Dépolarisation sélective des mitochondries axonales assistée par microfluidique

Résumé

Le présent protocole décrit l’ensemencement et la coloration des mitochondries neuronales dans des chambres microfluidiques. Le gradient de pression fluidique dans ces chambres permet le traitement sélectif des mitochondries dans les axones pour analyser leurs propriétés en réponse à des défis pharmacologiques sans affecter le compartiment du corps cellulaire.

Résumé

Les mitochondries sont les principaux fournisseurs d’ATP (adénosine triphosphate) dans les neurones. Le dysfonctionnement mitochondrial est un phénotype courant dans de nombreuses maladies neurodégénératives. Compte tenu de l’architecture élaborée et de la longueur extrême de certains axones, il n’est pas surprenant que les mitochondries dans les axones puissent connaître des environnements différents de ceux de leurs homologues du corps cellulaire. Fait intéressant, le dysfonctionnement des mitochondries axonales précède souvent les effets sur le corps cellulaire. Pour modéliser le dysfonctionnement mitochondrial axonal in vitro, des dispositifs microfluidiques permettent de traiter les mitochondries axonales sans affecter les mitochondries somales. Le gradient de pression fluidique dans ces chambres empêche la diffusion des molécules contre le gradient, permettant ainsi l’analyse des propriétés mitochondriales en réponse aux défis pharmacologiques locaux au sein des axones. Le protocole actuel décrit l’ensemencement des neurones dissociés de l’hippocampe dans des dispositifs microfluidiques, la coloration avec un colorant sensible au potentiel membranaire, le traitement avec une toxine mitochondriale et l’analyse microscopique subséquente. Cette méthode polyvalente pour étudier la biologie axonale peut être appliquée à de nombreuses perturbations pharmacologiques et lectures d’imagerie, et convient à plusieurs sous-types neuronaux.

Introduction

Les mitochondries sont les principaux fournisseurs d’ATP (adénosine triphosphate) dans les neurones. Comme la santé neuronale est intimement liée à la fonction mitochondriale, il n’est pas surprenant que la régulation dysfonctionnelle de ces organites ait été associée à l’apparition de diverses maladies neurodégénératives, dont la maladie de Parkinson¹. De plus, l’intoxication mitochondriale a été utilisée avec succès pour modéliser les symptômes parkinsoniens chez les animaux². Dans les modèles animaux et les maladies humaines, la disparition des neurones commence aux parties distales^{3,4, ce} qui suggère que les mitochondries axonales pourraient être plus sensibles aux insultes. Cependant, la biologie des mitochondries dans les axones n’est pas bien comprise en raison des difficultés associées au traitement ciblé et à l’analyse des mitochondries axonales sans perturbation simultanée des processus du corps cellulaire.

Les progrès récents dans les techniques de culture de neurones dissociés in vitro permettent maintenant la séparation fluidique des axones et des corps cellulaires grâce à des dispositifs microfluidiques⁵. Comme le montre la figure 1A, ces dispositifs comportent quatre puits d’accès (a/h et c/i), avec deux canaux reliant chaque paire (d et f). Les grands canaux sont reliés entre eux par une série de microcanaux de 450 μm de long (e). Les différences intentionnelles dans les niveaux de remplissage entre les deux chambres créent un gradient de pression du fluide (Figure 1B) qui empêche la diffusion de petites molécules du canal avec un niveau de fluide inférieur de l’autre côté (Figure 1C, illustrée avec un colorant bleu trypan).

Nous avons récemment utilisé des dispositifs microfluidiques pour étudier les besoins de traduction locale en mitophagie axonale, l’élimination sélective des mitochondries endommagées⁶. Dans le présent protocole, différentes étapes sont présentées pour induire des lésions mitochondriales locales par traitement sélectif des axones à l’aide de l’inhibiteur du complexe mitochondrial III Antimycine A ^6,7.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux directives et réglementations pertinentes du gouvernement de Haute-Bavière. Les neurones primaires ont été préparés à partir d’embryons de souris sauvages E16.5 C57BL/6 des deux sexes selon les méthodes standard décrites précédemment⁶.

