Imagerie chimique à haute résolution spatiale des infections associées aux implants avec imagerie chimique par luminescence excitée par rayons X à travers les tissus

Résumé

Nous présentons ici un protocole de détection optique haute résolution d’informations chimiques autour de dispositifs médicaux implantés avec imagerie chimique par luminescence excitée par rayons X (XELCI). Cette nouvelle technique d’imagerie est développée dans notre laboratoire qui permet d’étudier la biochimie des infections associées aux implants.

Résumé

Les infections microbiennes associées aux dispositifs médicaux implantables sont une préoccupation majeure dans l’échec de la fixation des fractures. Un diagnostic précoce d’une telle infection permettra une éradication réussie avec des antibiotiques sans frais supplémentaires pour une deuxième chirurgie. Nous décrivons ici XELCI comme une technique avec une résolution élevée des rayons X, une spécificité d’implant et une sensibilité chimique aux concentrations chimiques d’images non invasives près de la surface des dispositifs médicaux implantés. Les dispositifs sont recouverts de surfaces de rapport chimique. Cette surface chimiquement sensible se compose de deux couches enduites d’un dispositif médical implantable; une couche sensible au pH (bleu de bromothymol ou hydrogel incorporé au vert de bromocrésol) qui est recouverte d’une couche scintillatrice émettant de lalumière rouge (Gd2O2S: Eu) pour la surveillance. Un faisceau de rayons X focalisés irradie une tache sur l’implant, et la lumière rouge générée par le scintillateur (avec des pics de 620 nm et 700 nm) est transmise à travers la couche de détection qui modifie le rapport spectral en fonction du pH. Une image est générée en scannant le faisceau de rayons X à travers l’implant et en mesurant le rapport spectral de la lumière traversant le tissu point par point. Nous avons utilisé cette technique d’imagerie pour surveiller les infections associées aux implants précédemment sur la surface osseuse du fémur avec un capteur de plaque implantable modifié. Nous étudions maintenant les changements de pH qui se produisent à la suite d’infections tibiales intramédullaires par bâtonnet. Deux types différents de tiges intramédullaires sont utilisés dans les études pré-pilotes sur les lapins, et nous avons appris que la technique XELCI pourrait être utilisée pour surveiller tout changement chimique qui se produit non seulement à la surface de l’os, mais aussi à l’intérieur de l’os. Ainsi, cela permet une imagerie non invasive, à haute résolution spatiale et à faible pH local de fond pour étudier la biochimie des infections associées aux implants.

Introduction

Aux États-Unis, environ 2 millions de dispositifs de fixation des fractures sont insérés chaque année, et 5% à 10% d’entre eux conduisent à des infections associées aux implants¹. Ces infections sont plus difficiles à traiter avec des antibiotiques à des stades ultérieurs en raison de l’hétérogénéité et de la nature résistante aux antibiotiques des biofilms ^2,3. Si elles sont diagnostiquées tôt, les infections peuvent être traitées avec des antibiotiques et un débridement chirurgical pour éviter des coûts médicaux supplémentaires pour une deuxième chirurgie visant à remplacer le matériel au site de fracture traité. La radiographie simple et d’autres techniques radiographiques avancées sont appliquées au diagnostic des infections orthopédiques associées aux implants, des non-unions et des complications connexes. Bien que ces techniques soient fréquemment utilisées pour acquérir des informations structurelles sur l’os et les tissus environnants lors de l’implant orthopédique, elles ne sont pas en mesure de fournir des informations biochimiques dans l’environnement spécifique. Ainsi, nous avons développé une nouvelle technique d’imagerie chimique par luminescence excitée par rayons X (XELCI) pour l’imagerie à haute résolution d’informations biochimiques non invasive au site de l’implant. Le diagnostic des infections orthopédiques associées aux implants est généralement effectué par un ou plusieurs moyens différents. Les observations cliniques (douleur, gonflement, rougeur, écoulement de la plaie, etc.) suggèrent les premiers signes d’infection. Plus tard, des expériences radiologiques et de laboratoire sont effectuées pour confirmer l’échec de la progression de la cicatrisation osseuse et identifier l’organisme pathogène ^4,5. Des techniques de médecine nucléaire telles que la tomodensitométrie (TDM), l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et les méthodes radionucléotidiques telles que la tomodensitométrie par émission monophotonique (SPECT) et la tomographie par émission de positons (TEP) sont utilisées pour une meilleure visualisation de l’implant infecté et de l’infection associée ^6,7. La tomodensitométrie et l’IRM sont avantageuses pour déterminer la nécrose osseuse et les anomalies des tissus mous, respectivement, mais provoquent des interférences à une distance rapprochée des implants métalliques⁸. Différentes méthodologies de rayons X telles que la TEMP et la TEP en combinaison avec des analytes marqués aux radio-isotopes comme agents de contraste d’imagerie in vivo sont largement utilisées pour diagnostiquer l’ostéomyélite associée aux implants². Les applications actuelles combinent à la fois les données de tomodensitométrie et les données d’étiquetage de la TEMP ou de la TEP pour générer des informations anatomiques⁹. Bien qu’une ou plusieurs de ces modalités d’imagerie soient utilisées pour faciliter le diagnostic de l’infection, elles ne peuvent pas détecter les variations de pH associées à l’infection tôt pour initier les traitements avec des antibiotiques afin d’éviter des dépenses médicales et chirurgicales supplémentaires.

