JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا للكشف البصري عالي الدقة عن المعلومات الكيميائية حول الأجهزة الطبية المزروعة باستخدام التصوير الكيميائي للتلألؤ المتحمس بالأشعة السينية (XELCI). تم تطوير تقنية التصوير الجديدة هذه في مختبرنا والتي تتيح دراسة الكيمياء الحيوية للعدوى المرتبطة بالزرع.

Abstract

تعد العدوى الميكروبية المرتبطة بالأجهزة الطبية القابلة للزرع مصدر قلق كبير في فشل تثبيت الكسور. سيسمح التشخيص المبكر لهذه العدوى بالاستئصال الناجح بالمضادات الحيوية دون تكلفة إضافية لإجراء عملية جراحية ثانية. هنا ، نصف XELCI كتقنية ذات دقة عالية للأشعة السينية ، وخصوصية الزرع ، والحساسية الكيميائية للتركيزات الكيميائية للصور غير الغازية بالقرب من سطح الأجهزة الطبية المزروعة. الأجهزة مطلية بأسطح الإبلاغ الكيميائي. يتكون هذا السطح المستجيب كيميائيا من طبقتين مطليتين بجهاز طبي قابل للزرع. طبقة حساسة لدرجة الحموضة (بروموثيمول أزرق أو بروموكيسول أخضر هيدروجيل مدمج) مغلفة فوق طبقة وميض باعث للضوء الأحمر (Gd 2 O2S:Eu) للمراقبة. يشع شعاع الأشعة السينية المركز بقعة على الغرسة ، وينتقل الضوء الأحمر الناتج عن الوميض (مع قمم 620 نانومتر و 700 نانومتر) عبر طبقة الاستشعار التي تغير النسبة الطيفية اعتمادا على الرقم الهيدروجيني. يتم إنشاء صورة عن طريق مسح شعاع الأشعة السينية عبر الغرسة وقياس النسبة الطيفية للضوء الذي يمر عبر الأنسجة نقطة تلو الأخرى. استخدمنا تقنية التصوير هذه لمراقبة الالتهابات المرتبطة بالزرع سابقا على سطح عظم الفخذ باستخدام مستشعر لوحة قابل للزرع معدل. الآن نحن ندرس تغيرات الأس الهيدروجيني التي تحدث من عدوى قضيب الظنبوب داخل النخاع. يتم استخدام نوعين مختلفين من تصميمات القضبان داخل النخاع في دراسات الأرانب قبل التجربة ، وعلمنا أنه يمكن استخدام تقنية XELCI لمراقبة أي تغييرات كيميائية تحدث ليس فقط على سطح العظام ولكن أيضا داخل العظام. وبالتالي ، فإن هذا يتيح تصوير الأس الهيدروجيني المحلي غير الجراحي والدقة المكانية العالية والخلفية المنخفضة لدراسة الكيمياء الحيوية للعدوى المرتبطة بالزرع.

