생쥐의 소음성 난청에 대한 수정된 실험 조건 및 청력 기능 및 외부 유모 세포 손상 평가

요약

여기서는 소음성 난청(NIHL)의 마우스 모델에 대한 프로토콜을 제시합니다. NIHL을 유도하기 위해 골판지 플라스틱, 쥐덫 케이지 및 스피커를 사용하여 새롭고 간단한 장치를 개발했습니다. 청각 뇌간 반응과 면역형광 영상을 각각 사용하여 청력 기능과 외부 유모 세포 손상을 평가했습니다.

초록

소음성 난청(NIHL)의 동물 모델은 병리학자, 치료사, 약리학자 및 청력 연구자가 NIHL의 메커니즘을 철저히 이해하고 이후에 해당 치료 전략을 최적화하는 데 유용합니다. 이 연구는 NIHL의 마우스 모델을 개발하기 위한 개선된 프로토콜을 만드는 것을 목표로 합니다. 수컷 C57BL/6J 마우스가 이 연구에 사용되었습니다. 마취되지 않은 마우스는 연속 5일 동안 하루 6시간 동안 지속적으로 시끄러운 소음(1kHz 및 6kHz, 115-125dB SPL-A에서 동시에 표시됨)에 노출되었습니다. 청각 기능은 청각 뇌간 반응(ABR)을 사용하여 소음 노출 후 1일 및 1주일 후에 평가되었습니다. ABR 측정 후, 마우스를 희생시키고, 면역형광 염색을 위해 그들의 코르티(Corti) 기관을 수집하였다. 청각 뇌간 반응(ABR) 측정에서 소음 노출 후 1일 후에 상당한 청력 손실이 관찰되었습니다. 1주일 후, 실험용 마우스의 청력 역치는 ~80dB SPL로 감소했으며, 이는 여전히 대조군 마우스(~40dB SPL)보다 훨씬 높은 수준이었습니다. 면역형광 영상의 결과로부터, 외모세포(OHC)가 손상된 것으로 나타났다. 요약하면, 우리는 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용하여 NIHL 모델을 만들었습니다. 순음 노이즈를 생성하고 전달하기 위한 새롭고 간단한 장치가 개발되어 채택되었습니다. 청력 역치의 정량적 측정과 OHC 손상의 형태학적 확인은 모두 적용된 소음이 예상되는 청력 손실을 성공적으로 유도했음을 입증했습니다.

서문

전 세계적으로 약 13억 명의 사람들이 소음 노출로 인한 청력 손실로 고통받고 있습니다¹. 본 연구에서는 소음성 난청(NIHL)을 유도하고 확인하기 위한 명확한 단계별 프로세스를 확립하는 것을 목표로 했습니다. NIHL은 유모 세포(HC) 및 나선형 신경절 뉴런(SGN)의 변성/파괴, HC 입체섬모의 손상 및/또는 달팽이관 내부 HC와 SGN 사이의 시냅스 손실로 인해 발생합니다. 이러한 이상은 NIHL 외에도 이명 및 언어 인식 장애(특히 복잡한 음향 환경에서)를 유발할 수 있습니다. 사회적, 심리적, 인지적 기능은 이러한 생리적 결함에 의해 순차적으로 영향을 받을 수 있다 2,3,4,5,6.

마우스를 기반으로 한 NIHL 관련 전임상 연구에서 가장 인기 있는 마우스 균주는 CBA/CaJ 2,3,6,7 및 C57BL/⁶

프로토콜

이 연구의 동물 실험은 Mackay Medical College의 Animal Care Committee의 승인을 받았습니다. 8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 National Laboratory Animal Center(대만 신베이시)에서 구입하였다. 모든 마우스는 표준 동물 프로토콜에 따라 사육되고 사육되었습니다.

1. 생쥐에서 NIHL 유도

1. 실험용 마우스를 위한 케이지 준비
   1. 이렇게하려면 14cm × 17cm × 24cm 크기의 쥐덫 케이지를 사용하십시오. 골판지 플라스틱 보드 4 개를 적절한 크기로 잘라 케이지 (13cm × 23cm, 13cm × 16cm)에 맞도록합니다.
   2. 쥐가 메쉬 그리드에 의해 발이 잘리는 것을 방지하려면 두 조각을 각각 바닥과 뒷면에 놓습니다. 다른 두 조각을 서로 수직으로 맞물려 배치하여 케이지 내의 공간을 4등분합니다.
2. 방음 상자에서이 연구를 수행하십시오. 케이지 앞 8.5cm에 스피커를 놓고 스피커와 케이지를 방음 상자에 넣습니다.
3. CLIO 애플리케이션 소프트웨어 열기
4. 커서를 스피커 아이콘으로 이동한 다음 TwoSin을

결과

ABR 청력 역치의 변화
마우스의 청력 역치는 소음 노출 후 1일 또는 1주일 후에 톤 버스트 ABR을 사용하여 측정되었습니다. 세 가지 테스트 주파수 모두에서 청력 역치의 상당한 증가가 관찰되었습니다(12kHz: 84.29 ± 2.77dB SPL, 24kHz: 91.43 ± 0.92dB SPL, 32kHz: 98.57 ± 1.43dB SPL) 소음 노출 후 1일(즉,^6일째). 부분적인 청력 회복은 소음 노출 후 1주일(즉, 13^일째)에 발생했지만 청력 역...

토론

NIHL은 청력 역치의 시간적 이동을 나타내는 일시적 NIHL과 영구적인 청력 역치 이동을 특징으로 하는 영구 NIHL의 두 가지 유형으로 나눌 수 있습니다. 6^일째 (소음 노출 후 1일)에 관찰한 청력 손실은 이 두 가지 유형의 조합으로 여겨집니다. 이 경우 청력 역치는 청력 손실의 시간적 구성 요소로 인해 시간이 지남에 따라 점진적인 회복을 보여줍니다. 우리의 예비 실험 연구에서, 동일한 설정...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4" CCP Free-field Standard Microphone Set	GRAS	428158	For noise exposure
Amplifier Input Module, AMI100D	BIOPAC		For auditory brainstem response
Bio-amplifier, BIO100C	BIOPAC		For auditory brainstem response
Bovine Serum Albumin	SIGMA	A9647	Immunofluorescence staining
Cellsens software	Olympus life science		Image acquisition
Corrugated plastic
DAPI fluoromount	SouthernBiotech	0100-20	Immunofluorescence staining
Ethylenediaminetetraacetic acid	SIGMA	E5134	Decalcification
Evoked Response Amplifier, ERS100C	BIOPAC		For auditory brainstem response
Formaldehyde	APLHA	F030410	Fixation of cochlear
High Performance Data Acquisition System, MP160	BIOPAC		For auditory brainstem response
Modular Extension Cable, MEC110C	BIOPAC		For auditory brainstem response
Myo7A primary antibody	Proteus	25-6790	Immunofluorescence staining
Myo7A secondary antibody	Jackson immunoresearch	711-545-152	Immunofluorescence staining
Needle Electrode, Unipolar 12 mmTp, EL452	BIOPAC		For auditory brainstem response
phalloidin antibody	Alexa Fluor	A12381	Immunofluorescence staining
phosphate-buffered saline	SIGMA	P4417
Rat trap cage			14 cm x 17 cm x 24cm
ROMPUN- xylazine injection, solution	Bayer HealthCare, LLC
Sound amplifier, MT-1000	unika		For noise exposure
Sound generator/analyzer/miscellaneous, FW-02	CLIO	620300719	For noise exposure
Soundproof chamber	IEA Electro-Acoustic Technology		For noise exposure and ABR
Speaker	IEA Electro-Acoustic Technology		For noise exposure
Stimulator Module, STM100C	BIOPAC		For auditory brainstem response
Triton X-100	SIGMA	T8787	Immunofluorescence staining
Tubephone Set, OUT101	BIOPAC		For auditory brainstem response
Upright Microscope, BX53	Olympus		Image acquisition
Zoletil	Virbac