Le principal avantage de l’utilisation du système d’imagerie utilisé dans cette étude pour surveiller les infections associées aux implants est sa capacité à révéler des informations biochimiques sur le microenvironnement du biofilm avec une référence spectrale. Bien que l’accent soit mis sur l’imagerie et la cartographie du pH au site infecté, cette méthode peut être modifiée pour surveiller d’autres biomarqueurs spécifiques aux infections associées aux implants. Ainsi, XELCI permet de comprendre la physiopathologie de l’infection. L’imagerie à haute résolution spatiale permet de cartographier l’hétérogénéité à mesure que l’infection se développe. Le pH à la surface où se produit la formation du biofilm est très important pour comprendre les changements biochimiques. En outre, d’autres changements du microenvironnement peuvent se produire en raison des réponses au stress liées aux antibiotiques par les bactéries^10,11. Grâce à l’imagerie spécifique à la surface et à haute résolution spatiale, l’effet antibiotique sur le microenvironnement du biofilm peut être surveillé. La technique peut également être utilisée pour étudier l’environnement du biofilm pour des expériences ciblées d’administration de médicaments. Nous pouvons étudier la libération ciblée de médicaments à faible pH ou l’augmentation du pH pour les rendre plus susceptibles de travailler à un pH plus élevé.

Trois caractéristiques spécifiques de cette technique d’imagerie sont la résolution des rayons X, la spécificité de la surface de l’implant et la sensibilité chimique (Figure 1A). Ces caractéristiques peuvent être comparées aux techniques d’imagerie actuellement disponibles pour l’imagerie des infections liées aux implants orthopédiques (Figure 1B). Une fois irradiées par rayons X, les particules de phosphore recouvertes de la surface de l’implant génèrent une lumière rouge et proche IR (NIR) qui peut pénétrer à travers quelques centimètres de tissu (bien qu’avec une certaine atténuation)^12,13. Le tableau 1 montre certaines des caractéristiques du système d’imagerie développé par rapport à d’autres méthodes qui ont été utilisées pour mesurer le pH dans les biofilms ou à travers les tissus.

XELCI est une nouvelle technique d’imagerie permettant d’acquérir des informations chimiques à haute résolution spatiale optiquement à proximité de dispositifs médicaux implantés en combinaison avec l’excitation aux rayons X, comme le montre la figure 2. Ici, l’excitation sélective et la détection optique des particules de phosphore excitables par rayons X sont utilisées. L’implant est recouvert de deux couches, une couche de polymère incorporée de colorant sensible au pH sur une couche de particules scintillantes. Une fois qu’une séquence de faisceaux de rayons X focalisés irradie l’implant, la couche scintillatrice génère de la lumière visible (620 nm et 700 nm). Cette lumière produite traverse la couche sensible au pH modulant le spectre de luminescence en fonction du pH du milieu environnant. Un faible pH est généralement associé à une infection et à la formation de biofilm; à mesure que l’infection progresse, le pH passe du pH physiologique (pH 7,2) à acide (moins de pH 7), et le colorant pH dans le capteur change de couleur et donc d’absorbance. La variation du spectre de luminescence est illustrée à la figure 2E pour le colorant au pH vert de bromocrésol à pH 7 et pH 4. La lumière transmise à travers les tissus et les os est recueillie et le rapport spectral détermine le pH. Pour générer une image de pH, le faisceau de rayons X focalisé irradie un point à la fois dans le film scintillateur et balaye le faisceau point par point à travers l’échantillon. Auparavant, cette technique a été appliquée pour imager la variation du pH à la surface des implants orthopédiques^14,15 et l’ont testée pour surveiller les variations de pH dans le canal intramédullaire à travers les os et les tissus.

