通过组织的X射线激发发光化学成像对植入物相关感染进行高空间分辨率化学成像

摘要

在这里，我们提出了一种通过X射线激发发光化学成像（XELCI）对植入式医疗设备周围的化学信息进行高分辨率光学检测的协议。这种新颖的成像技术是在我们的实验室开发的，可以研究植入物相关的感染生物化学。

摘要

与植入式医疗器械相关的微生物感染是骨折固定失败的主要问题。这种感染的早期诊断将允许用抗生素成功根除，而无需支付第二次手术的额外费用。在本文中，我们将XELCI描述为一种具有高X射线分辨率，植入物特异性和对植入式医疗设备表面附近的非侵入性成像化学浓度的化学敏感性的技术。这些设备涂有化学报告表面。这种化学反应表面由涂在植入式医疗设备上的两层组成;pH敏感层（溴酚蓝或溴甲酚绿掺入水凝胶），涂覆在红光闪烁体（Gd 2 O₂S:Eu）层上进行监测。聚焦的X射线束照射植入物上的一个斑点，闪烁体产生的红光（具有620 nm和700 nm的峰值）通过传感层传输，传感层根据pH值改变光谱比。通过扫描穿过植入物的X射线束并逐点测量通过组织的光的光谱比来生成图像。我们使用这种成像技术通过改进的植入板传感器监测先前在股骨骨表面上的植入物相关感染。现在我们正在研究胫骨髓内杆感染引起的pH值变化。在试点前兔子研究中使用了两种不同类型的髓内杆设计，我们了解到XELCI技术可用于监测不仅在骨骼表面而且在骨骼内部发生的任何化学变化。因此，这使得无创、高空间分辨率、低背景局部pH成像能够研究植入物相关的感染生物化学。

引言

在美国，每年约有200万个骨折固定装置入，其中5%-10%导致种植体相关感染¹。由于^生物膜的异质性和抗生素耐药性，这些感染在后期阶段更难用抗生素治疗2^，3。如果早期诊断，可以用抗生素和手术清创治疗感染，以防止第二次手术的额外医疗费用，以更换治疗骨折部位的硬件。X线平片和其他先进的放射线照相技术应用于骨科植入物相关感染、不愈合和相关并发症的诊断。尽管这些技术经常用于获取骨科植入物周围骨骼和组织的结构信息，但它们无法在特定环境中提供生化信息。因此，我们开发了一种新颖的X射线激发发光化学成像（XELCI）技术，用于在植入部位无创地对生化信息进行高分辨率成像。骨科植入物相关感染的诊断通常通过一种或多种不同的方法进行。临床观察（疼痛、肿胀、发红、伤口分泌物等）提示感染的最初迹象。之后，进行放射学和实验室实验以确认骨愈合进展的失败并确定病原微生物^4，5。核医学技术，如计算机断层扫描（CT），磁共振成像（MRI）和放射性核苷酸方法，如单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和正电子发射断层扫描（PET）用于更好地可视化感染植入物^{和相关感染6，7}。CT和MRI分别有利于确定骨坏死和软组织异常，但在金属植入物的近距离处会引起干扰⁸。不同的X射线方法（如SPECT和PET）与放射性同位素标记的分析物（如体内成像造影剂）相结合，广泛用于诊断植入物相关性骨髓炎²。当前的应用将来自CT扫描的数据和来自SPECT或PET的标记数据结合起来，以生成解剖学信息⁹。尽管这些成像方式中的一种或多种用于帮助感染诊断，但它们无法及早检测到与感染相关的pH变化，从而开始使用抗生素治疗以避免额外的医疗和手术费用。

利用本研究中使用的成像系统监测植入物相关感染的主要优点是它能够通过光谱参考揭示有关生物膜微环境的生化信息。虽然主要重点是成像和绘制感染部位的pH值，但可以改变这种方法以监测植入物相关感染的其他特异性生物标志物。因此，XELCI可以了解感染的病理生理学。高空间分辨率成像允许随着感染的增长绘制异质性。发生生物膜形成的表面的pH值对于理解生化变化非常重要。此外，由于细菌^10，11的抗生素相关应激反应，可能会发生其他微环境变化。由于表面特异性和高空间分辨率成像，可以监测抗生素对生物膜微环境的影响。该技术还可用于研究靶向药物递送实验的生物膜环境。我们可以研究有针对性的低pH药物释放或提高pH值，使它们更容易在较高的pH下起作用。

这种成像技术的三个具体特征是X射线分辨率，植入物表面特异性和化学灵敏度（图1A）。这些特征可以与目前可用的用于成像骨科植入物相关感染的成像技术进行比较（图1B）。一旦用X射线照射，涂覆在植入物表面的荧光粉颗粒就会产生红色和近红外（NIR）光，可以穿透几厘米的组织（尽管有一些衰减）^12，13。 表1 显示了所开发的成像系统与用于测量生物膜中或通过组织pH的其他方法相比的一些特征。

XELCI是一种新颖的成像技术，结合X射线激发，在植入式医疗设备附近光学获取高空间分辨率化学信息，如图 2所示。这里利用了X射线可激发荧光粉颗粒的选择性激发和光学检测。植入物涂有两层，在一层闪烁体颗粒上掺入pH敏感染料的聚合物层。一旦一系列聚焦的X射线束照射植入物，闪烁体层就会产生可见光（620 nm和700 nm）。产生的光通过pH敏感层，根据周围环境的pH调节发光光谱。低pH值通常与感染和生物膜形成有关;随着感染的进展，pH值从生理pH值（pH 7.2）变为酸性（低于pH 7），传感器中的pH染料会改变颜色，从而改变吸光度。 图2E显示了溴 甲酚绿色pH染料在pH 7和pH 4下的发光光谱的变化。收集通过组织和骨骼的透射光，光谱比决定pH值。为了生成pH图像，聚焦的X射线束一次照射闪烁体薄膜中的一个点，并逐点扫描样品上的光束。以前，该技术应用于骨科植入物^14，15 表面的pH变化成像，并对其进行了测试以监测髓内管通过骨骼和组织的pH变化。

下面的图3显示了成像系统的示意图。成像系统的基本组件是带有聚毛细管光学元件的X射线激发源，连接到两个光电倍增管的一体式丙烯酸光导，x，y和z电动载物台（30 cm x 15 cm x 6 cm行程）和连接用于数据采集的计算机。X 射线源、x、y、z 载物台和收集光学元件（弯头、光导、光电倍增管 （PMT））位于 X 射线防护外壳中，而 X 射线控制器、PMT 电源、连接到数据采集 （DAQ） 板的函数发生器和计算机则保存在外部。位于外壳和门前部之间的按钮常开开关用作联锁。如果门没有完全关闭（联锁开关打开），X射线源不会打开，如果在操作过程中打开X射线源，它会自动关闭X射线源。电机可以执行连续扫描，也可以移动到任何离散位置。y轴的扫描速度通常为1-5 mm/s，而x轴上的步长通常可在150-2000μm之间选择。可以根据所需的空间分辨率选择参数。均匀的曝光时间通过整个连续扫描的一致速度来确认。

一旦聚焦的X射线束照射在X射线发光粒子上，产生的光将通过根据周围的pH调节光来穿过pH敏感膜。透射光将与组织相互作用（部分散射和吸收），而散射和吸收的光衰减将随着组织厚度的增加而增加。该系列光学元件包括一个一体式分叉丙烯酸光导，起点配有反光铝弯头（具有 90° 弯曲和抛光反光内表面）。这是为了确保光线到达光导后立即准直。这些添加显著提高了光收集效率。有关更多详细信息， 图4 显示了弯头和光导的机器图纸。90°弯头由铝加工而成，内表面抛光至镜面，光导用亚克力加工。我们还在弯头的起点安装了宽范围的长通蓝光滤光片（阻挡350-450nm的光），以确保只有红光会通过。一体式丙烯酸光导的末端分叉成两个流，导致两个不同的PMT。PMT被封装在一个与热电冷却器接触的小型光密金属盒中，以将PMT冷却到~5°C。 在其中一个PMT开始时，连接了一个窄范围长通滤光片（阻挡570-640 nm光并通过640-740 nm光）以仅测量700 nm光。因此，620 nm和700 nm光可以分别计算。PMT设置为光子计数模式，它们为每个检测到的光子生成晶体管-晶体管逻辑（TTL）脉冲。DAQ 系统 使用 USB 通信 计算 脉冲 （饱和 点 每秒 2000 万 脉冲） 计数。处理数据后生成两个单独的强度图，并通过考虑信号波长强度（620 nm）与参考波长强度（700 nm）的比值来创建最终图像。该比率解释了总光收集效率的差异，这在很大程度上取决于收集光学器件的位置、X 射线照射强度和组织厚度。此外，没有任何pH指示剂染料的空间分离参比区域解释了波长依赖性组织穿透引起的光谱失真。基于图形的编程语言用于控制成像系统，操作的基本流程图如下所示。除计算机、X 射线控制器和 DAQ 单元外，成像设置都封闭在安全的 X 射线外壳中，以最大限度地减少辐射暴露。

研究方案

该程序遵循克莱姆森大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的动物使用协议。实验是根据克莱姆森大学生物安全委员会（IBC）和辐射安全委员会（RSC）进行的，并遵循相关的指导方针和规定。

注:完成XELCI扫描的流程图如图 5 所示，随后是成像过程的详细分步说明。

1. 初始化系统并获取X线平片

1. 打开PMT冷却器，通常需要~15分钟才能达到设定值（例如，4°C）。在打开 PMT 之前执行其余初始化步骤。
2. 打开成像系统控制软件。控制软件程序通信并初始化x-y-z轴电动载物台。将载物台 x 轴和 y 轴移动到所需的起始位置。
3. 将样品放在可移动的x-y-z载物台上。通过升高或降低X射线源和/或载物台，定位样品高度（z轴），使放射性发光装置位于多毛细管聚焦光学元件下方5-5.5厘米处。此外，在激光十字头的帮助下将试样定位在 x-y 平面上（两个红线形激光指示器连接到 X 射线聚焦毛细管并彼此成 90° 放置，以便线与 X 射线聚焦的地方相交）。在打开 X 射线和 PMT 之前关闭激光器。
4. 固定成像机箱前门上的按钮联锁。打开光线源的电源。取出聚焦光学元件以获得样品的X光片。
5. 打开X射线控制软件并设置X射线功率（通过调节电压和电流）。使用 X 射线控制软件打开 X 射线快门。
6. 打开X射线相机的软件。点击曝光按钮拍摄X线平片。关闭曝光并关闭X射线。
   注意:如果需要，移动样品以改善样品位置或在不同位置获取一系列X射线，以便可以整理它们以获得更大的X光片视图。人们也可以在单独的系统上获得X光片，但如果标本移动，XELCI和X线照相之间的共同配准变得更加困难。
7. 打开存储模块门。

2. （可选）在关闭 X 射线的情况下执行后台扫描

1. 将多毛细管光学元件再次连接到X射线源。
2. 关闭存储模块并固定联锁装置。打开 PMT 电源。
   注意: 每当门打开或即将打开时，应始终关闭 PMT 电源，以避免过度暴露在光线下。
3. 打开成像系统控制软件并指定步长、扫描速度和扫描区域。设置完所有参数后，点击开始扫描 运行 按钮。
   注意:对于高分辨率扫描，步长将为1000 μm，对于低分辨率扫描，步长将为250 μm。扫描速度可以从 5 mm/s 到 1 mm/s 进行选择。扫描区域取决于样品的尺寸。
4. 在关闭X射线的情况下运行背景扫描，以确定外壳中除样品外存在的任何光线的暗计数。

3. 在开启 X 射线的情况下进行样品扫描

1. 使用激光十字头确保样品仍处于正确位置以开始扫描。
2. 关闭存储模块并固定联锁装置。如果 PMT 已关闭（例如，在打开门之前关闭），请打开 PMT 电源。
3. 打开成像系统控制软件。输入步长、扫描速度和扫描区域的值。设置完所有参数后，点击 运行 按钮开始扫描。
   注意:对于高分辨率扫描，步长将为1000 μm，对于低分辨率扫描，步长将为250 μm。扫描速度可以从 5 mm/s 到 1 mm/s 进行选择。扫描区域取决于样品的尺寸。
4. 在打开X射线的情况下获取样品的扫描。
5. 首先，以较大的步长和较高的扫描速度执行低分辨率扫描，以获得目标的初步图像。在获得样品所需区域的低分辨率扫描后，以较小的步长和较低的扫描速度获得更高分辨率的扫描。
6. 在打开门之前关闭 PMT 电源。

4. 形成形象

1. 验证当前扫描是否对目标的感兴趣区域进行成像。如果没有，请通过点击停止当前扫描 Stop 停止 按钮。
2. 再次调整控制软件中的扫描位置，然后再次点击 运行 按钮。
   注:从扫描的第一行开始连续记录y轴。执行扫描时，记录自上次更新电机位置以来每个波长和时间的计数数。记录的时间将考虑电机速度的任何变化，从而说明曝光时间。对于每个像素，计数/秒被归一化。y轴电机行进扫描y轴当前行的末端，电机回到起始位置。然后，x轴电机按用户定义的步长增加其位置，并扫描y轴的第二行。此过程循环进行，直到 x 轴电机达到 x 方向的指定宽度。用户可以控制扫描尺寸、电机速度和电机起始位置。步长将决定 y 轴最终图像中像素的大小。

5. 培养细菌在无菌条件下成像（如果对细菌生长的传感器进行成像）

1. 要制备金 黄色葡萄球菌 1945 （ATCC 25923） 的新鲜培养物，请使用 1 周内划线的 TSA（胰蛋白酶大豆琼脂）平板中的一个菌落接种 5 mL 无菌胰蛋白酶大豆肉汤 （TSB）。
2. 在37°C下轻轻摇动细菌培养物16-18小时，直到固定相。
3. 接下来，通过在室温（RT）下以4000× g 离心10分钟从TSB沉淀培养物，并用磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤沉淀两次，并将沉淀重悬于5mL无菌PBS中。
4. 使用线性范围使用600nm处的光密度量化细菌浓度，这是验证比尔-朗伯定律的OD范围（OD = kN; k 是相对于分子消光和光路长度的系数， N 是细菌浓度）¹⁶。然后使用无菌PBS将样品稀释至10⁵ 个细胞/ mL。
5. 通过高压灭菌对胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）进行灭菌，然后通过混合冷却直至温度达到45°C。 将细菌接种到TSA中。
6. 将稀释的细菌培养物（100μL）移液到植入式传感器的表面上。
   注意:植入物通过浸入70%乙醇中5分钟并储存在无菌PBS中进行灭菌。
7. 将 100 μL 未接种的 TSA 移液到另一个无菌植入物上作为对照
8. 在植入式传感器上再加入100μL未接种的TSA，然后在植入前在37°C孵育48小时。

结果

作为初步研究，我们在兔子尸体¹⁴的扩孔胫骨中对髓内杆传感器进行了成像。传感器有三个不同的区域:参考区域、pH 8 区域（碱性 pH）和 pH 4 区域（酸性 pH）。参考区域是掺入粗糙环氧树脂薄膜中的闪烁体（Gd2 O₂S:Eu）颗粒。独特的酸性和碱性pH区域代表髓内管内的感染和非感染情况（图6A，B）¹⁴。

讨论

为了能够及早发现和研究骨科植入物相关感染，以避免骨髓炎和二次外科手术的并发症，我们引入了XELCI作为一种新颖的功能成像技术。它与目前可用的通过组织监测pH的技术相当。

在定位样品进行成像时，我们使用连接到多毛细管聚焦光学元件的激光十字头，两个相交的线形激光指示器呈 90° 角，以将弯头精确地对准其下方。在开始扫描之前，应关闭这些激光器，以消除除?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 degree elbow	Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA
Bromo Cresol Green	Sigma-Aldrich	45ZW10
Bromo Thymol Blue	Sigma	76-59-5
ElectraCOOL Advanced thermoelectric cool plate	Pollock industries, White River, VT, USA	TCP 50
Ethanol	Beantown Chemical, 9 Sagamore Park Road Hudson, NH 03051	64-17-5
Gadolinium Oxysulfide Europium doped (Gd2O2S:Eu) particles-~8.0 µm	Phosphor Technologies Inc., Stevenage, England	UKL63/N-R1
LabVIEW	National Instruments, Austin, TX
Motorized Linear Vertical Stage Model (for Z axis)	Motion Control, Smithtown, NY, USA	AT10-60
National instruments c-DAQ 9171	National Instruments, Austin, TX	NI cDAQ™-9171
One piece acrylic light guide	Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA
pH 4 buffer	VWR BDH Chemicals	BDH5024
pH 8 buffer	VWR BDH Chemicals	BDH5060
Phosphate Buffer Solution	MP Biomedicals, Irvine, CA. USA	2810305
Photo multiplier tubes Model P25PC-16	SensTech, Surrey, UK	Model P25PC-16
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	ATCC 25923
Tryptic Soy Agar	Teknova, Hollister, CA, USA	T0520
Tryptic Soy Broth	EMD Millipore, Burlington, MA, USA	1005255000
X-ray source-iMOXS	Institute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Germany
X,Y motorized stage-30 cm x 15 cm x 6 cm travel	Thorlabs Inc., Newton, NJ, USA	LTS300 and LTS150