الظروف التجريبية المعدلة لفقدان السمع الناجم عن الضوضاء في الفئران وتقييم وظيفة السمع وتلف خلايا الشعر الخارجية

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لنموذج الماوس لفقدان السمع الناجم عن الضوضاء (NIHL). للحث على NIHL ، قمنا بتطوير جهاز جديد وبسيط باستخدام البلاستيك المموج ، وقفص مصيدة الفئران ، ومكبر صوت. تم استخدام استجابة جذع الدماغ السمعية والتصوير المناعي لتقييم وظيفة السمع وتلف خلايا الشعر الخارجية ، على التوالي.

Abstract

يعد النموذج الحيواني لفقدان السمع الناجم عن الضوضاء (NIHL) مفيدا لأخصائيي علم الأمراض والمعالجين وعلماء الصيدلة والباحثين في السمع لفهم آلية NIHL تماما ، وبالتالي تحسين استراتيجيات العلاج المقابلة. تهدف هذه الدراسة إلى إنشاء بروتوكول محسن لتطوير نموذج فأر من NIHL. تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6J في هذه الدراسة. تعرضت الفئران غير المخدرة لضوضاء عالية (1 و 6 كيلو هرتز ، معروضة في وقت واحد عند 115-125 ديسيبل SPL-A) بشكل مستمر لمدة 6 ساعات يوميا لمدة 5 أيام متتالية. تم تقييم الوظيفة السمعية بعد يوم واحد وأسبوع واحد من التعرض للضوضاء ، باستخدام استجابة جذع الدماغ السمعي (ABR). بعد قياس ABR ، تم التضحية بالفئران ، وتم جمع أعضاء كورتي الخاصة بهم من أجل تلطيخ التألق المناعي. من قياسات استجابة جذع الدماغ السمعية (ABR) ، لوحظ فقدان السمع بشكل كبير بعد 1 يوم من التعرض للضوضاء. بعد 1 أسبوع ، انخفضت عتبات السمع للفئران التجريبية إلى ~ 80 ديسيبل SPL ، والتي كانت لا تزال مستوى أعلى بكثير من الفئران الضابطة (~ 40 ديسيبل SPL). من نتائج التصوير المناعي ، تبين أن خلايا الشعر الخارجية (OHCs) تالفة. باختصار ، أنشأنا نموذجا ل NIHL باستخدام ذكور الفئران C57BL / 6J. تم تطوير جهاز جديد وبسيط لتوليد وتوصيل ضوضاء نقية ثم تم استخدامه. أظهرت القياسات الكمية لعتبات السمع والتأكيد المورفولوجي لأضرار OHC أن الضوضاء المطبقة نجحت في إحداث فقدان السمع المتوقع.

Introduction

يعاني حوالي 1.3 مليار شخص في جميع أنحاء العالم من فقدان السمع بسبب التعرض للضوضاء¹. في هذه الدراسة ، كنا نهدف إلى إنشاء عملية واضحة خطوة بخطوة لتحفيز وتأكيد فقدان السمع الناجم عن الضوضاء (NIHL). ينتج NIHL عن تنكس / تدمير خلايا الشعر (HCs) والخلايا العصبية العقدية الحلزونية (SGNs) ، وتلف في الأهداب المجسمة HC ، و / أو فقدان نقاط الاشتباك العصبي بين HCs الداخلية للقوقعة و SGNs. قد تسبب هذه التشوهات أيضا طنين الأذن وضعف إدراك الكلام (خاصة في بيئة صوتية معقدة) إلى جانب NIHL. قد تتأثر الوظائف الاجتماعية والنفسية والمعرفية بالتتابع بهذه العيوب الفسيولوجية²،^3،4،^5،6.

في الدراسات قبل السريرية المتعلقة ب NIHL القائمة على الفئران ، فإن سلالات الفئران الأكثر شيوعا هي CBA / CaJ²،³،6،⁷ و C57BL / ^{6 4}،^5،8. علاوة على ذلك ، يتم استخدام ذكور الفئران 3،^4،7 بشكل أكثر شيوعا من^{الفئران} الأنثوية ^، لأن الإستروجين له تأثير وقائي على السمع. لذلك ، استخدمنا الفئران الذكور فقط في هذه الدراسة⁹. بعد الرجوع إلى الأدبيات ، اخترنا 1 كيلو هرتز و 6 كيلو هرتز كترددات للضوضاء المطبقة. كانت شدة الضوضاء المطبقة 115 ديسيبل SPL-A (المحيطة بالقفص) إلى 125 ديسيبل SPL-A (في وسط القفص). بعد تعريض فئران التجارب للضوضاء بشكل مستمر لمدة 6 ساعات في اليوم ، لمدة 5 أيام متتالية ، أشارت الزيادة المثلى في عتبة السمع إلى المدى الأمثل ل NIHL في فئران التجارب. يتم وصف عمليات التعامل مع الحيوانات ، وبناء الإعداد التجريبي ، وإحداث الضوضاء بوضوح خطوة بخطوة في البروتوكول المقدم.

Protocol

تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية الحيوان في كلية ماكاي الطبية. تم شراء ذكور الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر ثمانية أسابيع من المركز الوطني لحيوانات المختبر (مدينة تايبيه الجديدة ، تايوان). تم تربية جميع الفئران وإيوائها وفقا لبروتوكول الحيوان القياسي.

1. تحريض NIHL في الفئران

1. تحضير القفص للفئران التجريبية
   1. للقيام بذلك ، استخدم قفص مصيدة الفئران بأبعاد 14 سم × 17 سم × 24 سم. قطع أربع قطع من الألواح البلاستيكية المموجة إلى أحجام مناسبة ، مما يجعلها تتناسب مع القفص (13 سم × 23 سم و 13 سم × 16 سم).
   2. لمنع الفئران من قطع أقدامها بواسطة الشبكة الشبكية ، ضع قطعتين في الأسفل وعلى الجانب الخلفي ، على التوالي. ضع القطعتين الأخريين متشابكتين بشكل عمودي مع بعضهما البعض ، لتقسيم المساحة داخل القفص إلى أرباع.
2. قم بإجراء هذه الدراسة في صندوق عازل للصوت. ضع مكبر صوت 8.5 سم أمام القفص ، وضع كل من السماعة والقفص في صندوق عازل للصوت.
3. افتح برنامج تطبيق CLIO
4. حرك المؤشر إلى أيقونة مكبر الصوت ، ثم انقر فوق TwoSin. أدخل قيمة Freq 1 إلى 1000 هرتز وقم بتغييرها ، و Freq 2 إلى 6000 هرتز ، وانقر فوق "موافق" لبدء تشغيل الصوت.
5. ضمن علامة التبويب Leq ، قم بتغيير dBV إلى dBSPL. بعد ضبط الوقت على واجهة البرنامج ، انقر فوق زر المثلث الأخضر لتشغيل الصوت.
6. ضع ميكروفونا أمام السماعة على مسافة 8.5 سم لمعايرة مستوى الضوضاء (انظر الملف التكميلي 1). اضبط مستوى الضوضاء على 125 ديسيبل SPL-A وراقب باستمرار لمدة لا تقل عن 3 دقائق للتأكد من أن مستوى الضوضاء مستقر بدرجة كافية. استخدم مولدا ومحللا ومضخما لإنشاء الضوضاء والتحكم فيها. (الشكل 1)
   ملاحظة: قم بهذه الخطوة في صندوق عازل للصوت لتجنب تلف سمع المشغل.
7. ضع أربعة ذكور من الفئران C57BL / 6J في القفص (واحد لكل ربع سنة) للتعرض للضوضاء. قم بتعيين الفئران بشكل عشوائي في كل ربع سنة أثناء التعرض للضوضاء. ضع ميكروفونا في الجزء العلوي من القفص لمراقبة مستوى الضوضاء أثناء التعرض للضوضاء (الشكل 2).
   ملاحظة: قم بهذه الخطوة في صندوق عازل للصوت لتجنب تلف سمع المشغل.
8. تعريض الفئران للضوضاء بترددات 1 كيلو هرتز و 6 كيلو هرتز بشكل مستمر لمدة 6 ساعات في اليوم ، لمدة 5 أيام متتالية.
9. قم بقياس عتبات السمع للفئران بعد يوم واحد من التعرض للضوضاء (أي في اليوم 6) عن طريق قياس ABR. كرر قياسات ABR هذه مرة أخرى بعد أسبوع واحد من التعرض للضوضاء (أي^{في اليوم 13}). بعد قياسات ABR ، ضح بجميع الفئران المعنية وحصد قوقعتها (الشكل 3).

