Aksonal Mitokondrinin Mikroakışkanlar Yardımlı Seçici Depolarizasyonu

Özet

Mevcut protokol, nöronal mitokondrinin mikroakışkan odalarda tohumlanmasını ve boyanmasını tanımlamaktadır. Bu odalardaki akışkan basınç gradyanı, aksonlardaki mitokondrilerin, hücre gövdesi bölmesini etkilemeden farmakolojik zorluklara yanıt olarak özelliklerini analiz etmek için seçici tedavisine izin verir.

Özet

Mitokondri, nöronlardaki ATP'nin (adenozin trifosfat) birincil tedarikçileridir. Mitokondriyal disfonksiyon birçok nörodejeneratif hastalıkta sık görülen bir fenotiptir. Bazı aksonların ayrıntılı mimarisi ve aşırı uzunluğu göz önüne alındığında, aksonlardaki mitokondrilerin hücre gövdesindeki meslektaşlarına kıyasla farklı ortamlar yaşayabilmesi şaşırtıcı değildir. İlginç bir şekilde, aksonal mitokondrinin işlev bozukluğu genellikle hücre gövdesi üzerindeki etkilerden önce gelir. Aksonal mitokondriyal disfonksiyonu in vitro olarak modellemek için, mikroakışkan cihazlar somal mitokondrileri etkilemeden aksonal mitokondrinin tedavisine izin verir. Bu odalardaki akışkan basınç gradyanı, moleküllerin gradyana karşı difüzyonunu önler, böylece aksonlar içindeki lokal farmakolojik zorluklara yanıt olarak mitokondriyal özelliklerin analizine izin verir. Mevcut protokol, ayrışmış hipokampal nöronların mikroakışkan cihazlarda tohumlanmasını, membran potansiyeline duyarlı bir boya ile boyanmasını, mitokondriyal toksin ile tedaviyi ve ardından mikroskobik analizi açıklamaktadır. Aksonal biyolojiyi incelemek için bu çok yönlü yöntem, birçok farmakolojik pertürbasyona ve görüntüleme okumalarına uygulanabilir ve çeşitli nöronal alt tipler için uygundur.

Giriş

Mitokondri, nöronlardaki ATP'nin (adenozin trifosfat) ana tedarikçileridir. Nöronal sağlık mitokondriyal fonksiyonla yakından bağlantılı olduğundan, bu organellerin işlevsiz düzenlenmesinin Parkinson hastalığı¹ de dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıkların başlangıcı ile ilişkili olması şaşırtıcı değildir. Ayrıca, mitokondriyal zehirlenme, hayvanlarda Parkinson semptomlarını modellemek için başarıyla kullanılmıştır². Hem hayvan modellerinde hem de insan hastalığında, nöronların ölümü distal kısımlar ^3,4'te başlar ve aksonal mito....

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Yukarı Bavyera Hükümeti'nin ilgili yönergeleri ve düzenlemeleri uyarınca gerçekleştirilmiştir. Primer nöronlar, daha önce tarif edildiği gibi standart yöntemler izlenerek her iki cinsiyetten E16.5 C57BL / 6 vahşi tip fare embriyolarından hazırlandı⁶.

1. Mikroakışkan cihazın montajı

1. PBS'de (fosfat tamponlu salin) 20 μg / mL Poli-D-Lizin ve 3.4 μg / mL Laminin nihai konsantrasyonu ile altı kuyucuklu bir cam tabanlı doku kültürü plakasını kaplayın (bkz.
2. Kaplanmış plakayı oda sıcaklığında karanlıkta gece boyunca inkübe edin.
   NOT: Kaplama, 37 °....

Sonuçlar

Primer hipokampal nöronlar, mitokondrilerin her iki kanalda da 25 dakika boyunca membrana duyarlı boya (TMRE) ile boyanmasından önce 7-8 gün boyunca mikroakışkan cihazlarda yetiştirildi. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, bu, mikroolukların her iki tarafında homojen mitokondri boyanmasına neden oldu, ancak boyamayı mikro olukların ortasına dengelemek için yetersizdi. Aksonal tarafa Antimisin A eklenmesi üzerine, somal mitokondri TMRE sinyalini korudu (Şekil

Tartışmalar

Mevcut protokol, aksonal mitokondrileri ayrı ayrı tedavi etmek için mikroakışkan bir cihazda ayrışmış hipokampal nöronları tohumlamak ve kültürlemek için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yaklaşımın membrana duyarlı boya TMRE ve kompleks III inhibitörü Antimisin A (daha önce gösterildiği gibi⁷) ile faydası burada gösterilmiştir, ancak bu yöntem diğer mitokondriyal boyalara veya lokal, mikroskopi tabanlı okumalara izin veren mitokondriyal fonksiyonların genetik olarak.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well Glass bottom plate	Cellvis	P06.1.5H-N	Silicone device
Antimycin A	Sigma	A8674
B27	Gibco	17504044
EVOS M5000 widefield microscope	Thermofischer Scientific	EVOS M5000	fully integrated digital widefield microscope
Hibernate E	BrainBits	HE500
Inverted spinning disk confocal	Nikon	TI2-E + CSU-W1	With incubator chamber
Laminin	Invitrogen	L2020
Microfluidic devices	XONA microfluidics	RD450
Neurobasal medium	Gibco	21103049
Poly-D-Lysine	Sigma	P2636
TMRE	Sigma	87917