АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для мышиной модели потери слуха, вызванной шумом (NIHL). Чтобы вызвать NIHL, мы разработали новое и простое устройство с использованием гофрированного пластика, клетки-ловушки для крыс и динамика. Слуховой ответ ствола мозга и иммунофлуоресцентная визуализация были использованы для оценки слуховой функции и повреждения наружных волосковых клеток соответственно.

Аннотация

Модель потери слуха, вызванной шумом (NIHL) на животных, полезна патологоанатомам, терапевтам, фармакологам и исследователям слуха, чтобы досконально понять механизм NIHL и впоследствии оптимизировать соответствующие стратегии лечения. Это исследование направлено на создание улучшенного протокола для разработки мышиной модели NIHL. В этом исследовании были использованы самцы мышей C57BL/6J. Мышей без анестезии подвергали воздействию громких звуков (1 и 6 кГц, предъявляемых одновременно при 115-125 дБ SPL-A) непрерывно в течение 6 ч в сутки в течение 5 дней подряд. Слуховую функцию оценивали через 1 день и 1 неделю после воздействия шума с помощью слуховой реакции ствола мозга (ABR). После измерения ABR мышей приносили в жертву, а их кортиевские органы собирали для иммунофлуоресцентного окрашивания. По результатам измерений слуховой реакции ствола мозга (ABR) значительная потеря слуха наблюдалась через 1 день после воздействия шума. Через 1 неделю пороги слышимости подопытных мышей снизились до ~80 дБ SPL, что все еще было значительно выше, чем у контрольных мышей (~40 дБ SPL). По результатам иммунофлуоресцентной визуализации было показано, что наружные волосковые клетки (OHC) повреждены. Таким образом, мы создали модель NIHL на самцах мышей C57BL/6J. Было разработано и внедрено новое и простое устройство для генерации и передачи чистотонального шума. Количественные измерения порогов слышимости и морфологическое подтверждение повреждений OHC показали, что приложенный шум успешно индуцировал ожидаемую потерю слуха.

Введение

Около 1,3 миллиарда человек во всем мире страдают от потери слуха из-завоздействия шума1. В этом исследовании мы стремились установить четкий пошаговый процесс индуцирования и подтверждения потери слуха, вызванной шумом (NIHL). NIHL возникает в результате дегенерации/разрушения волосковых клеток (HC) и спиральных ганглиозных нейронов (SGN), повреждения стереоцилии HC и/или потери синапсов между внутренними HC улитки и SGN. Такие аномалии могут также вызывать шум в ушах и нарушение восприятия речи (особенно в сложной акустической среде), помимо NIHL. Социальные, психологические и когнитивные функции могут быть последовательно затронуты этими физиологическими недостатками 2,3,4,5,6.

В доклинических исследованиях на мышах, связанных с NIHL, наиболее популярными штаммами мышей являются CBA/CaJ 2,3,6,7 и C57BL/6 4,5,8. Кроме того, самцы мышей 3,4,7 используются чаще, чем самки, так как эстроген оказывает защитное действие на слух. Поэтому в этом исследовании мы использовали только самцов мышей9. Обратившись к литературе, в качестве частот прикладываемого шума мы выбрали 1 кГц и 6 кГц. Интенсивность подаваемого шума составляла от 115 дБ SPL-A (окружающего клетку) до 125 дБ SPL-A (в центре клетки). После непрерывного воздействия шума на подопытных мышей в течение 6 ч в день в течение 5 дней подряд оптимальное повышение порога слуха указывало на то, что у подопытных мышей была сформирована оптимальная степень NIHL. Операции по обращению с животными, построению экспериментальной установки и созданию шума четко описаны шаг за шагом в прилагаемом протоколе.

протокол

Эксперименты на животных в этом исследовании были одобрены Комитетом по уходу за животными Медицинского колледжа Маккея. Восьминедельные мыши-самцы C57BL/6J были приобретены в Национальном центре лабораторных животных (г. Нью-Тайбэй, Тайвань). Все мыши были выведены и размещены в соответствии со стандартным протоколом для животных.