2. التقييم القائم على استجابة جذع الدماغ السمعي (ABR) لعتبة السمع

1. استخدم نظام اختبار ABR التجاري المصمم خصيصا للحيوانات الصغيرة¹⁰.
2. حقن خليط من التيلتامين وزولازيبام (40 ملغ/كغ) وزيلازين (9.3 ملغ/كغ) داخل الصفاق في الفئران للتخدير العام.
   ملاحظة: يستغرق تقييم ABR ~ 2 ساعة. تأكد من توفير الدعم الحراري عبر وسادة التدفئة وتطبيق مرهم العين لمنع الجفاف أثناء تخدير الفأر.
3. قياس ABR في الماوس تحت التخدير العام. ضع أقطاب إبرة تحت الجلد (12 مم) عند الرأس ، خلف صيوان الأذن اليسرى ، والظهر بالقرب من الذيل لقياس عتبة السمع.
4. تقديم المنبهات الصوتية باستخدام مكبر صوت يوضع على بعد 1 سم من الأذن اليسرى للحيوان.
5. استخدم راسم الذبذبات للتحكم في المحفزات الصوتية. اختر موجة جيبية للمنبهات و 10 k لمقياس النافذة. أدر مقبض التردد للحصول على التردد المطلوب للمحفزات الصوتية.
6. اضبط شدة التحفيز عن طريق تدوير مقبض AMLP على مولد الوظائف. احصل على شدة التحفيز المطلوبة عن طريق تحويل مقبض AMLP إلى جهد مناسب ، محسوب من المعايرة.
7. اجمع قياسات ABR تحت سلسلة من شدة التحفيز ، من 10 ديسيبل SPL إلى 100 ديسيبل SPL ، بحجم خطوة 10 ديسيبل.
   ملاحظة: قم بقياس عتبة السمع في صندوق عازل للصوت. افترض أن الحد الأدنى لمستوى شدة التحفيز الذي يمكن أن يؤدي إلى ظهور موجة V ملحوظة في الإشارة المجمعة هو عتبة ABR^10,11 (الشكل 4). بعد تقييم ABR ، راقب الحيوان حتى يتعافى من التخدير (~ 1 ساعة).

3. الفحص المجهري

1. إصلاح الأنسجة المحصودة
   1. بعد قياسات ABR ، التضحية بالفأر عن طريق حقن خليط من التيلتامين وزولازيبام (100 مجم / كجم) والزيلازين (23.25 مجم / كجم) للفحص المجهري.
   2. احصد القوقعة من الفأر واغمرها على الفور في 10٪ فورمالديهايد (FA) للتثبيت (قوقعتان / مل) لمدة 8 ساعات على الأقل عند 4 درجات مئوية.
   3. بعد التثبيت ، استبدل محلول FA بمحلول حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك 10٪ (EDTA) لإزالة الكلس لمدة 3-4 أيام عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك، تحقق من كل قوقعة بملاقط للتأكد من أن القوقعة قد طرت بدرجة كافية.
   4. ضع القوقعة في طبق بتري مملوء بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، وقطع العضو الحلزوني الشكل لكورتي (OC) (كل قوقعة منزوعة الكلس) إلى ثلاثة أقسام - المنعطف القاعدي ، والدوران الأوسط ، والدوران القمي - تلطيخ الأنسجة.
   5. تحت مجهر تشريح (التكبير: 8x-35x) ، قم بإزالة الهياكل العظمية (سكالا الدهليزي ، سكالا تيمباني ، وموديولوس) من القوقعة منزوعة الكلس واحصل على الأنسجة الرخوة ، بما في ذلك OC (سمك: حوالي 40 ميكرومتر).
2. تلطيخ القوقعة المناعية
   1. تحضير المخزن المؤقت للحظر: قم بإعداد 2٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) و 0.2٪ من محاليل Triton X-100 في PBS.
   2. انقل الأنسجة المراد تلطيخها من طبق بتري إلى أنبوب طرد مركزي دقيق ، واغمر الأنسجة في 0.1 مل من المخزن المؤقت للحجب لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة (RT).
   3. تحضير المخزن المؤقت للأجسام المضادة الأولية Myo7A: قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي Myo7A في المخزن المؤقت للحجب بنسبة حجم 1: 200.
   4. عالج الأنسجة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق باستخدام 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للأجسام المضادة الأولية Myo7A لمدة 2 ساعة في RT.
   5. شطف الأنسجة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
   6. تحضير الجسم المضاد الثانوي Myo7A (Myo7A-Rb-488) والجسم المضاد للفيلويدين (phalloidin-594): تمييع الجسم المضاد الثانوي Myo7A (1: 400) والجسم المضاد phalloidin (1: 200) في المخزن المؤقت للحظر.
   7. عالج الأنسجة ب 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي Myo7A ومخزن الأجسام المضادة phalloidin لمدة 2 ساعة في RT.
   8. بعد علاج الأجسام المضادة + phalloidin ، شطف الأنسجة في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات ، لمدة 5 دقائق لكل منهما.
   9. انقل الأنسجة المغسولة من أنبوب الطرد المركزي الدقيق إلى طبق بتري مملوء ب PBS باستخدام ماصة نقل بلاستيكية سعة 1 مل مع طرف مقطوع.
   10. للتحضير للفحص المجهري ، قم بفتح الأنسجة ، وضعها على شريحة زجاجية ، وأضف 15 ميكرولتر من وسط فلوروماونت 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) على الأنسجة لتغطيتها بالكامل. ضع غطاء زجاجي برفق على المنديل. اتركي الشريحة طوال الليل في RT قبل إغلاقها بطلاء الأظافر.
3. الحصول على الصور
   1. الحصول على صور 2D باستخدام المجهر مضان تستقيم وبرنامج الحصول على الصور.
   2. قبل إجراء الفحص المجهري ، قم بتوسيط الأنسجة في مجال الرؤية واضبط الحساسية على ISO 100. اضبط وقت التعرض في البداية بالنقر فوق الزر "الوضع التلقائي " الخاص بالبرنامج ، ثم قم بالضبط يدويا بالنقر فوق الزر "ضبط " لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
   3. اضبط الطول الموجي للضوء الساقط لإثارة الفلوروفورات عن طريق تدوير مكعب التألق. تم استخدام الألوان الزائفة لتمييز الانبعاث من ملصقات الفلورسنت المختلفة (الضوء الأزرق: DAPI ؛ الضوء الأخضر: Myo7A ؛ الضوء الأحمر: phalloidin).
   4. عن طريق مسح عينة الأنسجة ، قم بإنشاء وجمع بيانات التصوير كملفات صور .tif و .jpg.

النتائج

تحول في عتبة السمع ABR
تم قياس عتبة السمع للفئران باستخدام ABR المتفجر إما يوم واحد أو أسبوع واحد بعد التعرض للضوضاء. لوحظت زيادة كبيرة في عتبة السمع في جميع الترددات الثلاثة المختبرة (12 كيلو هرتز: 84.29 ± 2.77 ديسيبل SPL ؛ 24 كيلو هرتز: 91.43 ± 0.92 ديسيبل SPL ؛ 32 كيلو هرتز: 98.57 ± 1.43 ديسيبل SPL) بعد يو...

Discussion

يمكن تقسيم NIHL إلى نوعين: NIHL المؤقت ، والذي يظهر تحولا زمنيا لعتبة السمع ، و NIHL الدائم ، والذي يتميز بتحول عتبة السمع الدائم. ويعتقد أن فقدان السمع الذي لاحظناه^{في اليوم 6} (1 يوم بعد التعرض للضوضاء) هو مزيج من هذين النوعين. في هذه الحالة ، ستظهر عتبة السمع انتعاشا تدريجيا بمرور الوقت بسبب ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4" CCP Free-field Standard Microphone Set	GRAS	428158	For noise exposure
Amplifier Input Module, AMI100D	BIOPAC		For auditory brainstem response
Bio-amplifier, BIO100C	BIOPAC		For auditory brainstem response
Bovine Serum Albumin	SIGMA	A9647	Immunofluorescence staining
Cellsens software	Olympus life science		Image acquisition
Corrugated plastic
DAPI fluoromount	SouthernBiotech	0100-20	Immunofluorescence staining
Ethylenediaminetetraacetic acid	SIGMA	E5134	Decalcification
Evoked Response Amplifier, ERS100C	BIOPAC		For auditory brainstem response
Formaldehyde	APLHA	F030410	Fixation of cochlear
High Performance Data Acquisition System, MP160	BIOPAC		For auditory brainstem response
Modular Extension Cable, MEC110C	BIOPAC		For auditory brainstem response
Myo7A primary antibody	Proteus	25-6790	Immunofluorescence staining
Myo7A secondary antibody	Jackson immunoresearch	711-545-152	Immunofluorescence staining
Needle Electrode, Unipolar 12 mmTp, EL452	BIOPAC		For auditory brainstem response
phalloidin antibody	Alexa Fluor	A12381	Immunofluorescence staining
phosphate-buffered saline	SIGMA	P4417
Rat trap cage			14 cm x 17 cm x 24cm
ROMPUN- xylazine injection, solution	Bayer HealthCare, LLC
Sound amplifier, MT-1000	unika		For noise exposure
Sound generator/analyzer/miscellaneous, FW-02	CLIO	620300719	For noise exposure
Soundproof chamber	IEA Electro-Acoustic Technology		For noise exposure and ABR
Speaker	IEA Electro-Acoustic Technology		For noise exposure
Stimulator Module, STM100C	BIOPAC		For auditory brainstem response
Triton X-100	SIGMA	T8787	Immunofluorescence staining
Tubephone Set, OUT101	BIOPAC		For auditory brainstem response
Upright Microscope, BX53	Olympus		Image acquisition
Zoletil	Virbac