Introduction

في الولايات المتحدة ، يتم إدخال حوالي 2 مليون جهاز تثبيت للكسر سنويا ، ويؤدي 5٪ -10٪ منها إلى التهابات مرتبطة بالزرع1. يصعب علاج هذه العدوى بالمضادات الحيوية في مراحل لاحقة بسبب عدم التجانس والطبيعة المقاومة للمضادات الحيويةللأغشية الحيوية 2,3. إذا تم تشخيصها مبكرا ، يمكن علاج العدوى بالمضادات الحيوية والتنضير الجراحي لمنع التكاليف الطبية الإضافية لإجراء عملية جراحية ثانية لاستبدال الأجهزة في موقع الكسر المعالج. يتم تطبيق التصوير الشعاعي العادي وتقنيات التصوير الشعاعي المتقدمة الأخرى في تشخيص الالتهابات المرتبطة بزراعة العظام ، وعدم النقابات ، والمضاعفات ذات الصلة. على الرغم من أن هذه التقنيات تستخدم بشكل متكرر للحصول على معلومات هيكلية للعظام والأنسجة المحيطة في زرع العظام ، إلا أنها غير قادرة على توفير معلومات كيميائية حيوية في بيئة معينة. وهكذا، قمنا بتطوير تقنية جديدة للتصوير الكيميائي بأشعة سينية (XELCI) للتصوير عالي الدقة للمعلومات الكيميائية الحيوية بشكل غير جراحي في موقع الزرع. عادة ما يتم تشخيص الالتهابات المرتبطة بزراعة العظام بوسيلة واحدة أو مجموعة من الوسائل المختلفة. تشير الملاحظات السريرية (الألم ، التورم ، الاحمرار ، إفراز الجرح ، إلخ) إلى العلامات الأولى للعدوى. في وقت لاحق ، يتم إجراء التجارب الإشعاعية والمخبرية لتأكيد فشل تقدم شفاء العظام وتحديد الكائن الممرض 4,5. يتم استخدام التقنيات الطبية النووية مثل التصوير المقطعي المحوسب (CT) والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) وطرق النوكليوتيدات المشعة مثل التصوير المقطعي المحوسب بإصدار فوتون واحد (SPECT) والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) لتحسين تصور الغرسة المصابة والعدوى المرتبطة بها 6,7. التصوير المقطعي المحوسب والتصوير بالرنين المغناطيسي مفيدان في تحديد نخر العظام وتشوهات الأنسجة الرخوة ، على التوالي ولكنهما يسببان تداخلات على مسافة قريبة من الغرسات المعدنية8. تستخدم منهجيات الأشعة السينية المختلفة مثل SPECT و PET بالاشتراك مع التحليلات الموسومة بالنظائر المشعة كما هو الحال في عوامل تباين التصوير في الجسم الحي على نطاق واسع لتشخيص التهاب العظم والنقي المرتبط بالزرع2. تجمع التطبيقات الحالية بين كل من البيانات من التصوير المقطعي المحوسب وبيانات وضع العلامات من SPECT أو PET لتوليد معلومات تشريحية9. على الرغم من استخدام طريقة أو أكثر من طرق التصوير هذه للمساعدة في تشخيص العدوى ، إلا أنها لا تستطيع اكتشاف اختلافات الأس الهيدروجيني المرتبطة بالعدوى مبكرا لبدء العلاج بالمضادات الحيوية لتجنب النفقات الطبية والجراحية الإضافية.

الميزة الرئيسية لاستخدام نظام التصوير المستخدم في هذه الدراسة لمراقبة العدوى المرتبطة بالزرع هي قدرته على الكشف عن المعلومات الكيميائية الحيوية حول البيئة الدقيقة للغشاء الحيوي مع مرجع طيفي. على الرغم من أن التركيز الرئيسي ينصب على التصوير ورسم خرائط الأس الهيدروجيني في الموقع المصاب ، إلا أنه يمكن تغيير هذه الطريقة لمراقبة المؤشرات الحيوية الأخرى الخاصة بالعدوى المرتبطة بالزرع. وبالتالي ، يسمح XELCI بفهم الفيزيولوجيا المرضية للعدوى. يسمح التصوير عالي الدقة المكانية برسم خرائط عدم التجانس مع نمو العدوى. الرقم الهيدروجيني على السطح حيث يحدث تكوين الأغشية الحيوية مهم جدا لفهم التغيرات الكيميائية الحيوية. أيضا ، يمكن أن تحدث تغييرات أخرى في البيئة المكروية بسبب استجابات الإجهاد المرتبطة بالمضادات الحيوية من قبل البكتيريا10,11. نظرا للتصوير المكاني عالي الدقة والسطحي ، يمكن مراقبة تأثير المضادات الحيوية على البيئة الدقيقة للغشاء الحيوي. يمكن أيضا استخدام هذه التقنية لدراسة بيئة الأغشية الحيوية الرقيقة لتجارب توصيل الأدوية المستهدفة. يمكننا دراسة إطلاق الدواء المستهدف منخفض الأس الهيدروجيني أو رفع درجة الحموضة لجعلها أكثر عرضة للعمل عند درجة حموضة أعلى.

ثلاث خصائص محددة لتقنية التصوير هذه هي دقة الأشعة السينية ، وخصوصية سطح الزرع ، والحساسية الكيميائية (الشكل 1 أ). يمكن مقارنة هذه الخصائص بتقنيات التصوير المتاحة حاليا لتصوير الالتهابات المرتبطة بزرع العظام (الشكل 1 ب). بمجرد تشعيعها بالأشعة السينية ، تولد جزيئات الفوسفور المطلية على سطح الزرع ضوءا أحمر وقريبا من الأشعة تحت الحمراء (NIR) يمكنه اختراق بضعة سنتيمترات من الأنسجة (وإن كان ذلك مع بعض التوهين)12,13. يوضح الجدول 1 بعض ميزات نظام التصوير المطور مقارنة بالطرق الأخرى التي تم استخدامها لقياس درجة الحموضة في الأغشية الحيوية أو من خلال الأنسجة.

