Imaging chimico ad alta risoluzione spaziale delle infezioni associate all'impianto con luminescenza eccitata a raggi X Imaging chimico attraverso il tessuto

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per il rilevamento ottico ad alta risoluzione di informazioni chimiche intorno a dispositivi medici impiantati con imaging chimico a luminescenza eccitata a raggi X (XELCI). Questa nuova tecnica di imaging è stata sviluppata nel nostro laboratorio che consente di studiare la biochimica delle infezioni associate agli impianti.

Abstract

Le infezioni microbiche associate ai dispositivi medici impiantabili sono una delle principali preoccupazioni nel fallimento della fissazione delle fratture. La diagnosi precoce di tale infezione consentirà di eradicare con successo con antibiotici senza costi aggiuntivi per un secondo intervento chirurgico. Qui, descriviamo XELCI come una tecnica con elevata risoluzione dei raggi X, specificità dell'impianto e sensibilità chimica alle concentrazioni chimiche di immagini non invasive vicino alla superficie dei dispositivi medici impiantati. I dispositivi sono rivestiti con superfici di segnalazione chimica. Questa superficie chimicamente sensibile è costituita da due strati rivestiti su un dispositivo medico impiantabile; uno strato sensibile al pH (idrogel incorporato blu di bromotimolo o verde bromocresolo) che viene rivestito su uno scintillatore che emette luce rossa (Gd 2 O₂S: Eu) per il monitoraggio. Un fascio di raggi X focalizzato irradia un punto sull'impianto e la luce rossa generata dallo scintillatore (con picchi di 620 nm e 700 nm) viene trasmessa attraverso lo strato di rilevamento che altera il rapporto spettrale a seconda del pH. Un'immagine viene generata scansionando il fascio di raggi X attraverso l'impianto e misurando il rapporto spettrale della luce che passa attraverso il tessuto punto per punto. Abbiamo utilizzato questa tecnica di imaging per monitorare le infezioni associate all'impianto precedentemente sulla superficie ossea del femore con un sensore a piastra impiantabile modificato. Ora stiamo studiando i cambiamenti di pH che si verificano dalle infezioni midollari tibiali dei bastoncelli intramidollari. Due diversi tipi di disegni di bastoncelli intramidollari sono utilizzati negli studi pre-pilota sui conigli e abbiamo appreso che la tecnica XELCI potrebbe essere utilizzata per monitorare eventuali cambiamenti chimici che si verificano non solo sulla superficie ossea ma anche all'interno dell'osso. Pertanto, ciò consente l'imaging locale non invasivo, ad alta risoluzione spaziale e a basso pH di fondo per studiare la biochimica delle infezioni associate all'impianto.

Introduzione

Negli Stati Uniti, circa 2 milioni di dispositivi di fissazione delle fratture vengono inseriti ogni anno e il 5% -10% di essi porta a infezioni associate all'impianto¹. Queste infezioni sono più difficili da trattare con antibiotici nelle fasi successive a causa dell'eterogeneità e della natura resistente agli antibiotici dei biofilm ^2,3. Se vengono diagnosticate precocemente, le infezioni possono essere trattate con antibiotici e sbrigliamento chirurgico per evitare costi medici aggiuntivi per un secondo intervento chirurgico per sostituire l'hardware nel sito di frattura trattato. La radiografia semplice e altre tecniche radiografiche avanzate sono applicate nella diagnosi di infezioni ortopediche associate a impianti, non unioni e complicanze correlate. Sebbene queste tecniche siano utilizzate frequentemente per acquisire informazioni strutturali dell'osso e del tessuto circostante presso l'impianto ortopedico, non sono in grado di fornire informazioni biochimiche nell'ambiente specifico. Pertanto, abbiamo sviluppato una nuova tecnica di imaging chimico a luminescenza eccitata a raggi X (XELCI) per l'imaging ad alta risoluzione di informazioni biochimiche in modo non invasivo nel sito dell'impianto. La diagnosi di infezioni ortopediche associate agli impianti viene comunemente effettuata con uno o una combinazione di mezzi diversi. Le osservazioni cliniche (dolore, gonfiore, arrossamento, secrezione della ferita, ecc.) suggeriscono i primi segni di infezione. Successivamente, vengono effettuati esperimenti radiologici e di laboratorio per confermare il fallimento della progressione della guarigione ossea e identificare l'organismo patogeno ^4,5. Tecniche di medicina nucleare come la tomografia computerizzata (TC), la risonanza magnetica (MRI) e metodi radionucleotidici come la tomografia computerizzata a emissione di fotoni singoli (SPECT) e la tomografia ad emissione di positroni (PET) sono in uso per una migliore visualizzazione dell'impianto infetto e dell'infezione associata ^6,7. La TC e la risonanza magnetica sono vantaggiose nel determinare rispettivamente la necrosi ossea e le anomalie dei tessuti molli, ma causano interferenze a distanza ravvicinata dagli impianti metallici⁸. Diverse metodologie a raggi X come SPECT e PET in combinazione con analiti marcati con radioisotopi come agenti di contrasto di imaging in vivo sono ampiamente utilizzate per diagnosticare l'osteomielite 2 associata all'impianto^. Le applicazioni attuali combinano sia i dati della scansione TC che i dati di etichettatura della SPECT o della PET per generare informazioni anatomiche⁹. Sebbene una o più di queste modalità di imaging siano utilizzate per aiutare la diagnosi dell'infezione, non possono rilevare precocemente le variazioni di pH associate all'infezione per iniziare i trattamenti con antibiotici per evitare spese mediche e chirurgiche extra.

