Farelerde Gürültüye Bağlı İşitme Kaybı için Değiştirilmiş Deneysel Koşullar ve İşitme Fonksiyonu ve Dış Tüylü Hücre Hasarının Değerlendirilmesi

Özet

Burada, gürültüye bağlı işitme kaybının (NIHL) bir fare modeli için bir protokol sunuyoruz. NIHL'yi teşvik etmek için oluklu plastik, bir fare kapanı kafesi ve bir hoparlör kullanarak yeni ve basit bir cihaz geliştirdik. İşitme fonksiyonunu değerlendirmek için sırasıyla işitsel beyin sapı yanıtı ve immünofloresan görüntüleme ve dış tüylü hücre hasarı kullanıldı.

Özet

Gürültüye bağlı işitme kaybının (NIHL) bir hayvan modeli, patologlar, terapistler, farmakologlar ve işitme araştırmacıları için NIHL mekanizmasını tam olarak anlamak ve ardından ilgili tedavi stratejilerini optimize etmek için yararlıdır. Bu çalışma, NIHL'nin bir fare modelini geliştirmek için geliştirilmiş bir protokol oluşturmayı amaçlamaktadır. Bu çalışmada erkek C57BL/6J fareler kullanıldı. Anestezi uygulanmamış fareler, art arda 5 gün boyunca günde 6 saat boyunca sürekli olarak yüksek seslere (1 ve 6 kHz, aynı anda 115-125 dB SPL-A'da sunulur) maruz bırakıldı. İşitsel fonksiyon, gürültüye maruz kaldıktan 1 gün ve 1 hafta sonra, işitsel beyin sapı yanıtı (ABR) kullanılarak değerlendirildi. ABR ölçümünden sonra fareler sakrifiye edildi ve immünofloresan boyama için Corti organları toplandı. İşitsel beyin sapı yanıtı (ABR) ölçümlerinden gürültüye maruz kaldıktan 1 gün sonra önemli işitme kaybı gözlendi. 1 hafta sonra, deney farelerinin işitme eşikleri ~ 80 dB SPL'ye düştü, bu da kontrol farelerinden (~ 40 dB SPL) önemli ölçüde daha yüksek bir seviyeydi. İmmünofloresan görüntüleme sonuçlarından, dış saç hücrelerinin (OHC'ler) hasar gördüğü gösterilmiştir. Özetle, erkek C57BL / 6J fareleri kullanarak bir NIHL modeli oluşturduk. Saf tonlu gürültü üretmek ve iletmek için yeni ve basit bir cihaz geliştirildi ve ardından kullanıldı. İşitme eşiklerinin kantitatif ölçümleri ve OHC hasarının morfolojik olarak doğrulanması, uygulanan gürültünün beklenen işitme kaybını başarılı bir şekilde indüklediğini göstermiştir.

Giriş

Dünya çapında yaklaşık 1,3 milyar insan gürültüye maruz kalma nedeniyle işitme kaybından muzdariptir¹. Bu çalışmada, gürültüye bağlı işitme kaybını (NIHL) indüklemek ve doğrulamak için adım adım net bir süreç oluşturmayı amaçladık. NIHL, tüy hücrelerinin (HC'ler) ve spiral ganglion nöronlarının (SGN'ler) dejenerasyonu/yıkımı, HC stereosilialarındaki hasar ve/veya koklear iç HC'ler ile SGN'ler arasındaki sinapsların kaybından kaynaklanır. Bu tür anormallikler, NIHL'nin yanı sıra kulak çınlamasına ve konuşma algısında bozulmaya (özellikle karmaşık bir akustik ortamda) da neden olabilir. Sosyal, psikolojik ve bilişsel işlevler bu fizyolojik eksikliklerden sırayla etkilenebilir ^2,3,4,5,6.

Farelere dayalı NIHL ile ilgili klinik öncesi çalışmalarda, en popüler fare suşları CBA/CaJ 2,3,6,7 ve C57BL/⁶ 4,5,8'dir. Ayrıca erkek ^3,4,7 fareler^, östrojenin işitme üzerinde koruyucu bir etkisi olduğu için dişi farelerden daha yaygın olarak kullanılır. Bu nedenle, bu çalışmada sadece erkek fareler kullandık⁹. Literatüre baktıktan sonra uygulanan gürültünün frekansları olarak 1 kHz ve 6 kHz'i seçtik. Uygulanan gürültünün yoğunluğu 115 dB SPL-A (kafesi çevreleyen) ile 125 dB SPL-A (kafesin merkezinde) arasındaydı. Deney farelerini günde 6 saat boyunca sürekli olarak gürültüye maruz bıraktıktan sonra, art arda 5 gün boyunca, işitme eşiğinde optimum bir artış, deney farelerinde optimum ölçüde NIHL üretildiğini gösterdi. Hayvanlarla ilgilenme, deney düzeneğini oluşturma ve gürültüyü indükleme işlemlerinin tümü, sağlanan protokolde adım adım açıkça açıklanmıştır.

