Imagem Química de Alta Resolução Espacial de Infecções Associadas a Implantes com Luminescência Expedida por Raios-X Imagem Química Através do Tecido

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para detecção óptica de alta resolução de informações químicas em torno de dispositivos médicos implantados com imagem química de luminescência excitada por raios-X (XELCI). Esta nova técnica de imagem é desenvolvida em nosso laboratório, o que permite estudar a bioquímica de infecção associada ao implante.

Resumo

As infecções microbianas associadas a dispositivos médicos implantáveis são uma grande preocupação na falha na fixação de fraturas. O diagnóstico precoce dessa infecção permitirá a erradicação bem-sucedida com antibióticos sem um custo extra para uma segunda cirurgia. Neste artigo, descrevemos XELCI como uma técnica com alta resolução de raios-X, especificidade do implante e sensibilidade química a concentrações químicas de imagens não invasivas próximas à superfície de dispositivos médicos implantados. Os dispositivos são revestidos com superfícies de relatórios químicos. Esta superfície quimicamente responsiva consiste em duas camadas revestidas em um dispositivo médico implantável; uma camada sensível ao pH (azul de bromotimol ou hidrogel incorporado verde bromocresol) que é revestida sobre uma camada cintiladora emissora de luz vermelha (Gd 2O₂S: Eu) para monitorização. Um feixe de raios X focalizado irradia um ponto no implante, e a luz vermelha gerada pelo cintilador (com picos de 620 nm e 700 nm) é transmitida através da camada sensora, o que altera a razão espectral dependendo do pH. Uma imagem é gerada pela varredura do feixe de raios X através do implante e pela medição da razão espectral da luz que passa pelo tecido ponto a ponto. Usamos esta técnica de imagem para monitorar infecções associadas ao implante previamente na superfície óssea do fêmur com um sensor de placa implantável modificado. Agora estamos estudando as alterações de pH que ocorrem a partir de infecções de bastonetes intramedulares tibiais. Dois tipos diferentes de desenhos de bastonetes intramedulares são usados em estudos pré-piloto em coelhos, e aprendemos que a técnica XELCI pode ser usada para monitorar quaisquer alterações químicas que ocorram não apenas na superfície óssea, mas também dentro do osso. Assim, isso permite que imagens não invasivas, de alta resolução espacial e baixo pH local de fundo estudem a bioquímica de infecção associada ao implante.

Introdução

Nos Estados Unidos, cerca de 2 milhões de dispositivos de fixação de fraturas são inseridos anualmente, e 5%-10% deles levam a infecções associadas ao^implante1. Essas infecções são mais difíceis de tratar com antibióticos em estágios mais avançados devido à heterogeneidade e à natureza resistente aos antibióticos dos biofilmes ^2,3. Se forem diagnosticadas precocemente, as infecções podem ser tratadas com antibióticos e desbridamento cirúrgico para evitar custos médicos extras para uma segunda cirurgia para substituir o hardware no local da fratura tratada. A radiografia simples e outras técnicas radiográficas avançadas são aplicadas no diagnóstico de infecções associadas a implantes ortopédicos, não-uniões e complicações relacionadas. Embora essas técnicas sejam frequentemente usadas para adquirir informações estruturais do osso e tecido circundante no implante ortopédico, elas são incapazes de fornecer informações bioquímicas no ambiente específico. Assim, desenvolvemos uma nova técnica de imagem química por luminescência excitada por raios X (XELCI) para imagens de alta resolução de informações bioquímicas de forma não invasiva no local do implante. O diagnóstico de infecções associadas a implantes ortopédicos é comumente realizado por um ou uma combinação de diferentes meios. Observações clínicas (dor, inchaço, vermelhidão, descarga da ferida, etc.) sugerem os primeiros sinais de infecção. Posteriormente, experimentos radiológicos e laboratoriais são realizados para confirmar a falha na progressão do reparo ósseo e identificar o organismo patogênico ^4,5. Técnicas de medicina nuclear como a tomografia computadorizada (TC), a ressonância magnética (RM) e os métodos de radionucleotídeos como a Tomografia Computadorizada por Emissão de Fóton Único (SPECT) e a Tomografia por Emissão de Pósitrons (PET) são utilizadas para melhor visualização do implante infectado e da infecção associada ^6,7. A TC e a RM são vantajosas na determinação de necrose óssea e anormalidades de partes moles, respectivamente, mas causam interferências a uma curta distância dos implantes metálicos⁸. Diferentes metodologias de raios X, como SPECT e PET, em combinação com analitos marcados com radioisótopos, como agentes de contraste de imagem in vivo, são amplamente utilizadas para diagnosticar osteomielite associada ao implante2^. As aplicações atuais combinam dados de tomografia computadorizada e dados de marcação de SPECT ou PET para gerar informações anatômicas⁹. Embora uma ou mais dessas modalidades de imagem sejam usadas para auxiliar no diagnóstico de infecção, elas não conseguem detectar precocemente as variações de pH associadas à infecção para iniciar os tratamentos com antibióticos para evitar gastos médicos e cirúrgicos extras.

A principal vantagem da utilização do sistema de imagem utilizado neste estudo para monitorar infecções associadas ao implante é sua capacidade de revelar informações bioquímicas sobre o microambiente do biofilme com uma referência espectral. Embora o foco principal seja a imagem e o mapeamento do pH no local infectado, esse método pode ser alterado para monitorar outros biomarcadores específicos para infecções associadas ao implante. Assim, XELCI permite compreender a fisiopatologia da infecção. A imagem de alta resolução espacial permite mapear a heterogeneidade à medida que a infecção cresce. O pH na superfície onde ocorre a formação do biofilme é muito importante para a compreensão das mudanças bioquímicas. Além disso, outras alterações no microambiente podem ocorrer devido às respostas de bactérias ao estresse relacionadas a antibióticos^10,11. Devido à imagem superficial específica e de alta resolução espacial, o efeito do antibiótico no microambiente do biofilme pode ser monitorado. A técnica também pode ser usada para estudar o ambiente de biofilme para experimentos direcionados de liberação de fármacos. Podemos estudar a liberação de fármacos de baixo pH direcionados ou a elevação do pH para torná-los mais suscetíveis a trabalhar em pH mais alto.

Três características específicas desta técnica de imagem são a resolução dos raios X, a especificidade da superfície do implante e a sensibilidade química (Figura 1A). Essas características podem ser comparadas com as técnicas de imagem atualmente disponíveis para infecções por imagem relacionadas a implantes ortopédicos (Figura 1B). Uma vez irradiadas com raios X, as partículas de fósforo revestidas na superfície do implante geram luz vermelha e de infravermelho próximo (NIR) que pode penetrar através de alguns centímetros de tecido (embora com alguma atenuação)^12,13. A Tabela 1 mostra algumas das características do sistema de imagem desenvolvido em comparação com outras formas que têm sido usadas para medir o pH em biofilmes ou através do tecido.

XELCI é uma nova técnica de imagem para adquirir informações químicas de alta resolução espacial opticamente perto de dispositivos médicos implantados em combinação com excitação de raios-X, como mostrado na Figura 2. Aqui a excitação seletiva e a detecção óptica de partículas de fósforo excitáveis por raios X são utilizadas. O implante é revestido com duas camadas, uma camada de polímero incorporada por corante sensível ao pH sobre uma camada de partículas cintiladoras. Uma vez que uma sequência de feixes de raios X focalizados irradia o implante, a camada cintiladora gera luz visível (620 nm e 700 nm). Essa luz produzida passa através da camada sensível ao pH modulando o espectro de luminescência dependendo do pH do ambiente circundante. O pH baixo geralmente está associado à infecção e à formação de biofilme; à medida que a infecção progride, o pH muda de pH fisiológico (pH 7,2) para ácido (menor que pH 7), e o corante de pH no sensor muda de cor e, portanto, de absorbância. A variação do espectro de luminescência é mostrada na Figura 2E para o corante verde Bromocresol pH pH pH 7 e pH 4. A luz transmitida através do tecido e do osso é coletada e a razão espectral determina o pH. Para gerar uma imagem de pH, o feixe de raios X focalizado irradia um ponto de cada vez no filme cintilador e varre o feixe ponto a ponto em toda a amostra. Anteriormente, esta técnica foi aplicada para obter imagens da variação do pH na superfície dos implantes ortopédicos^14,15 e testou-a para monitorar as variações do pH no canal intramedular através do osso e do tecido.

A Figura 3 abaixo mostra um esquema do sistema de imagem. Os componentes básicos do sistema de imagem são a fonte de excitação de raios X com óptica policapilar, um guia de luz acrílica de peça única conectando-se a dois tubos fotomultiplicadores, o estágio motorizado x, y e z (30 cm x 15 cm x 6 cm de curso) e o computador conectado para aquisição de dados. A fonte de raios X, o estágio x,y,z e a óptica de coleta (cotovelo, guia de luz, tubos fotomultiplicadores (PMTs)) estão no gabinete à prova de raios X, enquanto o controlador de raios X, a fonte de energia para PMTs, o gerador de funções conectado à placa de aquisição de dados (DAQ) e o computador são mantidos do lado de fora. Um botão, normalmente aberto, colocado entre o compartimento e a frente da porta serve como um intertravamento. Se a porta não estiver totalmente fechada (o interruptor de intertravamento estiver aberto), a fonte de raios X não ligará e desligará automaticamente a fonte de raios X se ela for aberta durante a operação. Os motores podem executar uma varredura contínua, bem como eles podem ser movidos para qualquer local discreto. A velocidade de varredura para o eixo y é geralmente de 1-5 mm/s, enquanto o tamanho do passo no eixo x pode ser escolhido tipicamente de 150-2000 μm. Os parâmetros podem ser escolhidos dependendo da resolução espacial necessária. Até mesmo os tempos de exposição são confirmados por uma velocidade consistente ao longo de uma varredura contínua.

Uma vez que o feixe de raios X focalizado é irradiado sobre as partículas de luminescência de raios X, a luz gerada passará através do filme sensível ao pH modulando a luz dependendo do pH circundante. A luz transmitida irá interagir (espalhar e absorver parcialmente) com um tecido, enquanto a atenuação da luz por espalhamento e absorção irá aumentar à medida que a espessura do tecido aumenta. A ótica da coleção inclui uma guia de luz de acrílico bifurcado de peça única equipada com um cotovelo de alumínio reflexivo (com uma curva de 90° e superfície interior refletiva polida) no início. Isso é para garantir que a luz seja colimada assim que a luz atingir a guia de luz. Essas adições melhoraram significativamente a eficiência da coleta de luz. Para maiores detalhes, a Figura 4 mostra os desenhos da máquina do cotovelo e da guia de luz. O cotovelo de 90° foi usinado em alumínio com a superfície interna polida para um acabamento espelhado e a guia de luz foi usinada com acrílico. Também anexamos um filtro de luz azul de passagem longa de ampla faixa (bloqueando a luz de 350-450 nm) no início do cotovelo para garantir que apenas a luz vermelha passe por lá. A extremidade da guia de luz acrílica de uma peça se bifurca em dois fluxos que levam a dois PMTs diferentes. Os PMTs são fechados em uma pequena caixa de metal estanque que está em contato com um resfriador termoelétrico para resfriar os PMTs a ~5 °C. No início de um dos PMTs, um filtro passa-longa de alcance estreito (bloqueando a luz de 570-640 nm e passando a luz de 640-740 nm) é anexado para medir apenas a luz de 700 nm. Portanto, a luz de 620 nm e 700 nm pode ser calculada separadamente. Os PMTs são configurados no modo de contagem de fótons e geram pulsos de lógica transistor-transistor (TTL) para cada fóton detectado. Um sistema DAQ conta os pulsos (ponto de saturação 20 milhões de pulsos por segundo) usando comunicação USB. Dois mapas de intensidade separados são gerados após o processamento dos dados, e uma imagem final é criada considerando a razão entre a intensidade do comprimento de onda do sinal (620 nm) e a intensidade do comprimento de onda de referência (700 nm). Essa relação é responsável pelas diferenças na eficiência total da coleta de luz, que dependem fortemente da posição óptica da coleta, da intensidade da irradiação de raios X e da espessura do tecido. Além disso, uma região de referência espacialmente separada sem qualquer corante indicador de pH é responsável pela distorção espectral da penetração do tecido dependente do comprimento de onda. Uma linguagem de programação baseada em gráficos é usada para controlar o sistema de imagem, e um fluxograma básico da operação é mostrado abaixo. A configuração de imagem, exceto para o computador, controlador de raios X e unidade DAQ, é fechada em um gabinete de raios X seguro para minimizar a exposição à radiação.

Protocolo

Esse procedimento segue os protocolos de uso de animais aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Clemson (IACUC). Os experimentos são realizados de acordo com o Comitê de Biossegurança da Universidade de Clemson (IBC) e o Comitê de Segurança em Radiação (RSC), bem como seguindo as diretrizes e regulamentos relevantes.

NOTA: Um diagrama de fluxo da conclusão de uma varredura XELCI é mostrado abaixo na Figura 5 , seguido por uma descrição detalhada passo a passo do procedimento de imagem.

1. Inicializar o sistema e adquirir uma radiografia simples

1. Ligue o refrigerador PMT, normalmente leva ~15 minutos para atingir o setpoint (por exemplo, 4 °C). Execute o restante das etapas de inicialização antes de ativar os PMTs.
2. Abra o software de controle do sistema de geração de imagens. O software de controle comunica e inicializa o estágio motorizado do eixo x-y-z. Mova o eixo x e o eixo y do estágio para a posição inicial desejada.
3. Coloque a amostra no estágio móvel x-y-z. Posicione a altura da amostra (eixo z), de modo que o dispositivo radioluminescente fique 5-5,5 cm abaixo da óptica de foco policapilar, elevando ou abaixando a fonte de raios X e/ou o estágio. Além disso, posicione o espécime no plano x-y com a ajuda da cabeça do laser (dois ponteiros laser em forma de linha vermelha conectados ao capilar de focalização de raios-X e posicionados a 90° um do outro de modo que as linhas se cruzem onde o raio-X irá focar). Desligue os lasers antes que os raios X e PMTs sejam ligados.
4. Fixe o intertravamento do botão na porta frontal do gabinete de imagem. Ligue a alimentação da fonte de raios. Remova a óptica de focalização para obter a radiografia simples da amostra.
5. Abra o software de controle de raios-X e defina a potência de raios-X (ajustando a tensão e a corrente). Abra o obturador de raios-X com o software de controle de raios-X.
6. Abra o software para câmera de raio-X. Pressione o botão de exposição para fazer a radiografia simples. Desligue a exposição e desligue o raio-X.
   NOTA: Se necessário, mova a amostra para melhorar a posição da amostra ou adquira uma série de raios-X em diferentes posições para que possam ser agrupados para obter uma visão radiográfica maior. Pode-se também adquirir uma radiografia em um sistema separado, mas o co-registro entre XELCI e radiografia torna-se mais difícil se o espécime se mover.
7. Abra a porta do compartimento.