Il vantaggio principale dell'utilizzo del sistema di imaging utilizzato in questo studio per il monitoraggio delle infezioni associate all'impianto è la sua capacità di rivelare informazioni biochimiche sul microambiente del biofilm con un riferimento spettrale. Sebbene l'obiettivo principale sia l'imaging e la mappatura del pH nel sito infetto, questo metodo può essere modificato per monitorare altri biomarcatori specifici per le infezioni associate all'impianto. Pertanto, XELCI consente di comprendere la fisiopatologia dell'infezione. L'imaging ad alta risoluzione spaziale consente di mappare l'eterogeneità man mano che l'infezione cresce. Il pH sulla superficie in cui si verifica la formazione del biofilm è molto importante per comprendere i cambiamenti biochimici. Inoltre, altri cambiamenti del microambiente possono verificarsi a causa di risposte allo stress correlate agli antibiotici da parte dei batteri^10,11. Grazie all'imaging specifico della superficie e ad alta risoluzione spaziale, è possibile monitorare l'effetto antibiotico sul microambiente del biofilm. La tecnica può anche essere utilizzata per studiare l'ambiente del biofilm per esperimenti mirati di somministrazione di farmaci. Possiamo studiare il rilascio mirato di farmaci a basso pH o l'aumento del pH per renderli più suscettibili a lavorare a pH più alti.

Tre caratteristiche specifiche di questa tecnica di imaging sono la risoluzione dei raggi X, la specificità della superficie dell'impianto e la sensibilità chimica (Figura 1A). Queste caratteristiche possono essere confrontate con le tecniche di imaging attualmente disponibili per l'imaging delle infezioni correlate agli impianti ortopedici (Figura 1B). Una volta irradiate con i raggi X, le particelle di fosforo rivestite sulla superficie dell'impianto generano luce rossa e vicina all'IR (NIR) che può penetrare attraverso alcuni centimetri di tessuto (anche se con una certa attenuazione)^12,13. La Tabella 1 mostra alcune delle caratteristiche del sistema di imaging sviluppato rispetto ad altri modi che sono stati utilizzati per misurare il pH nei biofilm o attraverso i tessuti.

XELCI è una nuova tecnica di imaging per acquisire informazioni chimiche ad alta risoluzione spaziale otticamente vicino a dispositivi medici impiantati in combinazione con l'eccitazione a raggi X, come mostrato nella Figura 2. Qui viene utilizzata l'eccitazione selettiva e la rilevazione ottica di particelle di fosforo eccitabili a raggi X. L'impianto è rivestito con due strati, uno strato polimerico incorporato in colorante sensibile al pH su uno strato di particelle scintillatrici. Una volta che una sequenza di fasci di raggi X focalizzati irradia l'impianto, lo strato scintillatore genera luce visibile (620 nm e 700 nm). Questa luce prodotta passa attraverso lo strato sensibile al pH modulando lo spettro di luminescenza a seconda del pH dell'ambiente circostante. Il basso pH è generalmente associato all'infezione e alla formazione di biofilm; man mano che l'infezione progredisce, il pH cambia da pH fisiologico (pH 7,2) ad acido (inferiore a pH 7) e il colorante pH nel sensore cambia colore e quindi assorbanza. La variazione dello spettro di luminescenza è mostrata nella Figura 2E per il colorante a pH verde Bromocresolo a pH 7 e pH 4. La luce trasmessa attraverso il tessuto e l'osso viene raccolta e il rapporto spettrale determina il pH. Per generare un'immagine del pH, il fascio di raggi X focalizzato irradia un punto alla volta nel film scintillatore e scansiona il fascio punto per punto attraverso il campione. In precedenza, questa tecnica è stata applicata per visualizzare la variazione del pH sulla superficie degli impianti ortopedici^14,15 e l'ho testata per monitorare le variazioni di pH nel canale intramidollare attraverso ossa e tessuti.

La figura 3 seguente mostra uno schema del sistema di imaging. I componenti di base del sistema di imaging sono la sorgente di eccitazione a raggi X con ottica poli capillare, una guida di luce acrilica monopezzo che si collega a due tubi fotomoltiplicatori, lo stadio motorizzato x, y e z (corsa 30 cm x 15 cm x 6 cm) e il computer collegato per l'acquisizione dei dati. La sorgente di raggi X, lo stadio x, y, z e le ottiche di raccolta (gomito, guida luminosa, tubi fotomoltiplicatori (PMT)) sono nell'involucro a prova di raggi X, mentre il controller a raggi X, la fonte di alimentazione per PMT, il generatore di funzioni collegato alla scheda di acquisizione dati (DAQ) e il computer sono tenuti all'esterno. Un pulsante, normalmente aperto, posto tra l'involucro e la parte anteriore della porta funge da interblocco. Se la porta non è completamente chiusa (l'interruttore di interblocco è aperto), la sorgente di raggi X non si accende e spegne automaticamente la sorgente di raggi X se viene aperta durante il funzionamento. I motori possono eseguire una scansione continua e possono essere spostati in qualsiasi posizione discreta. La velocità di scansione per l'asse y è solitamente 1-5 mm/s, mentre la dimensione del passo sull'asse x può essere scelta tipicamente tra 150-2000 μm. I parametri possono essere scelti in base alla risoluzione spaziale richiesta. Anche i tempi di esposizione sono confermati da una velocità costante durante una scansione continua.

Una volta che il fascio di raggi X focalizzato viene irradiato sulle particelle di luminescenza dei raggi X, la luce generata passerà attraverso la pellicola sensibile al pH modulando la luce a seconda del pH circostante. La luce trasmessa interagirà (si diffonderà e assorbirà parzialmente) con un tessuto, mentre l'attenuazione della luce per diffusione e assorbimento aumenterà all'aumentare dello spessore del tessuto. L'ottica della collezione include una guida luminosa in acrilico biforcato monopezzo dotata di un gomito in alluminio riflettente (con curvatura a 90° e superficie interna riflettente lucida) all'inizio. Questo per garantire che la luce venga collimata non appena la luce raggiunge la guida luminosa. Queste aggiunte hanno migliorato significativamente l'efficienza di raccolta della luce. Per ulteriori dettagli, la Figura 4 mostra i disegni della macchina del gomito e della guida luminosa. Il gomito a 90° è stato lavorato in alluminio con la superficie interna lucidata a specchio e la guida luminosa è stata lavorata con acrilico. Abbiamo anche collegato un filtro luce blu passa-lungo ad ampio raggio (che blocca la luce a 350-450 nm) all'inizio del gomito per garantire che solo la luce rossa passi attraverso. L'estremità della guida di luce acrilica monopezzo si biforca in due flussi che portano a due diversi PMT. I PMT sono racchiusi in una piccola scatola metallica a tenuta di luce che è in contatto con un dispositivo di raffreddamento termoelettrico per raffreddare i PMT a ~ 5 ° C. All'inizio di uno dei PMT, un filtro passa-lungo a raggio stretto (bloccando la luce a 570-640 nm e passando la luce a 640-740 nm) è collegato per misurare solo la luce a 700 nm. Pertanto, la luce da 620 nm e 700 nm può essere calcolata separatamente. I PMT sono impostati in modalità di conteggio dei fotoni e generano impulsi logici transistor-transistor (TTL) per ogni fotone rilevato. Un sistema DAQ conta gli impulsi (punto di saturazione 20 milioni di impulsi al secondo) utilizzando la comunicazione USB. Dopo l'elaborazione dei dati vengono generate due mappe di intensità separate e viene creata un'immagine finale considerando il rapporto tra l'intensità della lunghezza d'onda del segnale (620 nm) e l'intensità della lunghezza d'onda di riferimento (700 nm). Questo rapporto tiene conto delle differenze nell'efficienza totale di raccolta della luce, che dipendono fortemente dalla posizione dell'ottica di raccolta, dall'intensità dell'irradiazione a raggi X e dallo spessore del tessuto. Inoltre, una regione di riferimento spazialmente separata senza alcun colorante indicatore di pH tiene conto della distorsione spettrale dovuta alla penetrazione tissutale dipendente dalla lunghezza d'onda. Per il controllo del sistema di imaging viene utilizzato un linguaggio di programmazione basato su grafica e di seguito viene illustrato un diagramma di flusso di base dell'operazione. La configurazione delle immagini, ad eccezione del computer, del controller a raggi X e dell'unità DAQ, è racchiusa in un involucro a raggi X sicuro per ridurre al minimo l'esposizione alle radiazioni.

Protocollo

Questa procedura segue i protocolli di utilizzo degli animali approvati dal Clemson University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Gli esperimenti sono condotti secondo il Comitato per la biosicurezza della Clemson University (IBC) e il comitato per la sicurezza delle radiazioni (RSC), nonché seguendo le linee guida e i regolamenti pertinenti.

NOTA: Un diagramma di flusso del completamento di una scansione XELCI è mostrato di seguito nella Figura 5 seguito da una descrizione dettagliata passo-passo della procedura di imaging.

1. Inizializzare il sistema e acquisire una radiografia semplice

1. Accendere il dispositivo di raffreddamento PMT, in genere occorrono ~ 15 minuti per raggiungere il setpoint (ad esempio, 4 ° C). Eseguire il resto dei passaggi di inizializzazione prima di attivare i PMT.
2. Aprire il software di controllo del sistema di imaging. Il programma software di controllo comunica e inizializza lo stadio motorizzato dell'asse x-y-z. Spostate l'asse x e l'asse y dello stage nella posizione iniziale desiderata.
3. Posizionare il campione sul palco mobile x-y-z. Posizionare l'altezza del campione (asse z), in modo che il dispositivo radioluminescente si trovi 5-5,5 cm al di sotto dell'ottica di messa a fuoco policapillare sollevando o abbassando la sorgente di raggi X e/o lo stadio. Inoltre, posizionare il campione nel piano x-y con l'aiuto della traversa laser (due puntatori laser a forma di linea rossa attaccati al capillare di messa a fuoco dei raggi X e posizionati a 90° l'uno dall'altro in modo che le linee si intersechino dove si concentrerà il raggio X). Spegnere i laser prima di accendere i raggi X e i PMT.
4. Fissare l'interblocco a pulsante sulla porta anteriore dell'alloggiamento di imaging. Accendere l'alimentazione per la sorgente del raggio. Rimuovere l'ottica di messa a fuoco per ottenere la radiografia semplice del campione.
5. Aprire il software di controllo a raggi X e impostare la potenza dei raggi X (regolando tensione e corrente). Aprire l'otturatore a raggi X con il software di controllo a raggi X.
6. Aprire il software per la telecamera a raggi X. Premi il pulsante di esposizione per eseguire la radiografia normale. Spegnere l'esposizione e spegnere la radiografia.
   NOTA: Se necessario, spostare il campione per migliorare la posizione del campione o acquisire una serie di raggi X in posizioni diverse in modo che possano essere raccolti per ottenere una visione radiografica più ampia. Si può anche acquisire una radiografia su un sistema separato, ma la co-registrazione tra XELCI e radiografia diventa più difficile se il campione si muove.
7. Apri la porta del recinto.

2. Facoltativamente, eseguire una scansione in background con la radiografia spenta

1. Collegare nuovamente l'ottica policapillare alla sorgente di raggi X.
2. Chiudere l'involucro e fissare l'interblocco. Accendere l'alimentatore PMT.
   NOTA: l'alimentatore PMT deve essere sempre spento ogni volta che la porta è aperta o in procinto di essere aperta per evitare la sovraesposizione alla luce.
3. Aprire il software di controllo del sistema di imaging e specificare la dimensione del passo, la velocità di scansione e l'area di scansione. Una volta impostati tutti i parametri, avviare la scansione premendo il pulsante Esegui .
   NOTA: per una scansione ad alta risoluzione, la dimensione del passo sarà 1000 μm e per una scansione a bassa risoluzione, la dimensione del passo sarà 250 μm. La velocità di scansione può essere scelta da 5 mm/s a 1 mm/s. L'area della scansione dipende dalle dimensioni del campione.
4. Eseguire una scansione in background con i raggi X spenti per determinare i conteggi scuri da qualsiasi luce presente nell'involucro diversa dal campione.

3. Eseguire una scansione del campione con la radiografia accesa

1. Assicurarsi che il campione sia ancora nella posizione corretta con la testa a croce laser per iniziare la scansione.
2. Chiudere l'involucro e fissare l'interblocco. Se i PMT sono spenti (ad esempio, spenti prima di aprire lo sportello), accendere l'alimentatore PMT.
3. Aprire il software di controllo del sistema di imaging. Immettere i valori per le dimensioni del passaggio, la velocità di scansione e l'area di scansione. Una volta impostati tutti i parametri, premi il pulsante Esegui per avviare la scansione.
   NOTA: per una scansione ad alta risoluzione, la dimensione del passo sarà 1000 μm e per una scansione a bassa risoluzione, la dimensione del passo sarà 250 μm. La velocità di scansione può essere scelta da 5 mm/s a 1 mm/s. L'area della scansione dipende dalle dimensioni del campione.
4. Ottenere la scansione per il campione con la radiografia accesa.
5. Innanzitutto, eseguire la scansione a bassa risoluzione con dimensioni di passo maggiori e velocità di scansione più elevate per ottenere un'immagine preliminare della destinazione. Dopo aver ottenuto una scansione a bassa risoluzione dell'area desiderata del campione, ottenere la scansione a risoluzione più elevata con una dimensione del passo inferiore e una velocità di scansione inferiore.
6. Spegnere l'alimentazione PMT prima di aprire lo sportello.

4. Formare l'immagine

1. Convalidare la scansione corrente è l'imaging dell'area di interesse del target. In caso contrario, interrompere la scansione corrente premendo il pulsante Stop .
2. Regolare nuovamente le posizioni di scansione nel software di controllo e premere nuovamente il pulsante Esegui .
   NOTA: l'asse y viene registrato continuamente a partire dalla prima riga della scansione. Durante l'esecuzione di una scansione, viene registrato il numero di conteggi per ciascuna lunghezza d'onda e tempo dall'ultima posizione del motore aggiornata. Il tempo registrato terrà conto di eventuali variazioni della velocità del motore, quindi del tempo di esposizione. Per ogni pixel, il conteggio/secondo viene normalizzato. Il motore dell'asse y viaggia per scansionare la fine della riga corrente dell'asse y e il motore torna alla posizione iniziale. Quindi il motore dell'asse x aumenta la sua posizione di una dimensione del passo definita dall'utente e scansiona la seconda riga dell'asse y. Questo processo viene ciclizzato fino a quando il motore dell'asse x raggiunge la larghezza specificata per la direzione x. L'utente può controllare le dimensioni della scansione, la velocità del motore e le posizioni di avviamento del motore. La dimensione del passo determinerà la dimensione dei pixel nell'immagine finale dell'asse y.

5. Coltura di batteri per l'imaging in condizioni sterili (se vengono ripresi sensori di crescita batterica)

1. Per preparare una nuova coltura di Staphylococcus aureus 1945 (ATCC 25923), utilizzare una colonia da una piastra TSA (agar di soia triptico) striata entro 1 settimana per inoculare 5 ml di brodo di soia tripttica sterile (TSB).
2. Agitare delicatamente la coltura batterica a 37 °C per 16-18 ore fino alla fase stazionaria.
3. Successivamente, pellettare la coltura dal TSB tramite centrifugazione a 4000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT) e lavare il pellet due volte con Phosphate Buffer Solution (PBS) e risospendere il pellet in 5 ml di PBS sterile.
4. Quantificare la concentrazione batterica utilizzando la densità ottica a 600 nm utilizzando l'intervallo lineare, che è l'intervallo OD in cui viene verificata la legge di Beer-Lambert (OD = kN; k è un coefficiente relativo all'estinzione molecolare e alla lunghezza del percorso ottico, N è la concentrazione batterica)¹⁶. Quindi diluire il campione a 10⁵ cellule/ml usando PBS sterile.
5. Sterilizzare l'Agar di Soia Trittica (TSA) in autoclave e quindi raffreddare mescolando fino a raggiungere la temperatura di 45 °C. Inoculare i batteri nella TSA.
6. Pipettare la coltura batterica diluita (100 μL) sulla superficie del sensore impiantabile.
   NOTA: Gli impianti sono stati sterilizzati mediante immersione in etanolo al 70% per 5 minuti e conservati in PBS sterile.
7. Pipetta 100 μL di TSA non inoculata su un altro impianto sterile come controllo
8. Aggiungere altri 100 μL di TSA non inoculata sul sensore impiantabile prima che venga incubato a 37 °C per 48 ore prima dell'impianto.

Risultati

Come studio preliminare, abbiamo ripreso il sensore dell'asta intramidollare in una tibia alesata di un cadavere di coniglio¹⁴. Il sensore ha tre regioni distinte: la regione di riferimento, la regione pH 8 (pH basico) e la regione pH 4 (pH acido). La regione di riferimento è la particella scintillatrice (Gd 2O₂S:Eu) incorporata in film epossidico irruvidito. Le regioni distintive del pH acido e basico rappresentano situazioni infette e non infette all'interno del canale int...

Discussione

Per essere in grado di rilevare e studiare precocemente le infezioni ortopediche associate agli impianti per evitare complicazioni da osteomielite e procedure chirurgiche secondarie, abbiamo introdotto XELCI come una nuova tecnica di imaging funzionale. È paragonabile alle tecniche attualmente disponibili per il monitoraggio del pH attraverso i tessuti.

Durante il posizionamento del campione per l'imaging, utilizziamo una testa a croce laser collegata a ottiche di messa a fuoco policapillare ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 degree elbow	Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA
Bromo Cresol Green	Sigma-Aldrich	45ZW10
Bromo Thymol Blue	Sigma	76-59-5
ElectraCOOL Advanced thermoelectric cool plate	Pollock industries, White River, VT, USA	TCP 50
Ethanol	Beantown Chemical, 9 Sagamore Park Road Hudson, NH 03051	64-17-5
Gadolinium Oxysulfide Europium doped (Gd2O2S:Eu) particles-~8.0 µm	Phosphor Technologies Inc., Stevenage, England	UKL63/N-R1
LabVIEW	National Instruments, Austin, TX
Motorized Linear Vertical Stage Model (for Z axis)	Motion Control, Smithtown, NY, USA	AT10-60
National instruments c-DAQ 9171	National Instruments, Austin, TX	NI cDAQ™-9171
One piece acrylic light guide	Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA
pH 4 buffer	VWR BDH Chemicals	BDH5024
pH 8 buffer	VWR BDH Chemicals	BDH5060
Phosphate Buffer Solution	MP Biomedicals, Irvine, CA. USA	2810305
Photo multiplier tubes Model P25PC-16	SensTech, Surrey, UK	Model P25PC-16
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	ATCC 25923
Tryptic Soy Agar	Teknova, Hollister, CA, USA	T0520
Tryptic Soy Broth	EMD Millipore, Burlington, MA, USA	1005255000
X-ray source-iMOXS	Institute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Germany
X,Y motorized stage-30 cm x 15 cm x 6 cm travel	Thorlabs Inc., Newton, NJ, USA	LTS300 and LTS150