Protokol

Bu çalışmadaki hayvan deneyleri, Mackay Tıp Fakültesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Sekiz haftalık Erkek C57BL / 6J fareleri, Ulusal Laboratuvar Hayvanları Merkezi'nden (New Taipei City, Tayvan) satın alındı. Tüm fareler, standart hayvan protokolüne uygun olarak yetiştirildi ve barındırıldı.

1. Farelerde NIHL indüksiyonu

1. Deney fareleri için kafesi hazırlayın
   1. Bunu yapmak için 14 cm × 17 cm × 24 cm boyutlarında bir fare kapanı kafesi kullanın. Dört parça oluklu plastik levhayı uygun boyutlarda kesin ve kafese sığacak şekilde (13 cm × 23 cm ve 13 cm × 16 cm).
   2. Farelerin ayaklarının ağ ızgarası tarafından kesilmesini önlemek için, parçalardan ikisini sırasıyla alta ve arka tarafa yerleştirin. Kafes içindeki boşluğu dörde bölmek için diğer iki parçayı birbirine dik olarak yerleştirin.
2. Bu çalışmayı ses geçirmez bir kutuda gerçekleştirin. Kafesin önüne 8.5 cm bir hoparlör yerleştirin ve hem hoparlörü hem de kafesi ses geçirmez bir kutuya yerleştirin.
3. CLIO uygulama yazılımını açın
4. İmleci hoparlör simgesine getirin, ardından TwoSin'e tıklayın. Frekans 1 değerini 1000 Hz, Frekans 2 değerini 6000 Hz olarak girin ve değiştirin ve sesi çalmaya başlamak için Tamam'a tıklayın.
5. Leq sekmesi altında, dBV'yi dBSPL olarak değiştirin. Yazılım arayüzünde saati ayarladıktan sonra, sesi çalmak için yeşil üçgen düğmesine tıklayın.
6. Gürültü seviyesini kalibre etmek için hoparlörün önüne 8.5 cm mesafeden bir mikrofon yerleştirin (bkz. Ek Dosya 1). Gürültü seviyesini 125 dB SPL-A'ya ayarlayın ve gürültü seviyesinin yeterince kararlı olduğundan emin olmak için en az 3 dakika boyunca sürekli izleyin. Gürültüyü oluşturmak ve kontrol etmek için bir jeneratör, bir analizör ve bir amplifikatör kullanın. (Şekil 1)
   NOT: Operatörün işitme duyusuna zarar vermemek için bu adımı ses geçirmez bir kutuda yapın.
7. Gürültüye maruz kalmak için dört erkek C57BL/6J fareyi kafese yerleştirin (her çeyrek için bir tane). Gürültüye maruz kalma sırasında fareleri her çeyrekte rastgele atayın. Gürültüye maruz kalma sırasında gürültü seviyesini izlemek için kafesin üstüne bir mikrofon yerleştirin (Şekil 2).
   NOT: Operatörün işitme duyusuna zarar vermemek için bu adımı ses geçirmez bir kutuda yapın.
8. Fareleri, art arda 1 gün boyunca günde 6 saat boyunca sürekli olarak 6 kHz ve 5 kHz frekanslarında gürültüye maruz bırakın.
9. ABR'yi ölçerek gürültüye maruz kaldıktan 1 gün sonra (yani 6. günde) farelerin işitme eşiklerini ölçün. Bu ABR ölçümlerini gürültüye maruz kaldıktan 1 hafta sonra (yani 13^{. günde}) tekrarlayın. ABR ölçümlerinden sonra, ilgili tüm fareleri sakride edin ve koklealarını toplayın (Şekil 3).

2. İşitme eşiğinin işitsel beyin sapı yanıtı (ABR) temelli değerlendirmesi

1. Küçük hayvanlar için özel olarak tasarlanmış ticari bir ABR test sistemi kullanın¹⁰.
2. Genel anestezi için farelere intraperitoneal olarak tiletamin ve zolazepam (40 mg / kg) ve ksilazin (9.3 mg / kg) karışımı enjekte edilir.
   NOT: ABR değerlendirmesi ~2 saat sürer. Fare anestezi altındayken kuruluğu önlemek için bir ısıtma yastığı ile termal destek sağladığınızdan ve göz merhemi uyguladığınızdan emin olun.
3. Genel anestezi altında farede ABR'yi ölçün. İşitme eşiğini ölçmek için subdermal iğne elektrotlarını (12 mm) tepe noktasına, sol kulağın kulak kepçesinin arkasına ve kuyruğun yanına yerleştirin.
4. Hayvanın sol kulağından 1 cm uzağa yerleştirilmiş bir hoparlör kullanarak akustik uyaranlar sunun.
5. Akustik uyaranları kontrol etmek için bir osiloskop kullanın. Uyaranlar için Sinüs Dalgası'nı ve pencere ölçeği için 10 k'yi seçin. Akustik uyaranların istenen frekansını elde etmek için Frekans düğmesini çevirin.
6. Fonksiyon üreteci üzerindeki AMLP düğmesini çevirerek uyaran yoğunluğunu ayarlayın. AMLP düğmesini kalibrasyondan hesaplanan uygun bir voltaja çevirerek istenen uyaran yoğunluğunu elde edin.
7. ABR ölçümlerini, 10 dB adım boyutuyla 10 dB SPL'den 100 dB SPL'ye kadar bir dizi uyaran yoğunluğu altında toplayın.
   NOT: İşitme eşiğini ses geçirmez bir kutuda ölçün. Toplanan sinyalde fark edilebilir bir Dalga V'ye yol açabilecek minimum uyaran yoğunluğu seviyesinin ABR eşiği^10,11 olduğu varsayılmıştır (Şekil 4). ABR sonrası değerlendirme, anesteziden iyileşene kadar hayvanı izleyin (~ 1 saat).

3. Mikroskobik inceleme

1. Hasat edilen dokunun sabitlenmesi
   1. ABR ölçümlerinden sonra, mikroskobik inceleme için intraperitoneal olarak tiletamin ve zolazepam (100 mg/kg) ve ksilazin (23.25 mg/kg) karışımı enjekte edilerek fareyi sakrifiye edin.
   2. Kokleaları fareden toplayın ve 4 °C'de en az 8 saat boyunca fiksasyon için (iki koklea/mL) hemen %10 formaldehite (FA) daldırın.
   3. Fiksasyonun ardından, FA çözeltisini 4 ° C'de 3-4 gün boyunca kireç çözme için% 10 etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi ile değiştirin. Ardından, kokleaların yeterince yumuşadığını doğrulamak için her bir kokleayı cımbızla kontrol edin.
   4. Kokleaları fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin ve spiral şekilli Corti (OC) organını (her biri kireçten arındırılmış koklea) üç bölüme ayırın - bazal dönüş, orta dönüş ve apikal dönüş - doku boyama için.
   5. Diseksiyon mikroskobu altında (büyütme: 8x-35x), dekalsifiye kokleaların kemik yapılarını (skala vestibuli, skala timpani ve modiolus) çıkarın ve OC dahil yumuşak dokuyu elde edin (kalınlık: yaklaşık 40 μm).
2. Koklea immünofloresan boyama
   1. Bloke edici tamponun hazırlanması: PBS'de% 2 sığır serum albümini (BSA) ve% 0.2 Triton X-100 çözeltileri hazırlayın.
   2. Boyanacak dokuyu Petri kabından bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve dokuyu oda sıcaklığında (RT) 2 saat boyunca 0.1 mL bloke edici tampona daldırın.
   3. Myo7A primer antikor tamponunun hazırlanması: Bloke edici tampondaki Myo7A primer antikorunu 1:200 hacim oranında seyreltin.
   4. Mikrosantrifüj tüpündeki dokuyu RT'de 2 saat boyunca 100 μL Myo7A primer antikor tamponu ile tedavi edin.
   5. Dokuyu PBS'de her biri 5 dakika boyunca üç kez durulayın.
   6. Myo7A sekonder antikoru (Myo7A-Rb-488) ve falloidin antikoru (falloidin-594) tamponunun hazırlanması: Bloke edici tamponda Myo7A sekonder antikoru (1:400) ve falloidin antikoru (1:200) seyreltin.
   7. Dokuyu RT'de 2 saat boyunca 100 μL Myo7A ikincil antikoru ve falloidin antikoru tamponu ile tedavi edin.
   8. Antikor + falloidin antikor tedavisinden sonra, dokuyu PBS'de her biri 5 dakika boyunca üç kez durulayın.
   9. Durulanan dokuyu mikrosantrifüj tüpünden, kesik uçlu 1 mL'lik bir plastik transfer pipeti kullanarak PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın.
   10. Mikroskobik incelemeye hazırlanmak için dokuyu açın, bir cam slayt üzerine yerleştirin ve tamamen kaplamak için dokuya 15 μL 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) florormount ortamı ekleyin. Dokunun üzerine nazikçe bir cam lamel yerleştirin. Oje ile kapatmadan önce slaytı gece boyunca RT'de bırakın.
3. Görüntü edinme
   1. Dik bir floresan mikroskobu ve görüntü alma yazılımı kullanarak 2D görüntüler elde edin.
   2. Mikroskobik incelemeyi gerçekleştirmeden önce, dokuyu görüş alanında ortalayın ve hassasiyeti ISO 100'e ayarlayın. Başlangıçta yazılımın Otomatik Mod düğmesine tıklayarak pozlama süresini ayarlayın ve ardından sinyal-gürültü oranını optimize etmek için Ayarla düğmesine tıklayarak manuel olarak ince ayar yapın.
   3. Floresan küpünü döndürerek floroforları uyarmak için gelen ışığın dalga boyunu ayarlayın. Farklı floresan etiketlerden kaynaklanan emisyonu işaretlemek için sahte renkler kullanıldı (mavi ışık: DAPI; yeşil ışık: Myo7A; kırmızı ışık: phalloidin).
   4. Doku örneğini tarayarak, görüntüleme verilerini .tif ve .jpg görüntü dosyaları olarak oluşturun ve toplayın.

Sonuçlar

ABR işitme eşiğinde bir değişiklik
Farelerin işitme eşiği, gürültüye maruz kaldıktan 1 gün veya 1 hafta sonra ton patlaması ABR kullanılarak ölçüldü. Test edilen her üç frekansta da işitme eşiğinde önemli bir artış gözlenmiştir (12 kHz: 84.29 ± 2.77 dB SPL; 24 kHz: 91.43 ± 0.92 dB SPL; 32 kHz: 98.57 ± 1.43 dB SPL) gürültüye maruz kaldıktan 1 gün sonra (yani 6^{. gün).} Kısmi işitme iyileşmesi, gürültüye maruz kaldıktan 1 hafta sonra (yani 13. gün)...

Tartışmalar

NIHL iki türe ayrılabilir: işitme eşiğinin zamansal kaymasını gösteren geçici NIHL ve kalıcı bir işitme eşiği kayması ile öne çıkan kalıcı NIHL. 6. günde (gürültüye maruz kaldıktan 1 gün sonra) gözlemlediğimiz işitme kaybının bu iki tipin bir kombinasyonu olduğuna inanılmaktadır^. Bu durumda, işitme eşiği, işitme kaybının zamansal bileşeni nedeniyle zaman içinde kademeli bir iyileşme gösterecektir. Ön deneysel çalışmalarımızda, aynı kurulum ve hayvanlarla elde ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4" CCP Free-field Standard Microphone Set	GRAS	428158	For noise exposure
Amplifier Input Module, AMI100D	BIOPAC		For auditory brainstem response
Bio-amplifier, BIO100C	BIOPAC		For auditory brainstem response
Bovine Serum Albumin	SIGMA	A9647	Immunofluorescence staining
Cellsens software	Olympus life science		Image acquisition
Corrugated plastic
DAPI fluoromount	SouthernBiotech	0100-20	Immunofluorescence staining
Ethylenediaminetetraacetic acid	SIGMA	E5134	Decalcification
Evoked Response Amplifier, ERS100C	BIOPAC		For auditory brainstem response
Formaldehyde	APLHA	F030410	Fixation of cochlear
High Performance Data Acquisition System, MP160	BIOPAC		For auditory brainstem response
Modular Extension Cable, MEC110C	BIOPAC		For auditory brainstem response
Myo7A primary antibody	Proteus	25-6790	Immunofluorescence staining
Myo7A secondary antibody	Jackson immunoresearch	711-545-152	Immunofluorescence staining
Needle Electrode, Unipolar 12 mmTp, EL452	BIOPAC		For auditory brainstem response
phalloidin antibody	Alexa Fluor	A12381	Immunofluorescence staining
phosphate-buffered saline	SIGMA	P4417
Rat trap cage			14 cm x 17 cm x 24cm
ROMPUN- xylazine injection, solution	Bayer HealthCare, LLC
Sound amplifier, MT-1000	unika		For noise exposure
Sound generator/analyzer/miscellaneous, FW-02	CLIO	620300719	For noise exposure
Soundproof chamber	IEA Electro-Acoustic Technology		For noise exposure and ABR
Speaker	IEA Electro-Acoustic Technology		For noise exposure
Stimulator Module, STM100C	BIOPAC		For auditory brainstem response
Triton X-100	SIGMA	T8787	Immunofluorescence staining
Tubephone Set, OUT101	BIOPAC		For auditory brainstem response
Upright Microscope, BX53	Olympus		Image acquisition
Zoletil	Virbac