1. Assemblage du dispositif microfluidique

1. Enduire une plaque de culture tissulaire à fond de verre à six puits avec une concentration finale de 20 μg/mL de poly-D-lysine et de 3,4 μg/mL de laminine dans du PBS (solution saline tamponnée au phosphate) (voir le tableau des matériaux).
2. Incuber la plaque enduite pendant une nuit dans l’obscurité à température ambiante.
   REMARQUE: Le revêtement peut également être effectué à 37 ° C pendant 1-2 h. Le choix du revêtement dépend du type de cellule utilisé.
3. Après le revêtement, amenez les plaques à six puits dans la hotte stérile et lavez-les deux fois avec du ddH₂O stérile.
   REMARQUE: Ne pas laver avec des tampons contenant du sel tels que le PBS, car les cristaux de sel interféreront avec la formation des joints.
4. Laissez la plaque sécher en position inclinée pendant 3 à 5 minutes. Éliminer l’excès d’eau par aspiration sous vide ou pipetage.
5. Faire tremper la chambre microfluidique dans de l’éthanol à 80%.
   REMARQUE : La chambre microfluidique a été obtenue à partir de sources commerciales (voir le tableau des matériaux).
6. Laissez sécher la chambre microfluidique pendant 3 à 5 minutes en position inclinée. Éliminer l’excès d’éthanol par aspiration, aspiration ou pipetage.
7. Lorsqu’il est complètement sec, placez la chambre microfluidique au centre du puits.
   NOTE: La formation du joint peut être observée comme un changement dans les propriétés réfléchissantes lors de l’exclusion de l’air de l’interface entre la plaque et le dispositif en silicone. La plaque et la chambre microfluidique doivent être complètement sèches avant l’assemblage pour créer une bonne étanchéité. Cependant, le temps de séchage doit être minimisé autant que possible pour assurer une bonne adhérence aux cellules. Par conséquent, les puits et les chambres doivent être inspectés visuellement pour détecter les gouttelettes de liquide restantes. Si aucune gouttelette n’est visible, assemblez immédiatement les chambres.
8. Tapotez doucement la chambre microfluidique à ses bordures et la section microrainure au milieu pour une fixation appropriée à la plaque de verre.

2. Ensemencement et maintien des neurones

1. Recueillir le nombre désiré de neurones dissociés de l’hippocampe par chambre dans un tube de réaction de 1,5 mL.
   REMARQUE: Pour la présente étude, 1,5 x 10⁵ neurones ont été ensemencés par dispositif pour des applications basées sur l’imagerie.
2. Centrifuger les neurones à 1000 x g pendant 4 min à température ambiante.
3. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre en suspension la pastille dans 8 μL de milieu B27-neurobasal (voir le tableau des matériaux).
4. Introduire à la pipette la solution cellulaire dans l’entrée du canal de la chambre microfluidique (b sur la figure 1A).
5. Tapotez à l’arrière de la plaque pour faciliter l’écoulement dans le canal.
   REMARQUE: Le tapotement peut être effectué avec force sans craindre que le sceau ne se brise.
6. Aspirer à l’aide d’une pipette toute suspension cellulaire restante à la sortie du canal (g sur la figure 1A) pour diminuer le nombre de cellules à l’extérieur du canal.
7. Incuber la chambre microfluidique avec des cellules pendant 15-20 min à 37 °C et 5% de CO_2.
8. Remplir le puits axonal supérieur avec 50 μL de milieu B27-Neurobasal (c sur la figure 1A).
9. Tapotez à l’arrière de la plaque pour faciliter l’écoulement dans le canal.
10. Remplissez les puits du côté soma (a et h sur la figure 1A) avec 150 μL de milieu B27-Neurobasal chacun, créant une bulle de tension sur le dessus. Le volume de la bulle est d’environ 20 μL.
    REMARQUE: La création d’une bulle de tension n’est pas nécessaire pour obtenir une isolation fluidique, mais elle fournit une vision claire du volume plus élevé du côté soma.
11. Remplir les deux puits de la face axonale (c et i sur la figure 1A) avec 100 μL de milieu B27-neurobasal chacun.
    REMARQUE: Pour favoriser la croissance axonale à travers les microrainures, il est recommandé que les puits du côté soma contiennent plus de milieux que les puits du côté axonal. Cependant, les axones se développeront par hasard à travers les microrainures même sans différences de volume.
12. Incuber la chambre microfluidique à 37 °C et 5% de CO₂ pendant 7-8 jours.
    REMARQUE: La croissance des axones dans la chambre axonale peut généralement être observée à partir du jour in vitro (DIV) 5. Des périodes de culture plus longues sont possibles si des cultures plus matures sont souhaitées.
13. Nourrir les neurones tous les 2-3 jours en retirant le milieu des deux puits supérieurs (a et c) et en le remplaçant par un milieu B27-neurobasal frais jusqu’à ce qu’une bulle de tension se forme.