1. Индукция NIHL у мышей

  1. Подготовьте клетку для подопытных мышей
    1. Для этого используйте клетку-ловушку для крыс размерами 14 см × 17 см × 24 см. Нарежьте четыре куска гофрированных пластиковых досок подходящих размеров, сделав так, чтобы они поместились в клетку (13 см × 23 см и 13 см × 16 см).
    2. Чтобы мыши не порезали лапы сетчатой сеткой, поместите две части на нижнюю и заднюю сторону соответственно. Расположите две другие части перпендикулярно друг другу, чтобы разделить пространство внутри клетки на четвертинки.
  2. Проводите это исследование в звуконепроницаемой коробке. Разместите динамик на расстоянии 8,5 см перед клеткой и поместите динамик и клетку в звуконепроницаемую коробку.
  3. Откройте прикладное программное обеспечение CLIO
  4. Наведите курсор на значок динамика, затем нажмите TwoSin. Введите и измените значение частоты 1 на 1000 Гц, частоты 2 на 6000 Гц и нажмите OK, чтобы начать воспроизведение звука.
  5. На вкладке Leq измените dBV на dBSPL. Установив время в интерфейсе программы, нажмите кнопку с зеленым треугольником, чтобы воспроизвести звук.
  6. Поместите микрофон перед динамиком на расстоянии 8,5 см, чтобы откалибровать уровень шума (см. Дополнительный файл 1). Отрегулируйте уровень шума до 125 дБ SPL-A и непрерывно контролируйте его в течение не менее 3 минут, чтобы убедиться, что уровень шума достаточно стабилен. Используйте генератор, анализатор и усилитель для создания и управления шумом. (Рисунок 1)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте этот шаг в звуконепроницаемом боксе, чтобы не повредить слух оператора.
  7. Поместите в клетку четырех самцов мышей C57BL/6J (по одной на каждую четверть) для воздействия шума. Случайным образом распределите мышей в каждой четверти во время воздействия шума. Поместите микрофон в верхнюю часть клетки, чтобы контролировать уровень шума во время воздействия шума (Рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте этот шаг в звуконепроницаемом боксе, чтобы не повредить слух оператора.
  8. Подвергайте мышей воздействию шума на частотах 1 кГц и 6 кГц непрерывно в течение 6 ч в день в течение 5 дней подряд.
  9. Измерьте пороги слышимости мышей через 1 день после воздействия шума (т.е. на 6-й день), измерив ABR. Повторите эти измерения ABR снова через 1 неделю после воздействия шума (т.е. на13-й день). После измерений ABR принесите в жертву всех задействованных мышей и соберите их улитки (рис. 3).

2. Оценка порога слышимости на основе слуховой реакции ствола мозга (ABR)

  1. Используйте коммерческую систему тестирования ABR, специально разработанную для мелких животных10.
  2. Внутрибрюшинно вводят мышам смесь тилетамина и золазепама (40 мг/кг) и ксилазина (9,3 мг/кг) для общей анестезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка ABR занимает ~2 часа. Обязательно обеспечьте тепловую поддержку с помощью грелки и нанесите мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость, пока мышь находится под наркозом.
  3. Измерьте ABR у мыши под общим наркозом. Поместите подкожные игольчатые электроды (12 мм) в макушку, за ушной раковиной левого уха и обратно возле хвоста, чтобы измерить порог слышимости.
  4. Предъявляйте акустические стимулы с помощью динамика, расположенного на расстоянии 1 см от левого уха животного.
  5. Используйте осциллограф для контроля акустических раздражителей. Выберите синусоиду для стимулов и 10 k для оконной шкалы. Поверните ручку частоты, чтобы получить желаемую частоту акустических стимулов.
  6. Отрегулируйте интенсивность стимула, повернув ручку AMLP на генераторе функций. Добейтесь желаемой интенсивности стимула, повернув ручку AMLP на подходящее напряжение, рассчитанное по калибровке.
  7. Соберите измерения ABR при серии интенсивностей стимула, от 10 дБ SPL до 100 дБ SPL, с шагом 10 дБ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте порог слышимости в звуконепроницаемой коробке. Минимальным уровнем интенсивности стимула, который мог бы привести к возникновению различимой волны V в собранном сигнале, был принят порог ABR10,11 (рис. 4). После оценки ABR наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не оправится от анестезии (~1 ч).