XELCI هي تقنية تصوير جديدة للحصول على معلومات كيميائية عالية الدقة المكانية بصريا بالقرب من الأجهزة الطبية المزروعة بالاشتراك مع إثارة الأشعة السينية ، كما هو موضح في الشكل 2. هنا يتم استخدام الإثارة الانتقائية والكشف البصري لجزيئات الفوسفور المثيرة بالأشعة السينية. الغرسة مغلفة بطبقتين ، صبغة حساسة لدرجة الحموضة مدمجة طبقة بوليمر فوق طبقة من جزيئات التلألؤ. بمجرد أن تشع سلسلة من حزم الأشعة السينية المركزة الغرسة ، تولد طبقة التلألؤ ضوءا مرئيا (620 نانومتر و 700 نانومتر). يمر هذا الضوء الناتج عبر الطبقة الحساسة لدرجة الحموضة التي تعدل طيف التلألؤ اعتمادا على الرقم الهيدروجيني للبيئة المحيطة. يرتبط انخفاض درجة الحموضة عموما بالعدوى وتكوين الأغشية الحيوية. مع تقدم العدوى ، يتغير الرقم الهيدروجيني من درجة الحموضة الفسيولوجية (الرقم الهيدروجيني 7.2) إلى الحمضية (أقل من الرقم الهيدروجيني 7) ، وتغير صبغة الأس الهيدروجيني في المستشعر اللون وبالتالي الامتصاص. يظهر تباين طيف التلألؤ في الشكل 2E لصبغة الأس الهيدروجيني الخضراء Bromocresol عند الرقم الهيدروجيني 7 والرقم الهيدروجيني 4. يتم جمع الضوء المرسل عبر الأنسجة والعظام وتحدد النسبة الطيفية درجة الحموضة. لتوليد صورة الأس الهيدروجيني ، يشع شعاع الأشعة السينية المركز نقطة في كل مرة في فيلم الوميض ويمسح الحزمة نقطة تلو الأخرى عبر العينة. في السابق ، تم تطبيق هذه التقنية على صورة تباين الأس الهيدروجيني على سطح غرسات العظام14,15 واختبرتها لمراقبة تغيرات الأس الهيدروجيني في القناة داخل النخاع من خلال العظام والأنسجة.

يوضح الشكل 3 أدناه مخططا لنظام التصوير. المكونات الأساسية لنظام التصوير هي مصدر إثارة الأشعة السينية مع بصريات متعددة الشعيرات الدموية ، ودليل ضوء أكريليك من قطعة واحدة يتصل بأنبوبين مضاعفين ضوئيين ، والمرحلة الآلية x و y و z (30 سم × 15 سم × 6 سم السفر) والكمبيوتر المتصل للحصول على البيانات. يوجد مصدر الأشعة السينية ومرحلة x و y و z وبصريات التجميع (الكوع ، دليل الضوء ، أنابيب المضاعف الضوئي (PMTs)) في حاوية مقاومة الأشعة السينية ، بينما يتم الاحتفاظ بوحدة التحكم بالأشعة السينية ومصدر الطاقة ل PMTs ومولد الوظائف المتصل بلوحة الحصول على البيانات (DAQ) والكمبيوتر بالخارج. يعمل زر الضغط ، وهو مفتاح مفتوح عادة ، يوضع بين العلبة ومقدمة الباب كقفل متشابك. إذا لم يكن الباب مغلقا تماما (مفتاح التعشيق مفتوح) ، فلن يتم تشغيل مصدر الأشعة السينية ، وسيقوم تلقائيا بإيقاف تشغيل مصدر الأشعة السينية إذا تم فتحه أثناء التشغيل. يمكن للمحركات إجراء مسح مستمر وكذلك يمكن نقلها إلى أي مكان منفصل. عادة ما تكون سرعة المسح للمحور ص 1-5 مم / ثانية ، بينما يمكن اختيار حجم الخطوة على المحور السيني عادة من 150-2000 ميكرومتر. يمكن اختيار المعلمات اعتمادا على الدقة المكانية المطلوبة. يتم تأكيد أوقات التعرض المتساوية من خلال السرعة الثابتة طوال الفحص المستمر.