La figure 3 ci-dessous montre un schéma du système d’imagerie. Les composants de base du système d’imagerie sont la source d’excitation des rayons X avec optique polycapillaire, un guide de lumière acrylique monobloc se connectant à deux tubes photomultiplicateurs, l’étage motorisé x, y et z (30 cm x 15 cm x 6 cm de course) et l’ordinateur connecté pour l’acquisition de données. La source de rayons X, l’étage x, y, z et l’optique de collecte (coude, guide de lumière, tubes photomultiplicateurs (PMT)) se trouvent dans l’enceinte à l’épreuve des rayons X, tandis que le contrôleur de rayons X, la source d’alimentation pour les PMT, le générateur de fonctions connecté à la carte d’acquisition de données (DAQ) et l’ordinateur sont conservés à l’extérieur. Un bouton-poussoir, normalement ouvert, placé entre l’enceinte et l’avant de la porte sert de verrouillage. Si la porte n’est pas complètement fermée (l’interrupteur de verrouillage est ouvert), la source de rayons X ne s’allume pas et elle s’éteint automatiquement si elle est ouverte pendant le fonctionnement. Les moteurs peuvent exécuter un balayage continu et être déplacés vers n’importe quel endroit discret. La vitesse de balayage pour l’axe des y est généralement de 1 à 5 mm/s, tandis que la taille du pas sur l’axe des x peut être choisie généralement entre 150 et 2000 μm. Les paramètres peuvent être choisis en fonction de la résolution spatiale requise. Même les temps d’exposition sont confirmés par une vitesse constante tout au long d’un balayage continu.

Une fois que le faisceau de rayons X focalisé est irradié sur les particules de luminescence des rayons X, la lumière générée traversera le film sensible au pH en modulant la lumière en fonction du pH environnant. La lumière transmise interagira (dispersera et absorbera partiellement) avec un tissu, tandis que l’atténuation de la lumière par diffusion et absorption augmentera à mesure que l’épaisseur du tissu augmente. L’optique de la collection comprend un guide de lumière acrylique bifurqué d’une seule pièce équipé d’un coude en aluminium réfléchissant (avec une courbure à 90° et une surface intérieure réfléchissante polie) au début. Ceci afin de s’assurer que la lumière est collimatée dès que la lumière atteint le guide de lumière. Ces ajouts ont considérablement amélioré l’efficacité de la collecte de la lumière. Pour plus de détails, la figure 4 montre les dessins de la machine du coude et du guide lumineux. Le coude à 90° a été usiné en aluminium avec la surface interne polie à une finition miroir et le guide de lumière a été usiné à l’acrylique. Nous avons également fixé un filtre de lumière bleue passe-long à large gamme (bloquant la lumière de 350 à 450 nm) au début du coude pour s’assurer que seule la lumière rouge passera à travers. L’extrémité du guide de lumière acrylique monobloc se bifurque en deux flux menant à deux PMT différentes. Les PMT sont enfermés dans une petite boîte métallique étanche à la lumière qui est en contact avec un refroidisseur thermoélectrique pour refroidir les PMT à ~5 ° C. Au début de l’un des PMT, un filtre passe-long à plage étroite (bloquant la lumière 570-640 nm et passant la lumière 640-740 nm) est fixé pour mesurer uniquement la lumière de 700 nm. Par conséquent, la lumière de 620 nm et de 700 nm peut être calculée séparément. Les PMT sont configurés en mode de comptage de photons et génèrent des impulsions logiques transistor-transistor (TTL) pour chaque photon détecté. Un système DAQ compte les impulsions (point de saturation 20 millions d’impulsions par seconde) à l’aide d’une communication USB. Deux cartes d’intensité distinctes sont générées après le traitement des données, et une image finale est créée en considérant le rapport entre l’intensité de la longueur d’onde du signal (620 nm) et l’intensité de la longueur d’onde de référence (700 nm). Ce rapport tient compte des différences dans l’efficacité totale de la collecte de la lumière, qui dépendent fortement de la position de l’optique de collecte, de l’intensité de l’irradiation des rayons X et de l’épaisseur des tissus. De plus, une région de référence séparée spatialement sans colorant indicateur de pH tient compte de la distorsion spectrale due à la pénétration tissulaire dépendante de la longueur d’onde. Un langage de programmation graphique est utilisé pour contrôler le système d’imagerie, et un organigramme de base de l’opération est illustré ci-dessous. La configuration d’imagerie, à l’exception de l’ordinateur, du contrôleur de rayons X et de l’unité d’acquisition de données, est enfermée dans un boîtier de radiographie sécurisé pour minimiser l’exposition aux rayonnements.