3. Микроскопическое исследование

  1. Фиксация заготовленной ткани
    1. После измерений ABR пожертвуйте мышь, внутрибрюшинно введя смесь тилетамина и золазепама (100 мг/кг) и ксилазина (23,25 мг/кг) для микроскопического исследования.
    2. Соберите улитки у мышей и сразу же погрузите их в 10% формальдегид (FA) для фиксации (две улитки/мл) не менее чем на 8 ч при 4 °C.
    3. После фиксации раствор ЖК заменить 10% раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) для декальцификации в течение 3-4 дней при 4 °С. Затем проверьте каждую улитку пинцетом, чтобы убедиться, что улитки достаточно размягчены.
    4. Поместите улитки в чашку Петри, наполненную фосфатно-солевым буфером (PBS), и разрежьте спиралевидный орган корти (OC) (каждую декальцинированную улитку) на три части — базальный поворот, средний поворот и апикальный поворот — для окрашивания тканей.
    5. Под препарирующим микроскопом (увеличение: 8x-35x) удаляют костные структуры (scala vestibuli, scala tympani и modiolus) декальцинированных улиток и получают мягкие ткани, включая OC (толщина: около 40 мкм).
  2. Иммунофлуоресцентное окрашивание улитки
    1. Приготовление блокирующего буфера: Приготовить 2% бычий сывороточный альбумин (БСА) и 0,2% раствор Тритона Х-100 в ПБС.
    2. Переложите окрашиваемую ткань из чашки Петри в микроцентрифужную пробирку и погрузите ткань в 0,1 мл блокирующего буфера на 2 ч при комнатной температуре (RT).
    3. Приготовление буфера первичных антител Myo7A: Разбавьте первичное антитело Myo7A в блокирующем буфере в объемном соотношении 1:200.
    4. Обработайте ткань в пробирке микроцентрифуги 100 мкл буфера первичных антител Myo7A в течение 2 ч при ЛТ.
    5. Трижды промойте салфетку в ПБС по 5 минут каждый.
    6. Приготовление вторичного антитела Myo7A (Myo7A-Rb-488) и буфера к фаллоидину (фаллоидин-594): Разбавьте вторичные антитела Myo7A (1:400) и антитела к фаллоидину (1:200) в блокирующем буфере.
    7. Обработайте ткань 100 мкл вторичного антитела Myo7A и буфера антител к фаллоидину в течение 2 ч при ЛТ.
    8. После лечения антителами + антителами к фаллоидину промыть ткань в PBS три раза, по 5 мин каждый.
    9. Перенесите промытую ткань из пробирки микроцентрифуги в чашку Петри, наполненную PBS, с помощью пластиковой трансферной пипетки объемом 1 мл с обрезанным наконечником.
    10. Чтобы подготовиться к микроскопическому исследованию, разверните ткань, поместите ее на предметное стекло и добавьте 15 мкл фторомонтной среды 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) на ткань, чтобы полностью покрыть ее. Аккуратно положите стеклянный покровный листок на салфетку. Оставьте предметное стекло на ночь в RT, прежде чем запечатать его лаком для ногтей.
  3. Получение изображений
    1. Получение 2D-изображений с помощью вертикального флуоресцентного микроскопа и программного обеспечения для получения изображений.
    2. Перед проведением микроскопического исследования центрируйте ткань в поле зрения и отрегулируйте чувствительность до ISO 100. Сначала отрегулируйте время экспозиции, нажав кнопку « Автоматический режим » в программном обеспечении, а затем выполните точную настройку вручную, нажав кнопку «Настройка », чтобы оптимизировать соотношение сигнал/шум.
    3. Отрегулируйте длину волны падающего света, чтобы возбудить флуорофоры, вращая куб флуоресценции. Псевдоцвета использовались для обозначения излучения от различных флуоресцентных меток (синий свет: DAPI; зеленый свет: Myo7A; красный свет: фаллоидин).
    4. Сканируя образец ткани, генерируйте и собирайте данные визуализации в виде файлов изображений в форматах .tif и .jpg.

Результаты

Изменение порога слышимости ABR
Порог слышимости мышей измеряли с помощью тонального всплеска ABR через 1 день или 1 неделю после воздействия шума. Наблюдалось значительное повышение порога слышимости на всех трех исследуемых частотах (12 кГц: 84,29 ± 2,77 дБ SPL; 24 кГц: 91,43 ± 0,92 дБ SPL; 32 к?...

Обсуждение

NIHL можно разделить на два типа: временный NIHL, который показывает временное смещение порога слышимости, и постоянный NIHL, который характеризуется постоянным сдвигом порога слышимости. Считается, что потеря слуха, которую мы наблюдали на6-й день (1 день после воздействия шума), являет?...

Раскрытие информации

Отсутствие конфликта интересов, подлежащего раскрытию.

Благодарности

Мы благодарим гранты Министерства науки и технологий (MOST) правительства Тайваня (MOST 110-2314-B-715-005, MOST 111-2314-B-715-009-MY3) и гранты на проведение исследований от Медицинского колледжа Маккея (MMC-RD-110-1B-P030, MMC-RD-111-CF-G002-03).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
 1/4" CCP Free-field Standard Microphone SetGRAS428158For noise exposure
Amplifier Input Module, AMI100DBIOPACFor auditory brainstem response
Bio-amplifier, BIO100CBIOPACFor auditory brainstem response
Bovine Serum AlbuminSIGMAA9647Immunofluorescence staining
Cellsens softwareOlympus life scienceImage acquisition
Corrugated plastic
DAPI fluoromountSouthernBiotech0100-20Immunofluorescence staining
Ethylenediaminetetraacetic acidSIGMAE5134Decalcification
Evoked Response Amplifier, ERS100CBIOPACFor auditory brainstem response
FormaldehydeAPLHAF030410Fixation of cochlear
High Performance Data Acquisition System, MP160BIOPACFor auditory brainstem response
Modular Extension Cable, MEC110CBIOPACFor auditory brainstem response
Myo7A primary antibodyProteus25-6790Immunofluorescence staining
Myo7A secondary antibodyJackson immunoresearch711-545-152Immunofluorescence staining
Needle Electrode, Unipolar 12 mmTp, EL452BIOPACFor auditory brainstem response
phalloidin antibodyAlexa FluorA12381Immunofluorescence staining
phosphate-buffered salineSIGMAP4417
Rat trap cage14 cm x 17 cm x 24cm
ROMPUN- xylazine injection, solution Bayer HealthCare, LLC
Sound amplifier, MT-1000unikaFor noise exposure
Sound generator/analyzer/miscellaneous, FW-02CLIO620300719For noise exposure
Soundproof chamberIEA Electro-Acoustic TechnologyFor noise exposure and ABR
Speaker IEA Electro-Acoustic TechnologyFor noise exposure
Stimulator Module, STM100CBIOPACFor auditory brainstem response
Triton X-100SIGMAT8787Immunofluorescence staining
Tubephone Set, OUT101BIOPACFor auditory brainstem response
Upright Microscope, BX53OlympusImage acquisition
ZoletilVirbac

Ссылки

  1. World Report on Hearing. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481 (2021)
  2. Fernandez, K. A., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy with and without sensory cell loss. Neuroscience. 427, 43-57 (2020).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. The Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  4. Wang, J., et al. Overexpression of X-linked inhibitor of apoptosis protein protects against noise-induced hearing loss in mice. Gene Therapy. 18 (6), 560-568 (2011).
  5. Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of aging and noise exposure on auditory brainstem responses and number of presynaptic ribbons in inner hair cells of C57BL/6J mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
  6. Rouse, S. L., Matthews, I. R., Li, J., Sherr, E. H., Chan, D. K. Integrated stress response inhibition provides sex-dependent protection against noise-induced cochlear synaptopathy. Scientific Reports. 10 (1), 18063 (2020).
  7. Amanipour, R. M., et al. Noise-induced hearing loss in mice: Effects of high and low levels of noise trauma in CBA mice. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2018, 1210-1213 (2018).
  8. Edderkaoui, B., Sargsyan, L., Hetrick, A., Li, H. Deficiency of duffy antigen receptor for chemokines ameliorated cochlear damage from noise exposure. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 173 (2018).
  9. Hultcrantz, M., Simonoska, R., Stenberg, A. E. Estrogen and hearing: a summary of recent investigations. Acta Oto-laryngologica. 126 (1), 10-14 (2006).
  10. Tsai, S. C. -. S., et al. The intravenous administration of skin-derived mesenchymal stem cells ameliorates hearing loss and preserves cochlear hair cells in cisplatin-injected mice: SMSCs ameliorate hearing loss and preserve outer hair cells in mice. Hearing Research. 413, 108254 (2022).
  11. Choi, M. Y., Yeo, S. W., Park, K. H. Hearing restoration in a deaf animal model with intravenous transplantation of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood. Biochemical and Biophysical Research Communications. 427 (3), 629-636 (2012).
  12. Yu, S. -. K., et al. Morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (147), e59189 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены