleri yakalayın.
5. Görüntüleri edinin.
6. Mitokondriyal depolarizasyonu indüklemek için, görüntüleme ortamında aksonal bölmeye 20 μM Antimisin A (bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin. Soma ve aksonal odalar arasında hacim farkı sağlamak için, somatik tarafta bir gerilim kabarcığının varlığını kontrol edin (hacim >110 μL'ye eşittir).
   1. Kanal (f) içindeki ortam hariç, aksonal tarafın (i) alt boşluğundan tüm görüntüleme ortamını çıkarın. Üst aksonal kuyucuğa (c) 160 μL 20 μM Antimisin A ekleyin ve her iki aksonal kuyuda eşit bir hacim olana kadar kanaldan akmasına izin verin. Aksonal kuyulardaki hacimler kuyu başına kabaca 80 μL'dir.
      NOT: Uygun sıvı basıncını sağlamak için aksonal kuyulardaki hacmin somatik kuyucuklardan daha küçük olduğundan emin olun. En az 10 μL'lik (kuyu hacminin% 10'u) bir fark önerilir, ancak daha yüksek farklılıklar da mümkündür.
7. Nöronları kontrollü çevre odasında (37 ° C) 20-30 dakika boyunca inkübe edin.
8. Görüntülemeyi yukarıda açıklandığı gibi tekrarlayın (adım 4.3-4.5). Temel alma sırasında olduğu gibi aynı konumların görüntülendiğinden (mikro oluklar tarafından kolayca tanımlanabildiğinden) emin olun.

Sonuçlar

Primer hipokampal nöronlar, mitokondrilerin her iki kanalda da 25 dakika boyunca membrana duyarlı boya (TMRE) ile boyanmasından önce 7-8 gün boyunca mikroakışkan cihazlarda yetiştirildi. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, bu, mikroolukların her iki tarafında homojen mitokondri boyanmasına neden oldu, ancak boyamayı mikro olukların ortasına dengelemek için yetersizdi. Aksonal tarafa Antimisin A eklenmesi üzerine, somal mitokondri TMRE sinyalini korudu (Şekil

Tartışmalar

Mevcut protokol, aksonal mitokondrileri ayrı ayrı tedavi etmek için mikroakışkan bir cihazda ayrışmış hipokampal nöronları tohumlamak ve kültürlemek için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yaklaşımın membrana duyarlı boya TMRE ve kompleks III inhibitörü Antimisin A (daha önce gösterildiği gibi⁷) ile faydası burada gösterilmiştir, ancak bu yöntem diğer mitokondriyal boyalara veya lokal, mikroskopi tabanlı okumalara izin veren mitokondriyal fonksiyonların genetik olarak...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well Glass bottom plate	Cellvis	P06.1.5H-N	Silicone device
Antimycin A	Sigma	A8674
B27	Gibco	17504044
EVOS M5000 widefield microscope	Thermofischer Scientific	EVOS M5000	fully integrated digital widefield microscope
Hibernate E	BrainBits	HE500
Inverted spinning disk confocal	Nikon	TI2-E + CSU-W1	With incubator chamber
Laminin	Invitrogen	L2020
Microfluidic devices	XONA microfluidics	RD450
Neurobasal medium	Gibco	21103049
Poly-D-Lysine	Sigma	P2636
TMRE	Sigma	87917