2. Opcionalmente, execute uma varredura em segundo plano com o raio-X desligado

1. Conecte a óptica policapilar novamente à fonte de raios X.
2. Feche o compartimento e fixe o intertravamento. Ligue a fonte de alimentação PMT.
   NOTA: A fonte de alimentação PMT deve ser sempre desligada sempre que a porta estiver aberta ou prestes a ser aberta para evitar a exposição excessiva à luz.
3. Abra o software de controle do sistema de geração de imagens e especifique o tamanho da etapa, a velocidade da varredura e a área de varredura. Depois que todos os parâmetros estiverem definidos, inicie a varredura pressionando o botão Executar .
   NOTA: Para uma varredura de alta resolução, o tamanho do passo será de 1000 μm e para uma varredura de baixa resolução, o tamanho do passo será de 250 μm. A velocidade de varredura pode ser escolhida de 5 mm/s até 1 mm/s. A área da varredura depende das dimensões da amostra.
4. Execute uma varredura em segundo plano com o raio-X desligado para determinar as contagens escuras de qualquer luz presente no compartimento que não seja a amostra.

3. Execute uma varredura de amostra com o raio-X ligado

1. Certifique-se de que a amostra ainda está na posição correta com a cabeça transversal do laser para iniciar a varredura.
2. Feche o compartimento e fixe o intertravamento. Se os PMTs estiverem desligados (por exemplo, desligados antes de abrir a porta), ligue a fonte de alimentação PMT.
3. Abra o software de controle do sistema de geração de imagens. Insira os valores para tamanho da etapa, velocidade de varredura e área de varredura. Depois que todos os parâmetros estiverem definidos, pressione o botão Executar para iniciar a verificação.
   NOTA: Para uma varredura de alta resolução, o tamanho do passo será de 1000 μm e para uma varredura de baixa resolução, o tamanho do passo será de 250 μm. A velocidade de varredura pode ser escolhida de 5 mm/s até 1 mm/s. A área da varredura depende das dimensões da amostra.
4. Obtenha a varredura para a amostra com o raio-X ligado.
5. Primeiro, execute a varredura de baixa resolução com tamanhos de passo maiores e maior velocidade de varredura para obter uma imagem preliminar do alvo. Depois de obter uma varredura de baixa resolução da área desejada da amostra, obtenha a varredura de maior resolução com um tamanho de passo menor e menor velocidade de varredura.
6. Desligue a fonte de alimentação PMT antes de abrir a porta.

4. Formando a imagem

1. Validar a varredura atual é criar imagens da área de interesse do alvo. Caso contrário, pare a verificação atual pressionando o botão Parar .
2. Ajuste as posições de digitalização no software de controle novamente e pressione o botão Executar novamente.
   Observação : o eixo y é gravado continuamente a partir da primeira linha da varredura. Ao executar uma varredura, o número de contagens por cada comprimento de onda e o tempo desde a última posição atualizada do motor são registrados. O tempo registrado será responsável por quaisquer mudanças na velocidade do motor, portanto, o tempo de exposição. Para cada pixel, as contagens/segundo são normalizadas. O motor do eixo y viaja para escanear o final da linha atual do eixo y e o motor volta à posição inicial. Em seguida, o motor do eixo x aumenta sua posição por um tamanho de passo definido pelo usuário e verifica a segunda linha do eixo y. Esse processo é ciclado até que o motor do eixo x atinja a largura especificada para a direção x. O usuário pode controlar o tamanho da varredura, a velocidade do motor e as posições de partida do motor. O tamanho da etapa determinará o tamanho dos pixels na imagem final do eixo y.

5. Cultivo de bactérias para aquisição de imagens em condições estéreis (Se sensores cultivados por bactérias forem fotografados)

1. Para preparar uma cultura fresca de Staphylococcus aureus 1945 (ATCC 25923), use uma colônia de uma placa de TSA (Tryptic soy agar) raiada dentro de 1 semana para inocular 5 mL de Caldo de Soja Tríptico (TSB) estéril.
2. Agitar suavemente a cultura bacteriana a 37 °C durante 16-18 h até à fase estacionária.
3. Em seguida, pellet a cultura do TSB via centrifugação a 4000 x g por 10 min à temperatura ambiente (TR) e lavar o pellet duas vezes com Phosphate Buffer Solution (PBS) e ressuspender o pellet em 5 mL de PBS estéril.
4. Quantificar a concentração bacteriana usando densidade óptica a 600 nm usando a faixa linear, que é a faixa OD onde a lei de Beer-Lambert é verificada (OD = kN; k é um coeficiente relativo à extinção molecular e ao comprimento do caminho óptico, N é a concentração bacteriana)¹⁶. Em seguida, diluir a amostra para 10⁵ células/mL usando PBS estéril.
5. Esterilizar o Agar Tríptico de Soja (TSA) por autoclavação e depois arrefecer misturando até atingir a temperatura de 45 °C. Inocular as bactérias na TSA.
6. Pipetar a cultura bacteriana diluída (100 μL) na superfície do sensor implantável.
   OBS: Os implantes foram esterilizados por imersão em etanol 70% por 5 min e armazenados em PBS estéril.
7. Pipetar 100 μL de TSA não inoculado sobre outro implante estéril como controle
8. Adicionar mais 100 μL de TSA não inoculado sobre o sensor implantável antes de este ser incubado a 37 °C durante 48 h antes da implantação.

Resultados

Como estudo preliminar, obtivemos imagens do sensor de bastonete intramedular em tíbia fresada de cadáver de^coelho14. O sensor possui três regiões distintas: a região de referência, a região pH 8 (pH básico) e a região pH 4 (pH ácido). A região de referência é a partícula cintiladora (Gd 2 O₂S:Eu) incorporada no filme epóxi rugoso. As distintas regiões de pH ácido e básico representam situações infectadas e não infectadas no interior do canal intramedular...

Discussão

Para poder detectar e estudar precocemente infecções associadas a implantes ortopédicos para evitar complicações de osteomielite e procedimentos cirúrgicos secundários, introduzimos o XELCI como uma nova técnica de imagem funcional. É comparável com as técnicas atualmente disponíveis para o monitoramento do pH através do tecido.

Ao posicionar a amostra para obtenção de imagens, usamos uma cabeça transversal de laser conectada à óptica de focalização policapilar com dois pon...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 degree elbow	Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA
Bromo Cresol Green	Sigma-Aldrich	45ZW10
Bromo Thymol Blue	Sigma	76-59-5
ElectraCOOL Advanced thermoelectric cool plate	Pollock industries, White River, VT, USA	TCP 50
Ethanol	Beantown Chemical, 9 Sagamore Park Road Hudson, NH 03051	64-17-5
Gadolinium Oxysulfide Europium doped (Gd2O2S:Eu) particles-~8.0 µm	Phosphor Technologies Inc., Stevenage, England	UKL63/N-R1
LabVIEW	National Instruments, Austin, TX
Motorized Linear Vertical Stage Model (for Z axis)	Motion Control, Smithtown, NY, USA	AT10-60
National instruments c-DAQ 9171	National Instruments, Austin, TX	NI cDAQ™-9171
One piece acrylic light guide	Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA
pH 4 buffer	VWR BDH Chemicals	BDH5024
pH 8 buffer	VWR BDH Chemicals	BDH5060
Phosphate Buffer Solution	MP Biomedicals, Irvine, CA. USA	2810305
Photo multiplier tubes Model P25PC-16	SensTech, Surrey, UK	Model P25PC-16
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	ATCC 25923
Tryptic Soy Agar	Teknova, Hollister, CA, USA	T0520
Tryptic Soy Broth	EMD Millipore, Burlington, MA, USA	1005255000
X-ray source-iMOXS	Institute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Germany
X,Y motorized stage-30 cm x 15 cm x 6 cm travel	Thorlabs Inc., Newton, NJ, USA	LTS300 and LTS150