3. Coloration avec un colorant sensible potentiel de la membrane mitochondriale

1. À DIV 7-8, évaluer que les axones ont grandi à travers les microrainures et s’étendent dans le compartiment axonal sous un microscope optique.
   REMARQUE: Différents stades DIV sont également possibles en fonction de l’âge souhaité.
2. Effectuer deux lavages avec un milieu imageur préchauffé (37 °C) en retirant le milieu B27-Neurobasal de tous les puits et en ajoutant environ 100 μL du milieu imageur aux puits supérieurs des canaux axonal et soma (a et c). Laissez le milieu s’écouler vers les puits inférieurs (h et i).
   1. Retirer le milieu des puits inférieurs et tout milieu restant dans les puits supérieurs, et répéter avec un milieu frais, en laissant les puits vides à la fin du lavage.
      REMARQUE: En raison de la force capillaire élevée dans les canaux (d et f), il restera un produit de lavage dans les canaux qui ne doit pas être retiré pour empêcher les neurones de sécher. Tout milieu d’imagerie sans rouge de phénol peut être utilisé ici, par exemple, Hibernate E (voir le tableau des matériaux). Si le microscope n’est pas équipé d’une alimentation en CO 2, s’assurer que le milieu d’imagerie utilise un système tampon alternatif au carbonate/CO₂ (p. ex., HEPES)⁸.
3. Diluer 1 mM d’ester éthylique de tétraméthylrhodamine (TMRE, rouge, voir le tableau des matières) à 5 nM dans le milieu imageur.
   NOTA: Ne pas dépasser 1% de DMSO dans la dilution finale pour éviter toute toxicité.
4. Ajouter 100 μL de la dilution TMRE de 5 nM aux puits supérieurs somatiques et axonaux (a et c) et laisser le milieu s’écouler à travers les compartiments somatique et axonal jusqu’à ce qu’il y ait un volume égal dans tous les puits. Faites le plein avec le milieu contenant TMRE.
5. Replacez les neurones dans une chambre à environnement contrôlé (37 °C et 5% de CO₂) pendant 25 min.
6. Effectuer deux lavages avec le milieu imageur préchauffé (37 °C) comme décrit précédemment (étape 3.2). Lors du dernier lavage, remplir 100 μL dans chaque puits et créer une bulle de tension du milieu sur les puits somatiques (a et c).

4. Imagerie de cellules vivantes

REMARQUE : Les images fixes présentées ont été acquises sur un microscope confocal à disque rotatif, à l’aide d’un objectif d’immersion 40x NA 1,25 (voir le tableau des matériaux). Un temps d’exposition de 200 ms et une puissance laser de 10 % pour le canal rouge et un temps d’exposition de 500 ms pour le fond clair ont été choisis. Cependant, des microscopes confocaux ou inversés à grand champ ordinaires peuvent également être utilisés pour étudier l’intensité de l’EMRT.

1. Imagez les cellules avec un microscope inversé.
2. Assurez-vous que le microscope est équipé d’un incubateur de scène pour maintenir la culture neuronale à 37 °C tout au long de l’expérience.
3. Sélectionnez une région d’intérêt dans le compartiment somatique et suivez-la à travers les microsillons dans le compartiment axonal. Assurez-vous que les microrainures imagées correspondent à celles des compartiments somatique et axonal (pour faciliter la comparaison de base et post-traitement).
4. Capturez des images de fluorescence en utilisant l’excitation à 561 nm et l’émission à 625 nm pour le signal de fluorescence rouge.
5. Acquérir les images.
6. Pour induire une dépolarisation mitochondriale, ajouter 20 μM d’antimycine A (voir le tableau des matériaux) dans le milieu d’imagerie au compartiment axonal. Pour assurer une différence de volume entre le soma et la chambre axonale, vérifier la présence d’une bulle de tension du côté somatique (égale au volume >110 μL).
   1. Retirer tout milieu imageur du puits inférieur de la face axonale (i), à l’exception du milieu à l’intérieur du canal (f). Ajouter 160 μL d’antimycine A 20 μM au puits axonal supérieur (c) et laisser s’écouler dans le canal jusqu’à ce qu’il y ait un volume égal dans les deux puits axonaux. Les volumes dans les puits axonaux sont d’environ 80 μL par puits.
      REMARQUE: Assurez-vous que le volume dans les puits axonaux est plus petit que dans les puits somatiques pour assurer une pression de fluide appropriée. Une différence d’au moins 10 μL (10% du volume du puits) est recommandée, mais des différences plus élevées sont également possibles.
7. Incuber les neurones dans la chambre à environnement contrôlé (37 °C) pendant 20-30 min.
8. Répétez l’imagerie comme décrit ci-dessus (étapes 4.3-4.5). Assurez-vous que les mêmes positions sont imagées (facilement identifiables par les microrainures) que lors de l’acquisition de la ligne de base.

Résultats

Les neurones primaires de l’hippocampe ont été cultivés dans des dispositifs microfluidiques pendant 7 à 8 jours avant que les mitochondries ne soient colorées avec le colorant sensible à la membrane (TMRE) pendant 25 minutes dans les deux canaux. Comme le montre la figure 2A, cela a donné une coloration homogène des mitochondries des deux côtés des microrainures, mais elle était insuffisante pour équilibrer la coloration au milieu des microrainures. Lors de l’ajout de l’an...

Discussion

Le présent protocole décrit une méthode pour ensemencer et cultiver des neurones hippocampiques dissociés dans un dispositif microfluidique pour traiter séparément les mitochondries axonales. L’utilité de cette approche avec le colorant TMRE sensible à la membrane et l’inhibiteur complexe III Antimycin A (comme démontré précédemment⁷) est démontrée ici, mais cette méthode peut être facilement adaptée à d’autres colorants mitochondriaux ou capteurs génétiquement codés des...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well Glass bottom plate	Cellvis	P06.1.5H-N	Silicone device
Antimycin A	Sigma	A8674
B27	Gibco	17504044
EVOS M5000 widefield microscope	Thermofischer Scientific	EVOS M5000	fully integrated digital widefield microscope
Hibernate E	BrainBits	HE500
Inverted spinning disk confocal	Nikon	TI2-E + CSU-W1	With incubator chamber
Laminin	Invitrogen	L2020
Microfluidic devices	XONA microfluidics	RD450
Neurobasal medium	Gibco	21103049
Poly-D-Lysine	Sigma	P2636
TMRE	Sigma	87917