Protocole

Cette procédure suit les protocoles d’utilisation des animaux approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Clemson. Les expériences sont menées conformément au Comité de biosécurité (IBC) et au Comité de radioprotection (RSC) de l’Université de Clemson, ainsi qu’aux directives et réglementations pertinentes.

REMARQUE : un organigramme de l’exécution d’une analyse XELCI est illustré ci-dessous à la figure 5 , suivi d’une description détaillée étape par étape de la procédure d’imagerie.

1. Initialiser le système et acquérir une radiographie simple

1. Allumez le refroidisseur PMT, il faut généralement ~ 15 minutes pour atteindre le point de consigne (par exemple, 4 ° C). Effectuez le reste des étapes d’initialisation avant d’activer les PMT.
2. Ouvrez le logiciel de contrôle du système d’imagerie. Le logiciel de contrôle communique et initialise l’étage motorisé de l’axe x-y-z. Déplacez l’axe x et l’axe y de l’étage vers la position de départ souhaitée.
3. Placez l’échantillon sur l’étage mobile x-y-z. Positionnez la hauteur de l’échantillon (axe z), de sorte que le dispositif radioluminescent se trouve de 5 à 5,5 cm sous l’optique de foyer polycapillaire en augmentant ou en abaissant la source de rayons X et/ou la scène. Positionnez également l’échantillon dans le plan x-y à l’aide de la traverse laser (deux pointeurs laser en forme de ligne rouge attachés au capillaire de focalisation des rayons X et positionnés à 90° l’un par rapport à l’autre de sorte que les lignes se croisent là où la radiographie se concentrera). Éteignez les lasers avant d’activer les rayons X et les PMT.
4. Fixez le verrouillage du bouton-poussoir à la porte d’entrée du boîtier d’imagerie. Mettez l’alimentation de la source de rayons. Retirez l’optique de focalisation pour obtenir la radiographie ordinaire de l’échantillon.
5. Ouvrez le logiciel de contrôle des rayons X et réglez la puissance des rayons X (en ajustant la tension et le courant). Ouvrez l’obturateur à rayons X avec le logiciel de contrôle des rayons X.
6. Ouvrez le logiciel de la caméra à rayons X. Appuyez sur le bouton d’exposition pour prendre la radiographie ordinaire. Éteignez l’exposition et désactivez la radiographie.
   REMARQUE : Si nécessaire, déplacez l’échantillon pour améliorer la position de l’échantillon ou acquérez une série de rayons X à différentes positions afin qu’ils puissent être rassemblés pour obtenir une vue radiographique plus grande. On peut également acquérir une radiographie sur un système séparé, mais le co-enregistrement entre XELCI et la radiographie devient plus difficile si l’échantillon se déplace.
7. Ouvrez la porte du boîtier.

2. En option, effectuez un balayage en arrière-plan avec la radiographie désactivée

1. Connectez à nouveau l’optique polycapillaire à la source de rayons X.
2. Fermez le boîtier et fixez le verrouillage. Mettez le bloc d’alimentation PMT sous tension.
   REMARQUE: L’alimentation PMT doit toujours être éteinte chaque fois que la porte est ouverte ou sur le point d’être ouverte pour éviter une surexposition à la lumière.
3. Ouvrez le logiciel de contrôle du système d’imagerie et spécifiez la taille de l’étape, la vitesse de numérisation et la zone de numérisation. Une fois tous les paramètres définis, lancez l’analyse en appuyant sur le bouton Exécuter .
   REMARQUE: Pour un balayage haute résolution, la taille de pas sera de 1000 μm et pour un balayage à basse résolution, la taille de pas sera de 250 μm. La vitesse de numérisation peut être choisie de 5 mm/s à 1 mm/s. La zone de balayage dépend des dimensions de l’échantillon.
4. Exécutez une analyse en arrière-plan avec la radiographie désactivée pour déterminer le nombre d’obscurités de toute lumière présente dans l’enceinte autre que l’échantillon.

3. Effectuez un scan d’échantillon avec la radiographie activée

1. Assurez-vous que l’échantillon est toujours dans la bonne position avec la traverse laser pour commencer l’analyse.
2. Fermez le boîtier et fixez le verrouillage. Si les PMT sont éteints (par exemple, éteints avant d’ouvrir la porte), mettez le bloc d’alimentation PMT.
3. Ouvrez le logiciel de contrôle du système d’imagerie. Entrez les valeurs de taille d’étape, de vitesse de numérisation et de zone d’analyse. Une fois tous les paramètres définis, appuyez sur le bouton Exécuter pour lancer l’analyse.
   REMARQUE: Pour un balayage haute résolution, la taille de pas sera de 1000 μm et pour un balayage à basse résolution, la taille de pas sera de 250 μm. La vitesse de numérisation peut être choisie de 5 mm/s à 1 mm/s. La zone de balayage dépend des dimensions de l’échantillon.
4. Obtenez le scan pour l’échantillon avec la radiographie activée.
5. Tout d’abord, effectuez le balayage basse résolution avec des pas plus grands et une vitesse de balayage plus élevée pour obtenir une image préliminaire de la cible. Après avoir obtenu un balayage basse résolution de la zone souhaitée de l’échantillon, obtenez le balayage à plus haute résolution avec une taille de pas plus petite et une vitesse de numérisation inférieure.
6. Coupez l’alimentation PMT avant d’ouvrir la porte.

4. Formation de l’image

1. Validez que l’analyse en cours est l’imagerie de la zone d’intérêt de la cible. Sinon, arrêtez l’analyse en cours en appuyant sur le bouton Arrêter .
2. Ajustez à nouveau les positions de numérisation dans le logiciel de contrôle et appuyez à nouveau sur le bouton Exécuter .
   REMARQUE: L’axe y est enregistré en continu à partir de la première ligne de l’analyse. Lors de l’exécution d’un balayage, le nombre de comptages par longueur d’onde et le temps écoulé depuis la dernière mise à jour de la position du moteur est enregistré. Le temps enregistré tiendra compte de tout changement de vitesse du moteur, donc du temps d’exposition. Pour chaque pixel, le nombre de points/seconde est normalisé. Le moteur de l’axe y se déplace pour balayer l’extrémité de la ligne actuelle de l’axe y et le moteur revient à la position de départ. Ensuite, le moteur de l’axe des x augmente sa position d’une taille de pas définie par l’utilisateur et balaye la deuxième rangée de l’axe y. Ce processus est cyclé jusqu’à ce que le moteur de l’axe x atteigne la largeur spécifiée pour la direction x. L’utilisateur peut contrôler la taille du balayage, la vitesse du moteur et les positions de démarrage du moteur. La taille de l’étape déterminera la taille des pixels dans l’image finale de l’axe y.

5. Culture de bactéries pour l’imagerie dans des conditions stériles (si des capteurs cultivés par des bactéries sont imagés)

1. Pour préparer une culture fraîche de Staphylococcus aureus 1945 (ATCC 25923), utiliser une colonie d’une plaque de gélose au soja TSA (gélose tryptique) striée en 1 semaine pour inoculer 5 ml de bouillon de soja tryptique stérile (BST).
2. Agiter doucement la culture bactérienne à 37 °C pendant 16-18 h jusqu’à la phase stationnaire.
3. Ensuite, granuler la culture du BST par centrifugation à 4000 x g pendant 10 minutes à température ambiante (RT) et laver la pastille deux fois avec une solution tampon de phosphate (PBS) et remettre la pastille en suspension dans 5 mL de PBS stérile.
4. Quantifier la concentration bactérienne en utilisant la densité optique à 600 nm en utilisant la gamme linéaire, qui est la gamme OD où la loi de Beer-Lambert est vérifiée (OD = kN; k est un coefficient relatif à l’extinction moléculaire et à la longueur du trajet optique, N est la concentration bactérienne)¹⁶. Diluer ensuite l’échantillon à 10⁵ cellules/mL à l’aide de PBS stérile.
5. Stériliser la gélose au soja tryptique (TSA) à l’autoclavage, puis refroidir en mélangeant jusqu’à ce que la température atteigne 45 °C. Inoculer les bactéries dans la TSA.
6. Pipeter la culture bactérienne diluée (100 μL) sur la surface du capteur implantable.
   REMARQUE : Les implants ont été stérilisés par immersion dans de l’éthanol à 70 % pendant 5 minutes et stockés dans du PBS stérile.
7. Pipette 100 μL de TSA non inoculé sur un autre implant stérile comme témoin
8. Ajouter 100 μL supplémentaires de TSA non inoculé sur le capteur implantable avant qu’il ne soit incubé à 37 °C pendant 48 h avant l’implantation.

Résultats

Comme étude préliminaire, nous avons imagé le capteur de tige intramédullaire dans un tibia alésé d’un cadavre de lapin¹⁴. Le capteur comporte trois régions distinctes : la région de référence, la région pH 8 (pH basique) et la région pH 4 (pH acide). La région de référence est la particule scintillatrice(Gd2O2S:Eu) incorporée dans un film époxy rugueux. Les régions de pH acides et basiques distinctives représentent les situations infectées et non infect...

Discussion

Pour être en mesure de détecter et d’étudier rapidement les infections orthopédiques associées aux implants afin d’éviter les complications de l’ostéomyélite et des interventions chirurgicales secondaires, nous avons introduit XELCI comme une nouvelle technique d’imagerie fonctionnelle. Il est comparable aux techniques actuellement disponibles pour la surveillance du pH à travers les tissus.

Lors du positionnement de l’échantillon pour l’imagerie, nous utilisons une trave...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 degree elbow	Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA
Bromo Cresol Green	Sigma-Aldrich	45ZW10
Bromo Thymol Blue	Sigma	76-59-5
ElectraCOOL Advanced thermoelectric cool plate	Pollock industries, White River, VT, USA	TCP 50
Ethanol	Beantown Chemical, 9 Sagamore Park Road Hudson, NH 03051	64-17-5
Gadolinium Oxysulfide Europium doped (Gd2O2S:Eu) particles-~8.0 µm	Phosphor Technologies Inc., Stevenage, England	UKL63/N-R1
LabVIEW	National Instruments, Austin, TX
Motorized Linear Vertical Stage Model (for Z axis)	Motion Control, Smithtown, NY, USA	AT10-60
National instruments c-DAQ 9171	National Instruments, Austin, TX	NI cDAQ™-9171
One piece acrylic light guide	Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA
pH 4 buffer	VWR BDH Chemicals	BDH5024
pH 8 buffer	VWR BDH Chemicals	BDH5060
Phosphate Buffer Solution	MP Biomedicals, Irvine, CA. USA	2810305
Photo multiplier tubes Model P25PC-16	SensTech, Surrey, UK	Model P25PC-16
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	ATCC 25923
Tryptic Soy Agar	Teknova, Hollister, CA, USA	T0520
Tryptic Soy Broth	EMD Millipore, Burlington, MA, USA	1005255000
X-ray source-iMOXS	Institute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Germany
X,Y motorized stage-30 cm x 15 cm x 6 cm travel	Thorlabs Inc., Newton, NJ, USA	LTS300 and LTS150