Condiciones experimentales modificadas para la pérdida de audición inducida por ruido en ratones y evaluación de la función auditiva y el daño de las células ciliadas externas

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para un modelo de ratón de pérdida auditiva inducida por ruido (NIHL). Para inducir el NIHL, desarrollamos un dispositivo nuevo y sencillo que utiliza plástico corrugado, una jaula trampa para ratas y un altavoz. Se emplearon imágenes de inmunofluorescencia y respuesta auditiva del tronco encefálico para evaluar la función auditiva y el daño de las células ciliadas externas, respectivamente.

Resumen

Un modelo animal de pérdida auditiva inducida por ruido (NIHL, por sus siglas en inglés) es útil para que los patólogos, terapeutas, farmacólogos e investigadores de la audición comprendan a fondo el mecanismo de NIHL y, posteriormente, optimicen las estrategias de tratamiento correspondientes. Este estudio tiene como objetivo crear un protocolo mejorado para desarrollar un modelo de ratón de NIHL. En este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6J. Los ratones no anestesiados fueron expuestos a ruidos fuertes (1 y 6 kHz, presentados simultáneamente a 115-125 dB SPL-A) de forma continua durante 6 h al día durante 5 días consecutivos. La función auditiva se evaluó 1 día y 1 semana después de la exposición al ruido, utilizando la respuesta auditiva del tronco encefálico (ABR). Después de la medición de ABR, los ratones fueron sacrificados y sus órganos de Corti fueron recolectados para la tinción de inmunofluorescencia. A partir de las mediciones de la respuesta auditiva del tronco encefálico (ABR), se observó una pérdida auditiva significativa 1 día después de la exposición al ruido. Después de 1 semana, los umbrales de audición de los ratones experimentales disminuyeron a ~80 dB SPL, que seguía siendo un nivel significativamente más alto que el de los ratones de control (~40 dB SPL). A partir de los resultados de las imágenes de inmunofluorescencia, se demostró que las células ciliadas externas (OHC) estaban dañadas. En resumen, creamos un modelo de NIHL utilizando ratones machos C57BL/6J. Se desarrolló y luego se empleó un dispositivo nuevo y sencillo para generar y emitir ruido de tonos puros. Las mediciones cuantitativas de los umbrales de audición y la confirmación morfológica del daño de la OHC demostraron que el ruido aplicado indujo con éxito una pérdida auditiva esperada.

Introducción

Alrededor de 1.300 millones de personas en todo el mundo sufren pérdida de audición debido a^{la exposición al} ruido. En este estudio, nuestro objetivo fue establecer un proceso claro paso a paso para inducir y confirmar la pérdida auditiva inducida por ruido (NIHL). La NIHL es el resultado de una degeneración/destrucción de las células ciliadas (HC) y de las neuronas ganglionares espirales (SGN), daño en los estereocilios de HC y/o pérdida de sinapsis entre las HC internas de la coclear y las SGN. Tales anomalías también pueden causar tinnitus y deterioro de la percepción del habla (especialmente en un entorno acústico complejo) además de NIHL. Las funciones sociales, psicológicas y cognitivas pueden verse afectadas secuencialmente por estas deficiencias fisiológicas 2,3,4,5,6.

En los estudios preclínicos relacionados con NIHL basados en ratones, las cepas de ratón más populares son CBA/CaJ 2,3,6,7 y C57BL/6 4,5,8. Los ratones^machos 3,4,7, además, son más utilizados que las hembras^, ya que el estrógeno tiene un efecto protector sobre la audición. Por lo tanto, en este estudio solo utilizamos ratones machos⁹. Después de consultar la literatura, elegimos 1 kHz y 6 kHz como frecuencias del ruido aplicado. La intensidad del ruido aplicado fue de 115 dB SPL-A (alrededor de la jaula) a 125 dB SPL-A (en el centro de la jaula). Después de exponer a los ratones experimentales al ruido de forma continua durante 6 h al día, durante 5 días consecutivos, un aumento óptimo del umbral auditivo indicó que se generó una extensión óptima de NIHL en los ratones experimentales. Las operaciones para el manejo de los animales, la construcción de la configuración experimental y la inducción del ruido se describen claramente paso a paso en el protocolo proporcionado.

Protocolo

Los experimentos con animales en este estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales del Mackay Medical College. Se compraron ratones machos C57BL/6J de ocho semanas de edad en el Centro Nacional de Animales de Laboratorio (Ciudad de New Taipei, Taiwán). Todos los ratones fueron criados y alojados de acuerdo con el protocolo estándar para animales.

1. Inducción de NIHL en ratones

1. Preparar la jaula para los ratones experimentales
   1. Para ello, utiliza una jaula trampa para ratas con unas dimensiones de 14 cm × 17 cm × 24 cm. Corta cuatro piezas de cartón corrugado en tamaños apropiados, haciendo que quepan en la jaula (13 cm × 23 cm y 13 cm × 16 cm).
   2. Para evitar que los ratones se corten las patas con la rejilla de malla, coloque dos de las piezas en la parte inferior y en la parte posterior, respectivamente. Coloca las otras dos piezas perpendicularmente entrelazadas entre sí, para dividir el espacio dentro de la jaula en cuartos.
2. Realice este estudio en una caja insonorizada. Coloque un altavoz a 8,5 cm delante de la jaula y coloque tanto el altavoz como la caja en una caja insonorizada.
3. Abra el software de la aplicación CLIO
4. Mueva el cursor hasta el icono del altavoz y, a continuación, haga clic en TwoSin. Ingrese y cambie el valor de Frecuencia 1 a 1000 Hz, Frecuencia 2 a 6000 Hz y haga clic en Aceptar para comenzar a reproducir el sonido.
5. En la pestaña Leq, cambie dBV a dBSPL. Después de configurar la hora en la interfaz del software, haga clic en el botón del triángulo verde para reproducir el sonido.
6. Coloque un micrófono delante del altavoz a una distancia de 8,5 cm para calibrar el nivel de ruido (véase el Archivo complementario 1). Ajuste el nivel de ruido a 125 dB SPL-A y controle continuamente durante no menos de 3 minutos para asegurarse de que el nivel de ruido sea lo suficientemente estable. Utilice un generador, un analizador y un amplificador para crear y controlar el ruido. (Figura 1)
   NOTA: Realice este paso en una caja insonorizada para evitar daños en la audición del operador.
7. Coloque cuatro ratones machos C57BL/6J en la jaula (uno por cada cuarto) para exponerlos al ruido. Asigne aleatoriamente los ratones en cada cuarto durante la exposición al ruido. Coloque un micrófono en la parte superior de la jaula para controlar el nivel de ruido durante la exposición al ruido (Figura 2).
   NOTA: Realice este paso en una caja insonorizada para evitar daños en la audición del operador.
8. Exponga los ratones al ruido a frecuencias de 1 kHz y 6 kHz de forma continua durante 6 h al día, durante 5 días consecutivos.
9. Mida los umbrales de audición de los ratones 1 día después de la exposición al ruido (es decir, en el^6º día) midiendo el ABR. Repita estas mediciones de ABR de nuevo 1 semana después de la exposición al ruido (es decir, el^13º día). Después de las mediciones de ABR, sacrifique todos los ratones involucrados y extraiga sus cócleas (Figura 3).

2. Evaluación del umbral de audición basada en la respuesta auditiva del tronco encefálico (ABR)

1. Utilizar un sistema comercial de pruebas ABR diseñado específicamente para animales pequeños¹⁰.
2. Inyectar intraperitonealmente una mezcla de tiletamina y zolazepam (40 mg/kg) y xilacina (9,3 mg/kg) en los ratones para anestesia general.
   NOTA: La evaluación ABR dura ~2 h. Asegúrese de proporcionar soporte térmico a través de una almohadilla térmica y aplique ungüento para los ojos para evitar la sequedad mientras el ratón está bajo anestesia.
3. Mida el ABR en el ratón bajo anestesia general. Coloque electrodos de aguja subdérmicos (12 mm) en el vértice, detrás del pabellón auricular izquierdo y hacia atrás cerca de la cola para medir el umbral de audición.
4. Presentar estímulos acústicos mediante un altavoz colocado a 1 cm de la oreja izquierda del animal.
5. Utilice un osciloscopio para controlar los estímulos acústicos. Elija Onda sinusoidal para los estímulos y 10 k para la escala de ventana. Gire la perilla de frecuencia para obtener la frecuencia deseada de los estímulos acústicos.
6. Ajuste la intensidad del estímulo girando la perilla AMLP en el generador de funciones. Obtenga la intensidad de estímulo deseada girando la perilla AMLP a un voltaje adecuado, calculado a partir de la calibración.
7. Recopile las mediciones de ABR bajo una serie de intensidades de estímulo, desde 10 dB SPL hasta 100 dB SPL, con un tamaño de paso de 10 dB.
   NOTA: Mida el umbral de audición en una caja insonorizada. Se asumió que el nivel mínimo de intensidad de estímulo que podría dar lugar a una onda V discernible en la señal recolectada era el umbral ABR^10,11 (Figura 4). Después de la evaluación ABR, monitorizar al animal hasta que se recupere de la anestesia (~1 h).

3. Examen microscópico

1. Fijación del tejido extraído
   1. Después de las mediciones de ABR, sacrificar al ratón inyectando intraperitonealmente una mezcla de tiletamina y zolazepam (100 mg/kg) y xilacina (23,25 mg/kg) para el examen microscópico.
   2. Extraiga las cócleas del ratón y sumérjalas inmediatamente en formaldehído (FA) al 10% para su fijación (dos cócleas/ml) durante al menos 8 h a 4 °C.
   3. Después de la fijación, sustituya la solución de FA por una solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 10% para la descalcificación durante 3-4 días a 4 °C. Luego, revise cada cóclea con pinzas para confirmar que las cócleas estén lo suficientemente ablandadas.
   4. Coloque las cócleas en una placa de Petri llena de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y corte el órgano en forma de espiral de Corti (OC) (cada cóclea descalcificada) en tres secciones: el giro basal, el giro medio y el giro apical, para la tinción del tejido.
   5. Bajo un microscopio de disección (aumento: 8x-35x), extraer las estructuras óseas (escala vestibular, rampa timpánica y modiolo) de la cóclea descalcificada y obtener el tejido blando, incluido el OC (grosor: aproximadamente 40 μm).
2. Tinción de inmunofluorescencia de la cóclea
   1. Preparación del tampón de bloqueo: Preparar soluciones de albúmina sérica bovina (BSA) al 2% y Triton X-100 al 0,2% en PBS.
   2. Transfiera el tejido que se va a teñir de la placa de Petri a un tubo de microcentrífuga y sumerja el tejido en 0,1 ml del tampón de bloqueo durante 2 h a temperatura ambiente (RT).
   3. Preparación del tampón de anticuerpos primarios Myo7A: Diluir el anticuerpo primario Myo7A en el tampón de bloqueo a una proporción de volumen de 1:200.
   4. Tratar el tejido en el tubo de microcentrífuga con 100 μL de tampón de anticuerpos primarios Myo7A durante 2 h en RT.
   5. Enjuague el pañuelo tres veces en PBS durante 5 minutos cada una.
   6. Preparación del tampón del anticuerpo secundario Myo7A (Myo7A-Rb-488) y del anticuerpo faloidina (faloidina-594): Diluir el anticuerpo secundario Myo7A (1:400) y el anticuerpo faloidina (1:200) en el tampón de bloqueo.
   7. Tratar el tejido con 100 μL de anticuerpo secundario Myo7A y tampón de anticuerpos faloidina durante 2 h en RT.
   8. Después del tratamiento con anticuerpos + faloidina, enjuague el tejido en PBS tres veces, durante 5 minutos cada una.
   9. Transfiera el tejido enjuagado del tubo de microcentrífuga a una placa de Petri llena de PBS utilizando una pipeta de transferencia de plástico de 1 ml con una punta cortada.
   10. Para prepararse para el examen microscópico, despliegue el tejido, colóquelo en un portaobjetos de vidrio y agregue 15 μL de medio fluoromount 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) sobre el tejido para cubrirlo por completo. Coloque suavemente un cubreobjetos de vidrio sobre el pañuelo. Deja el portaobjetos toda la noche en RT antes de sellarlo con esmalte de uñas.
3. Adquisición de imágenes
   1. Adquiera imágenes 2D utilizando un microscopio de fluorescencia vertical y un software de adquisición de imágenes.
   2. Antes de realizar el examen microscópico, centre el tejido en el campo de visión y ajuste la sensibilidad a ISO 100. Ajuste el tiempo de exposición inicialmente haciendo clic en el botón Modo automático del software y luego ajuste manualmente haciendo clic en el botón Ajustar para optimizar la relación señal-ruido.
   3. Ajuste la longitud de onda de la luz incidente para excitar los fluoróforos girando el cubo de fluorescencia. Se utilizaron pseudocolores para marcar la emisión de diferentes etiquetas fluorescentes (luz azul: DAPI; luz verde: Myo7A; luz roja: faloidina).
   4. Al escanear la muestra de tejido, genere y recopile los datos de imágenes como archivos de imagen .tif y .jpg.

Resultados

Un cambio en el umbral de audición de ABR
El umbral de audición de los ratones se midió utilizando ABR de ráfaga de tono 1 día o 1 semana después de la exposición al ruido. Se observó un aumento significativo en el umbral de audición en las tres frecuencias probadas (12 kHz: 84,29 ± 2,77 dB SPL; 24 kHz: 91,43 ± 0,92 dB SPL; 32 kHz: 98,57 ± 1,43 dB SPL) 1 día después de la exposición al ruido (es decir, el^6º día). La recuperación parcial de la audición se produjo 1 semana ...

Discusión

El NIHL se puede dividir en dos tipos: NIHL temporal, que muestra un cambio temporal del umbral de audición, y NIHL permanente, que se caracteriza por un cambio permanente del umbral de audición. Se cree que la pérdida auditiva que observamos en el sexto día (^{1 día después} de la exposición al ruido) es una combinación de estos dos tipos. En este caso, el umbral auditivo mostraría una recuperación gradual a lo largo del tiempo debido al componente temporal de la pérdida auditiva. En nuestros estudios...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4" CCP Free-field Standard Microphone Set	GRAS	428158	For noise exposure
Amplifier Input Module, AMI100D	BIOPAC		For auditory brainstem response
Bio-amplifier, BIO100C	BIOPAC		For auditory brainstem response
Bovine Serum Albumin	SIGMA	A9647	Immunofluorescence staining
Cellsens software	Olympus life science		Image acquisition
Corrugated plastic
DAPI fluoromount	SouthernBiotech	0100-20	Immunofluorescence staining
Ethylenediaminetetraacetic acid	SIGMA	E5134	Decalcification
Evoked Response Amplifier, ERS100C	BIOPAC		For auditory brainstem response
Formaldehyde	APLHA	F030410	Fixation of cochlear
High Performance Data Acquisition System, MP160	BIOPAC		For auditory brainstem response
Modular Extension Cable, MEC110C	BIOPAC		For auditory brainstem response
Myo7A primary antibody	Proteus	25-6790	Immunofluorescence staining
Myo7A secondary antibody	Jackson immunoresearch	711-545-152	Immunofluorescence staining
Needle Electrode, Unipolar 12 mmTp, EL452	BIOPAC		For auditory brainstem response
phalloidin antibody	Alexa Fluor	A12381	Immunofluorescence staining
phosphate-buffered saline	SIGMA	P4417
Rat trap cage			14 cm x 17 cm x 24cm
ROMPUN- xylazine injection, solution	Bayer HealthCare, LLC
Sound amplifier, MT-1000	unika		For noise exposure
Sound generator/analyzer/miscellaneous, FW-02	CLIO	620300719	For noise exposure
Soundproof chamber	IEA Electro-Acoustic Technology		For noise exposure and ABR
Speaker	IEA Electro-Acoustic Technology		For noise exposure
Stimulator Module, STM100C	BIOPAC		For auditory brainstem response
Triton X-100	SIGMA	T8787	Immunofluorescence staining
Tubephone Set, OUT101	BIOPAC		For auditory brainstem response
Upright Microscope, BX53	Olympus		Image acquisition
Zoletil	Virbac