بمجرد تشعيع شعاع الأشعة السينية المركز على جزيئات تلألؤ الأشعة السينية ، سيمر الضوء المتولد عبر الفيلم الحساس للأس الهيدروجيني عن طريق تعديل الضوء اعتمادا على الرقم الهيدروجيني المحيط. سوف يتفاعل الضوء المرسل (ينتشر ويمتص جزئيا) مع الأنسجة ، بينما يزداد توهين الضوء عن طريق التشتت والامتصاص مع زيادة سمك الأنسجة. تشتمل بصريات المجموعة على دليل ضوئي أكريليك متشعب من قطعة واحدة مزود بكوع من الألومنيوم العاكس (مع انحناء 90 درجة وسطح داخلي عاكس مصقول) في البداية. هذا لضمان توازي الضوء بمجرد وصول الضوء إلى دليل الضوء. أدت هذه الإضافات إلى تحسين كفاءة جمع الضوء بشكل كبير. لمزيد من التفاصيل ، يوضح الشكل 4 رسومات الماكينة للكوع ودليل الضوء. تم تشكيل الكوع 90 درجة من الألومنيوم مع تلميع السطح الداخلي إلى تشطيب المرآة وتم تشكيل دليل الضوء باستخدام الأكريليك. لقد قمنا أيضا بتوصيل مرشح ضوء أزرق طويل النطاق واسع النطاق (يحجب ضوء 350-450 نانومتر) في بداية الكوع لضمان مرور الضوء الأحمر فقط. تتشعب نهاية دليل ضوء الأكريليك المكون من قطعة واحدة إلى تيارين يؤديان إلى اثنين من PMTs مختلفين. يتم وضع PMTs في صندوق معدني صغير محكم الغلق على اتصال مع مبرد كهربائي حراري لتبريد PMTs إلى ~ 5 °C. في بداية أحد PMTs ، يتم إرفاق مرشح تمرير طويل ضيق النطاق (يحجب ضوء 570-640 نانومتر ويمرر ضوء 640-740 نانومتر) لقياس ضوء 700 نانومتر فقط. لذلك ، يمكن حساب الضوء 620 نانومتر و 700 نانومتر بشكل منفصل. يتم إعداد PMTs في وضع عد الفوتون ، وتولد نبضات منطق الترانزستور والترانزستور (TTL) لكل فوتون يتم اكتشافه. يقوم نظام DAQ بحساب النبضات (نقطة التشبع 20 مليون نبضة في الثانية) باستخدام اتصال USB. يتم إنشاء خريطتين منفصلتين للشدة بعد معالجة البيانات ، ويتم إنشاء صورة نهائية من خلال النظر في نسبة شدة الطول الموجي للإشارة (620 نانومتر) إلى شدة الطول الموجي المرجعي (700 نانومتر). تمثل هذه النسبة الاختلافات في إجمالي كفاءة جمع الضوء ، والتي تعتمد بشدة على موضع بصريات التجميع ، وكثافة تشعيع الأشعة السينية ، وسمك الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المنطقة المرجعية المنفصلة مكانيا بدون أي صبغة مؤشر الأس الهيدروجيني تمثل التشوه الطيفي من اختراق الأنسجة المعتمد على الطول الموجي. يتم استخدام لغة برمجة قائمة على الرسومات للتحكم في نظام التصوير ، ويظهر أدناه مخطط انسيابي أساسي للعملية. يتم وضع إعداد التصوير ، باستثناء الكمبيوتر ووحدة التحكم بالأشعة السينية ووحدة DAQ ، في حاوية آمنة للأشعة السينية لتقليل التعرض للإشعاع.

Protocol

يتبع هذا الإجراء بروتوكولات استخدام الحيوانات المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية بجامعة كليمسون (IACUC). يتم إجراء التجارب وفقا للجنة السلامة البيولوجية بجامعة كليمسون (IBC) ولجنة السلامة الإشعاعية (RSC) بالإضافة إلى اتباع الإرشادات واللوائح ذات الصلة.

ملاحظة: يظهر مخطط التدفق لإكمال فحص XELCI أدناه في الشكل 5 متبوعا بوصف تفصيلي خطوة بخطوة لإجراء التصوير.

1. تهيئة النظام والحصول على صورة شعاعية عادية

  1. قم بتشغيل مبرد PMT ، وعادة ما يستغرق الأمر ~ 15 دقيقة للوصول إلى نقطة الضبط (على سبيل المثال ، 4 °C). قم بتنفيذ بقية خطوات التهيئة قبل تشغيل PMTs.
  2. افتح برنامج التحكم في نظام التصوير. يقوم برنامج التحكم بالاتصال وتهيئة المرحلة الآلية للمحور x-y-z. حرك المحور السيني للمرحلة والمحور ص إلى موضع البدء المطلوب.
  3. ضع العينة على مرحلة x-y-z المتحركة. ضع ارتفاع العينة (المحور z) ، بحيث يكون جهاز الإضاءة الإشعاعية 5-5.5 سم تحت بصريات التركيز متعددة الشعيرات الدموية عن طريق رفع أو خفض مصدر الأشعة السينية و / أو المرحلة. أيضا ، ضع العينة في المستوى x-y بمساعدة رأس الليزر (مؤشران ليزر على شكل خط أحمر متصلان بشعيرات تركيز الأشعة السينية ووضعهما عند 90 درجة لبعضهما البعض بحيث تتقاطع الخطوط حيث ستركز الأشعة السينية). قم بإيقاف تشغيل الليزر قبل تشغيل الأشعة السينية و PMTs.
  4. قم بتأمين قفل زر الضغط عند الباب الأمامي لحاوية التصوير. قم بتشغيل الطاقة لمصدر الشعاع. قم بإزالة بصريات التركيز للحصول على الصورة الشعاعية العادية للعينة.
  5. افتح برنامج التحكم في الأشعة السينية واضبط طاقة الأشعة السينية (عن طريق ضبط الجهد والتيار). افتح غالق الأشعة السينية باستخدام برنامج التحكم بالأشعة السينية.
  6. افتح البرنامج لكاميرا الأشعة السينية. اضغط على زر التعرض لأخذ الصورة الشعاعية العادية. قم بإيقاف تشغيل التعرض وإيقاف تشغيل الأشعة السينية.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر ، انقل العينة لتحسين موضع العينة أو الحصول على سلسلة من الأشعة السينية في مواضع مختلفة بحيث يمكن تجميعها للحصول على عرض شعاعي أكبر. يمكن للمرء أيضا الحصول على صورة شعاعية على نظام منفصل ، ولكن التسجيل المشترك بين XELCI والتصوير الشعاعي يصبح أكثر صعوبة إذا تحركت العينة.
  7. افتح باب العلبة.

2. اختياريا ، قم بإجراء مسح للخلفية مع إيقاف تشغيل الأشعة السينية

  1. قم بتوصيل البصريات متعددة الشعيرات الدموية مرة أخرى بمصدر الأشعة السينية.
  2. أغلق العلبة وقم بتأمين التعشيق. قم بتشغيل مصدر الطاقة PMT.
    ملاحظة: يجب دائما إيقاف تشغيل مصدر الطاقة PMT عندما يكون الباب مفتوحا أو على وشك الفتح لتجنب التعرض المفرط للضوء.
  3. افتح برنامج التحكم في نظام التصوير وحدد حجم الخطوة وسرعة المسح الضوئي ومنطقة المسح. بمجرد تعيين جميع المعلمات ، ابدأ الفحص بالضغط على زر التشغيل .
    ملاحظة: بالنسبة للمسح عالي الدقة ، سيكون حجم الخطوة 1000 ميكرومتر وبالنسبة للمسح منخفض الدقة ، سيكون حجم الخطوة 250 ميكرومتر. يمكن اختيار سرعة المسح من 5 مم / ثانية إلى 1 مم / ثانية. تعتمد مساحة الفحص على أبعاد العينة.
  4. قم بإجراء مسح ضوئي للخلفية مع إيقاف تشغيل الأشعة السينية لتحديد أعداد الظلام من أي ضوء موجود في العلبة بخلاف العينة.

3. قم بإجراء مسح عينة باستخدام الأشعة السينية

  1. تأكد من أن العينة لا تزال في الموضع الصحيح باستخدام رأس الليزر المتقاطع لبدء الفحص.
  2. أغلق العلبة وقم بتأمين التعشيق. إذا كانت PMTs مطفأة (على سبيل المثال ، تم إيقاف تشغيلها قبل فتح الباب) ، فقم بتشغيل مصدر طاقة PMT.
  3. افتح برنامج التحكم في نظام التصوير. أدخل قيم حجم الخطوة وسرعة المسح الضوئي ومنطقة المسح الضوئي. بمجرد تعيين جميع المعلمات ، اضغط على زر التشغيل لبدء الفحص.
    ملاحظة: بالنسبة للمسح عالي الدقة ، سيكون حجم الخطوة 1000 ميكرومتر وبالنسبة للمسح منخفض الدقة ، سيكون حجم الخطوة 250 ميكرومتر. يمكن اختيار سرعة المسح من 5 مم / ثانية إلى 1 مم / ثانية. تعتمد مساحة الفحص على أبعاد العينة.
  4. احصل على فحص العينة مع تشغيل الأشعة السينية.
  5. أولا ، قم بإجراء فحص منخفض الدقة بأحجام خطوات أكبر وسرعة مسح أعلى للحصول على صورة أولية للهدف. بعد الحصول على مسح منخفض الدقة للمنطقة المطلوبة من العينة ، احصل على مسح عالي الدقة بحجم خطوة أصغر وسرعة مسح أقل.
  6. قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة PMT قبل فتح الباب.

4. تشكيل الصورة

  1. التحقق من صحة المسح الحالي هو تصوير منطقة اهتمام الهدف. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بإيقاف الفحص الحالي عن طريق الضغط على الزر Stop .
  2. اضبط مواضع المسح في برنامج التحكم مرة أخرى واضغط على زر التشغيل مرة أخرى.
    ملاحظة: يتم تسجيل المحور ص باستمرار بدءا من الصف الأول من الفحص. أثناء إجراء الفحص ، يتم تسجيل عدد التهم لكل طول موجي ووقت منذ آخر موضع محرك محدث. سيحسب الوقت المسجل أي تغييرات في سرعة المحرك ، وبالتالي وقت التعرض. لكل بكسل ، يتم تسوية الأعداد / الثانية. ينتقل محرك المحور ص لمسح نهاية الصف الحالي للمحور ص ويعود المحرك إلى وضع البداية. ثم يزيد محرك المحور السيني من موضعه بحجم خطوة يحدده المستخدم ويمسح الصف الثاني من المحور ص. يتم تدوير هذه العملية حتى يصل محرك المحور x إلى العرض المحدد للاتجاه x. يمكن للمستخدم التحكم في حجم المسح وسرعة المحرك ومواضع بدء تشغيل المحرك. سيحدد حجم الخطوة حجم وحدات البكسل في الصورة النهائية للمحور ص.

5. زراعة البكتيريا للتصوير في ظروف معقمة (إذا تم تصوير أجهزة استشعار نمت البكتيريا)

  1. لتحضير ثقافة جديدة من المكورات العنقودية الذهبية 1945 (ATCC 25923) ، استخدم مستعمرة واحدة من لوحة TSA (أجار الصويا Tryptic) مخططة في غضون أسبوع واحد لتلقيح 5 مل من مرق الصويا Tryptic المعقم (TSB).
  2. رج المستنبتة البكتيرية برفق عند 37 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة حتى المرحلة الثابتة.
  3. بعد ذلك ، قم بتجميع الحبيبات من TSB عبر الطرد المركزي عند 4000 × g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) واغسل الحبيبات مرتين بمحلول الفوسفات العازل (PBS) وأعد تعليق الحبيبات في 5 مل من PBS المعقم.
  4. حدد التركيز البكتيري باستخدام الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر باستخدام النطاق الخطي ، وهو نطاق OD حيث يتم التحقق من قانون بير لامبرت (OD = kN ؛ k هو معامل نسبة إلى الانقراض الجزيئي وطول المسار البصري ، N هو تركيز البكتيريا)16. ثم قم بتخفيف العينة إلى 105 خلايا / مل باستخدام برنامج تلفزيوني معقم.
  5. تعقيم أجار الصويا تريبتيك (TSA) عن طريق التعقيم ثم تبرد عن طريق الخلط حتى تصل درجة الحرارة إلى 45 درجة مئوية. تلقيح البكتيريا في TSA.
  6. ماصة الثقافة البكتيرية المخففة (100 ميكرولتر) على سطح المستشعر القابل للزرع.
    ملاحظة: تم تعقيم الغرسات عن طريق الغمر في 70٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق وتخزينها في برنامج تلفزيوني معقم.
  7. ماصة 100 ميكرولتر من TSA غير الملقح على غرسة معقمة أخرى كعنصر تحكم
  8. أضف 100 ميكرولتر إضافية من TSA غير الملقح فوق المستشعر القابل للزرع قبل تحضينه عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة قبل الزرع.

النتائج

كدراسة أولية ، قمنا بتصوير مستشعر القضيب داخل النخاع في قصبة ساق ممزقة لجثة أرنب14. يحتوي المستشعر على ثلاث مناطق متميزة: المنطقة المرجعية ، ومنطقة الأس الهيدروجيني 8 (الرقم الهيدروجيني الأساسي) ، ومنطقة الأس الهيدروجيني 4 (درجة الحموضة الحمضية). المنطقة المرجعية هي جسيم الوميض...

Discussion

لكي نتمكن من اكتشاف ودراسة الالتهابات المرتبطة بزراعة العظام في وقت مبكر لتجنب مضاعفات التهاب العظم والنقي والإجراءات الجراحية الثانوية ، قدمنا XELCI كتقنية تصوير وظيفية جديدة. إنه قابل للمقارنة مع التقنيات المتاحة حاليا لمراقبة درجة الحموضة من خلال الأنسجة.

أثناء وضع العي?...

Disclosures

يدعي أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا جامعة كليمسون و COMSET و Clemson SC BioCRAFT. تم تطوير إعداد XELCI في البداية بأموال من NSF CAREER CHE 12255535 ولاحقا بواسطة NIH NIAMS R01 AR070305-01.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
90 degree elbowProduced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA
Bromo Cresol GreenSigma-Aldrich45ZW10
Bromo Thymol BlueSigma76-59-5
ElectraCOOL Advanced thermoelectric cool platePollock industries, White River, VT, USATCP 50
EthanolBeantown Chemical, 9 Sagamore Park Road
Hudson, NH 03051		64-17-5
Gadolinium Oxysulfide Europium doped (Gd2O2S:Eu) particles-~8.0 µmPhosphor Technologies Inc., Stevenage, EnglandUKL63/N-R1
LabVIEWNational Instruments, Austin, TX
Motorized Linear Vertical Stage Model (for Z axis)Motion Control, Smithtown, NY, USAAT10-60
National instruments c-DAQ 9171National Instruments, Austin, TXNI cDAQ™-9171
One piece acrylic light guideProduced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA
pH 4 bufferVWR BDH ChemicalsBDH5024
pH 8 bufferVWR BDH ChemicalsBDH5060
Phosphate Buffer SolutionMP Biomedicals, Irvine, CA. USA2810305
Photo multiplier tubes Model P25PC-16SensTech, Surrey, UKModel P25PC-16
Staphylococcus aureus subsp. aureus RosenbachAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VAATCC 25923
Tryptic Soy AgarTeknova, Hollister, CA, USA T0520
Tryptic Soy BrothEMD Millipore, Burlington, MA, USA1005255000
X-ray source-iMOXSInstitute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Germany
X,Y motorized stage-30 cm x 15 cm x 6 cm travelThorlabs Inc., Newton, NJ, USALTS300 and LTS150

References

  1. Arciola, C. R., Alvi, F. I., An, Y. H., Campoccia, D., Montanaro, L. Implant infection and infection resistant materials: A mini review. International Journal of Artificial Organs. 28 (11), 1119-1125 (2005).
  2. Renick, P., Tang, L., Li, B., Moriarty, T. F., Webster, T., Xing, M. Device-related infections. Racing for the Surface. , 171-188 (2020).
  3. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
  4. Metsemakers, W. J., et al. Fracture-related infection: A consensus on definition from an international expert group. Injury. 49 (3), 505-510 (2018).
  5. Arciola, C. R., Campoccia, D., Montanaro, L. Implant infections: Adhesion, biofilm formation and immune evasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (7), 397-409 (2018).
  6. Polvoy, I., Flavell, R. R., Rosenberg, O. S., Ohliger, M. A., Wilson, D. M. Nuclear Imaging of Bacterial Infection: The State of the Art and Future Directions. Journal of Nuclear Medicine. 61 (12), 1708-1716 (2020).
  7. vander Bruggen, W., Bleeker-Rovers, C. P., Boerman, O. C., Gotthardt, M., Oyen, W. J. G. PET and SPECT in Osteomyelitis and Prosthetic Bone and Joint Infections: A Systematic Review. Seminars in Nuclear Medicine. 40 (1), 3-15 (2010).
  8. Trampuz, A., Zimmerli, W. Diagnosis and Treatment of infections associated with fracture-fixation devices. Injury. 37 (2), 59-66 (2006).
  9. Ady, J., Fong, Y. Imaging for infection: From visualization of inflammation to visualization of microbes. Surgical Infections. 15 (6), 700-707 (2014).
  10. Truong-Bolduc, Q. C., et al. Implication of the NorB Efflux pump in the adaptation of Staphylococcus Aureus to growth at acid pH and in resistance to Moxifloxacin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (7), 3214-3219 (2011).
  11. Hengge-Aronis, R. Signal transduction and regulatory mechanisms involved in control of the σS (RpoS) subunit of RNA polymerase. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (3), 373-395 (2002).
  12. Gao, R., Yan, D. Molecular phosphors for x-ray detection. Science Bulletin. 67 (10), 1015-1017 (2022).
  13. Gao, R., Fang, X., Yan, D. Recent developments in stimuli-responsive luminescent films. Journal of Materials Chemistry C. 7 (12), 3399-3412 (2019).
  14. Uzair, U., et al. Conformal coating of orthopedic plates with x-ray scintillators and ph indicators for x-ray excited luminescence chemical imaging through tissue. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (47), 52343-52353 (2020).
  15. Uzair, U., Benza, D., Behrend, C. J., Anker, J. N. Noninvasively imaging pH at the surface of implanted orthopedic devices with x-ray excited luminescence chemical imaging. ACS Sensors. 4 (9), 2367-2374 (2019).
  16. Begot, C., Desnier, I., Daudin, J. D., Labadie, J. C., Lebert, A. Recommendations for calculating growth parameters by optical density measurements. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 225-232 (1996).
  17. Giering, K., Minet, O., Lamprecht, I., Müller, G. Review of thermal properties of biological tissues. Proceedings of SPIE - The International Society for Optical Engineering. , 45-65 (1995).
  18. Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 71 (5), 2501-2510 (2005).
  19. Pogue, B. W., Leblond, F., Krishnaswamy, V., Paulsen, K. D. Radiologic and Near-Infrared/Optical Spectroscopic Imaging: Where Is the Synergy. American Journal of Roentgenology. 195 (2), 321-332 (2010).
  20. Ryan, S. G., et al. Imaging of X-ray-excited emissions from quantum dots and biological tissue in whole mouse. Scientific Reports. 9 (1), 19223 (2019).
  21. Yang, Y., Wang, K. -. Z., Yan, D. Ultralong persistent room temperature phosphorescence of metal coordination polymers exhibiting reversible pH-responsive emission. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (24), 15489-15496 (2016).
  22. Chen, H., Rogalski, M. M., Anker, J. N. Advances in functional X-ray imaging techniques and contrast agents. Physical Chemistry Chemical Physics. 14 (39), 13469 (2012).
  23. Allan, V. J. M., Macaskie, L. E., Callow, M. E. Development of a pH gradient within a biofilm is dependent upon the limiting nutrient. Biotechnology letters. 21 (5), 407-413 (1999).
  24. Wang, Z., Deng, H., Chen, L., Xiao, Y., Zhao, F. In situ measurements of dissolved oxygen, pH and redox potential of biocathode microenvironments using microelectrodes. Bioresource Technology. 132, 387-390 (2013).
  25. Xiao, Y., et al. In situ probing the effect of potentials on the microenvironment of heterotrophic denitrification biofilm with microelectrodes. Chemosphere. 93 (7), 1295-1130 (2013).
  26. Nakata, E., et al. A novel strategy to design latent ratiometric fluorescent pH probes Based on self-assembled SNARF derivatives. RSC Adv. 2014 (4), 348-357 (2014).
  27. Villano, D., et al. A fast multislice sequence for 3D MRI-CEST pH. Magnetic Resonance in Medicine. 85 (3), 1335-1349 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

187

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved