JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم البروتوكول طرقا مفصلة لتقييم ما إذا كان المستحلب النانوي ophiopogonin D المساعد يعزز الاستجابات المناعية الخلوية الفعالة.

Abstract

كمكون رئيسي للقاحات ، يمكن للمواد المساعدة أن تحفز أو تعزز بشكل مباشر الاستجابات المناعية القوية والواسعة الانتشار والفطرية والتكيفية المرتبطة بالمستضدات. تم العثور على Ophiopogonin D (OP-D) ، وهو مكون منقى مستخرج من نبات Ophiopogon japonicus ، ليكون مفيدا كمساعد للقاح. يمكن التغلب على مشاكل الذوبان المنخفض والسمية ل OP-D بشكل فعال باستخدام طريقة استحلاب منخفضة الطاقة لإعداد المستحلب النانوي ophiopogonin D (NOD). في هذه المقالة ، يتم فحص سلسلة من البروتوكولات في المختبر لتقييم النشاط الخلوي. تم تحديد التأثيرات السامة للخلايا ل L929 باستخدام مقايسة مجموعة عد الخلايا -8. بعد ذلك ، تم الكشف عن مستويات السيتوكين المفرزة وأرقام الخلايا المناعية المقابلة بعد تحفيز وثقافة الخلايا الطحالية من الفئران المحصنة بواسطة طرق ELISA و ELISpot. بالإضافة إلى ذلك ، تمت ملاحظة قدرة امتصاص المستضد في الخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع العظم (BMDCs) ، والتي تم عزلها من الفئران C57BL / 6 ونضجت بعد الحضانة باستخدام GM-CSF بالإضافة إلى IL-4 ، بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر بالمسح بالليزر (CLSM). الأهم من ذلك ، تم تأكيد تنشيط البلاعم من خلال قياس مستويات السيتوكينات IL-1β و IL-6 وعامل نخر الورم ألفا (TNF-α) بواسطة مجموعات ELISA بعد استزراع البلاعم البريتونية (PMs) من الفئران الفارغة مع المساعد لمدة 24 ساعة. ومن المأمول أن يزود هذا البروتوكول الباحثين الآخرين بمناهج تجريبية مباشرة وفعالة لتقييم كفاءة الاستجابة الخلوية للمواد المساعدة الجديدة للقاحات.

Introduction

اللقاحات وسيلة مهمة للوقاية من الأمراض المعدية وغير السارية وعلاجها. تعد الإضافة المناسبة للمواد المساعدة ووسائل التوصيل إلى تركيبات اللقاح مفيدة لتعزيز مناعة المستضدات وتوليد استجابات مناعية طويلة الأمد1. بالإضافة إلى الشب المساعد الكلاسيكي (ملح الألومنيوم) ، هناك ستة أنواع من المواد المساعدة للقاحات التي يتم تسويقها حاليا: MF59 2,3 و AS04 3 و AS03 3 و AS01 3 و CpG1018 4 و Matrix-M5. بشكل عام ، عندما يواجه جسم الإنسان هجوما فيروسيا ، فإن خطي الدفاع الأول والثاني (الجلد والغشاء المخاطي والبلاعم) يأخذان زمام المبادرة في إزالة الفيروس ، وأخيرا ، يتم تنشيط خط الدفاع الثالث ، الذي يشمل الأعضاء المناعية والخلايا المناعية. كانت أملاح الألومنيوم والألمنيوم أكثر المواد المساعدة استخداما على نطاق واسع للقاحات البشرية منذ أوائل 1920s ، مما أثار استجابة مناعية فطرية فعالة6. ومع ذلك ، فقد اقترح أن تنشيط الخلايا المقدمة للمستضد (APCs) بواسطة المواد المساعدة الكلاسيكية ، والتي تحفز الخلايا المناعية على توليد مجموعات محددة من السيتوكينات والكيموكينات ، هي الآلية التي تعمل بها المواد المساعدة وقد تكون أحد الأسباب التي تجعل المواد المساعدة تمارس تأثيرات عابرة فقط على استجابات مناعية محددة7. يعد وجود مواد مساعدة مرخصة محدودة للاستخدام البشري عاملا مقيدا لتطوير اللقاحات التي تثير استجابات مناعية فعالة8.

حاليا ، يظهر عدد متزايد من الدراسات المساعدة القدرة على إحداث استجابة مناعية خلوية قوية في الفئران. لقد ثبت أن QS-21 يحفز استجابة مناعية متوازنة T-helper 1 (Th1) و T-helper 2 (Th2) ، وينتج مستويات أعلى من عيار الأجسام المضادة ، ويطيل الحماية كمساعد ، لكن سميته القوية وخصائصه الانحلالية تحد من تطوره كمساعد سريري مستقل 9,10. OP-D (روسجوجينين-O-α-L-rhamnopyranosy1- (1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-fucopyranoside) هو أحد الصابونين الستيرويدية المعزولة من جذر النبات الطبي الصيني Ophiopogon japonicas4. بالإضافة إلى ذلك ، فهو المكون الرئيسي النشط دوائيا (شين ماي سان) الموجود في Radix Ophiopogonis ومن المعروف أن له خصائص دوائية معينة11. علاوة على ذلك ، فهو عضو في عائلة Liliaceae ويستخدم على نطاق واسع لآثاره المثبطة والوقائية في التهاب الخلايا وإصابة عضلة القلب. على سبيل المثال ، يحسن OP-D الآفات الشبيهة بالتهاب الجلد التأتبي الناجم عن DNCB وعامل نخر الورم ألفا (TNF-α) خلايا HaCaT الالتهابية في الفئران BALB / c12. الأهم من ذلك ، يعزز OP-D الحماية المضادة للأكسدة لنظام القلب والأوعية الدموية ويحمي القلب من إصابة الالتهام الذاتي التي يسببها دوكسوروبيسين عن طريق تقليل كل من توليد أنواع الأكسجين التفاعلية وتعطيل تلف غشاء الميتوكوندريا. أظهرت التجارب أن تناول OP-D مع أحادي ديسموسيد يساعد على تعزيز صحة المناعة ، وزيادة عدد خلايا الدم البيضاء وتخليق الحمض النووي ، وجعل الأجسام المضادة تدوم لفترة أطول13. وقد وجد سابقا أن OP-D له تأثير مساعد14.

المستحلبات النانوية عبارة عن تركيبات نانوية من الزيت في الماء تتكون من مزيج من المواد الخافضة للتوتر السطحي والزيت والمواد الخافضة للتوتر السطحي والماء12,15. تسمح تصميمات اللقاحات النانوية هذه بتغليف المستضدات والمواد المساعدة معا لتعزيز التحفيز المناعي وحماية المستضدات وتعزيز نضوج الخلايا المتغصنة (DC)16. لتطوير هذه المواد المساعدة الجديدة التي تم الحصول عليها من الفحص ، من المهم إيجاد طرق مناسبة لتقييم قدرات الاستجابة الخلوية الخاصة بهم.

الغرض من هذا البروتوكول هو التقييم المنهجي لما إذا كانت المواد المساعدة يمكن أن تعزز البلعمة والتعبير عن الخلايا المناعية في زراعة الخلايا في المختبر وتوضيح الطرق التجريبية الرئيسية. تنقسم التجربة إلى أربعة أقسام فرعية: (1) يتم تحديد سمية OP-D و NOD لخلايا L929 بواسطة فحص مجموعة عد الخلايا -8 (CCK-8) ؛ (2) يتم الكشف عن مستويات السيتوكين في الغدد الصماء IFN-γ و IL-17A وأرقام الخلايا المقابلة في الفئران المحصنة عن طريق تحفيز الخلايا الطحالية ومقايسات ELISpot ؛ (3) لوحظت قدرة عرض المستضد ل DCs بعد التحفيز المساعد باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر ؛ و (4) تم الكشف عن الأنواع الثلاثة من السيتوكينات ، IL-1β و IL-6 و TNF-α ، في المواد الطافية التي تم الحصول عليها من الضامة البريتونية (PMs) في الفئران الطبيعية المستزرعة مع المواد المساعدة.

Protocol

تم إجراء جميع تجارب الخلايا في مختبر هندسة الخلايا المجهز بغرف العمليات الأساسية والغرف العازلة وغرف الزراعة المعقمة وغرف تحديد الهوية والتحليل. كانت بيئة العمل وظروفه خالية من التلوث الميكروبي والعوامل الضارة الأخرى. أجريت التجارب على الحيوانات بناء على المبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية وأخلاقيات المختبر التابعة للجامعة الطبية العسكرية الثالثة.

1. التعقيم وإعداد المواد

  1. تحضير الكواشف والمواد الاستهلاكية ، مثل المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) ، والمقص ، والملقط ، والشبكة الكاشطة ، عن طريق التعقيم الحراري الرطب عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  2. للاطلاع على الكواشف والمعدات المطلوبة، انظر جدول المواد. للحصول على صيغة المستحلب النانوي الفارغ (BNE) ، تحقق من الجدول 1.

2. مقايسة السمية الخلوية L929

  1. قم بتشغيل حمام الماء واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية. اجمع أنبوبا واحدا من خلايا L929 المجمدة من النيتروجين السائل وقم بإذابته بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
  2. ماصة الخلايا في أنبوب طرد مركزي معقم 15 مل بسرعة بعد ذوبان الجليد ، أضف 2 مل من DMEM ، واخلطها جيدا.
  3. جهاز طرد مركزي للعينات عند 129 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية. ثم أضف 2 مل من DMEM لإعادة تعليق الخلايا ، وطرد العينات مرة أخرى عند 129 × جم لمدة 5 دقائق.
  4. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 6 مل من وسيط DMEM الكامل (يحتوي على 10٪ FBS) للتعليق ، وانقله إلى قارورة استزراع T25 في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 للثقافة لمدة 48 ساعة.
  5. تخلص من وسط الاستزراع في قارورة الثقافة واغسل الخلايا مرتين باستخدام 2 مل من PBS. ثم أضف 1 مل من 0.25٪ تربسين لهضم الخلايا لمدة 1-2 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  6. عند ملاحظة تقريب الخلايا ، أضف 4 مل من وسط DMEM الكامل لإنهاء عملية الهضم على الفور واخلطها جيدا. بعد ذلك ، قم بشفط الخلايا في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي بسرعة 129 × جم لمدة 5 دقائق.
  7. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسط DMEM الكامل. استخدم معلق خلية 20 ميكرولتر لعد الخلايا باستخدام لوحات عد الخلايا وقم بتخفيف الخلايا المتبقية إلى 1 × 105 خلايا / مل باستخدام وسيط DMEM الكامل.
  8. أضف 100 ميكرولتر من الماء عالي النقاء إلى محيط لوحة 96 بئرا وأضف 100 ميكرولتر من مخفف الخلايا إلى الآبار الداخلية فقط. ضع اللوحة في الحاضنة للثقافة الملتصقة لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.
  9. بعد الالتصاق الخلايا ، أضف OP-D و NOD بشكل منفصل في وسط DMEM الكامل إلى الحجم النهائي 200 ميكرولتر / بئر (التركيزات النهائية لكل دواء هي 480 ميكروغرام / مل ، 240 ميكروغرام / مل ، 120 ميكروغرام / مل ، 60 ميكروغرام / مل ، و 30 ميكروغرام / مل). لكل تركيز ، استخدم ثلاثة آبار كتكرارات. ثم ، ضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة والثقافة لمدة 24 ساعة أخرى.
  10. قم بتخفيف CCK-8 إلى 10٪ باستخدام وسيط DMEM الكامل وأضف 100 ميكرولتر / تخفيفات بئر تحتوي على المحاليل المساعدة والخلوية إلى لوحة 96 بئرا. ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة واحتضانها لمدة 2-3 ساعات أخرى.
  11. تخلط بشكل متكرر أثناء طلاء محلول الخلية لمنع عدم التجانس بسبب ترسيب الخلايا. هز اللوحة برفق عدة مرات قبل وبعد إضافة CCK-8 لخلط الوسط ومحلول CCK-8 جيدا.
  12. قم بقياس الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة. قم بإعداد بئر تصفير بمتوسط فقط و CCK-8 للحصول على قيمة امتصاص خط الأساس. احسب قيم الامتصاص الدقيقة عن طريق طرح قيمة الامتصاص الصفرية من قيمة الامتصاص التي تم الحصول عليها عند الرسم.
  13. تأكد من عدم وجود فقاعات في أي آبار قبل الاختبار باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة لأن الفقاعات ستتداخل مع الفحص.

3. تحفيز الطحال

  1. تحصين الفئران BALB / c الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع مع 30 ميكروغرام من مستضد البروتين بالإضافة إلى 30 ميكروغرام من المواد المساعدة عن طريق الحقن العضلي (200 ميكرولتر) في اليوم 0 واليوم 7 واليوم 14 وفقا للمجموعات التجريبية التالية: (1) مجموعة PBS ، (2) مجموعة المستضد (Ag) ، (3) مجموعة المستضد + OP-D (Ag / OP-D) ، (4) مجموعة المستضد + BNE (AG / BNE) ، (5) مجموعة المستضد + NOD (Ag / NOD) ، ومجموعة (6) المستضد + AlPO4 (Ag / Al).
  2. غرفة التحضير: في اليوم 24 بعد التمنيع الأولي، أخرج الفئران من غرفة الحيوانات وقتل رحيما بها عن طريق حقن داخل الصفاق من 100 ملغم/كغ من بنتوباربيتال الصوديوم 1٪. ضع الفئران في طبق زجاجي وانقعه في 75٪ كحول لمدة 5 دقائق.
  3. ضع أنابيب الطرد المركزي على رف أنبوب الطرد المركزي ، وقم بترقيم أطباق بتري التي تستخدم لمرة واحدة ، وأضف 5 مل من PBS إلى كل طبق بتري مع ماصة 10 مل.
  4. قم بعمل شق 6-8 سم بمقص في منتصف الجانب البطني الأيسر من الفأر ، وافتح الجلد ، وكشف جدار البطن ، وحدد موقع الشريط الأحمر الطويل للطحال.
  5. ارفع الصفاق على الجانب السفلي من الطحال بالملقط ، واقطعه مفتوحا ، وقم بتحويله لأعلى لفضح الطحال. ارفع الطحال بالملقط ، وافصل النسيج الضام أسفل الطحال بمقص العيون ، وقم بإزالة الطحال.
  6. ضع الطحال في طبق بتري يحتوي على 5 مل من PBS وطاحونة مع غربال (200 شبكة ، 70 ميكرومتر) وشريط طحن. بعد الطحن ، انقل السائل إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل باستخدام قطارة الكوع وفقا للترقيم.
  7. الطرد المركزي السائل في 453 × ز لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 3 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء إلى كل أنبوب ، وأعد تعليق الخلايا ، وقم بتحليلها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  8. أضف 10-12 مل من PBS إلى كل أنبوب ، وامزج الأنبوب رأسا على عقب ، وأجهزة الطرد المركزي بسرعة 453 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 10 مل من PBS إلى كل أنبوب طرد مركزي ، وأعد تعليق الخلايا.
  9. خذ 20 ميكرولتر من كل عينة في بئر من لوحة عد الخلايا وسجل عدد الخلايا الحية باستخدام عداد الخلايا الآلي.
  10. جهاز طرد مركزي للعينات عند 453 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا ، وقم بتخفيفها إلى 2.5 × 106 خلايا / مل باستخدام وسيط RF-10 (معلومات التركيب في الجدول 2) ، وأضفها إلى لوحة 96 بئرا عند 100 ميكرولتر / بئر.
  11. قم بتخفيف المستضد باستخدام RF-10 متوسط إلى 10 ميكروغرام / مل ، وأضف 100 ميكرولتر إلى كل بئر ، واحتضانه لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.
  12. نضح تعليق الخلية التي تم الحصول عليها من كل مجموعة من الخلايا في أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل ، وأجهزة الطرد المركزي في 453 × ز لمدة 20 دقيقة ، واستنشاق الطافي في أنبوب طرد مركزي نظيف.
  13. قم بإجراء الكشف عن محتوى IFN-γ و IL-17A بدقة وفقا لتعليمات مجموعة ELISA. الأساليب والإجراءات هي كما يلي.
  14. قم بإعداد محلول عمل المخزن المؤقت للغسيل 1x (متوفر مع المجموعة) ، محلول تركيز التدرج القياسي (محلول السيتوكين القياسي المخفف إلى 500 بيكوغرام / مل ، 250 بيكوغرام / مل ، 125 بيكوغرام / مل ، 62.5 بيكوغرام / مل ، 31.3 بيكوغرام / مل ، و 15.6 بيكوغرام / مل في المخزن المؤقت للتخفيف R [1x] المقدم مع المجموعة) ، محلول عمل الأجسام المضادة البيوتينيل (محلول الأجسام المضادة المخفف للبيوتينيل إلى 1: 100 باستخدام المخزن المؤقت للتخفيف R [1x] المقدم مع المجموعة لتشكيل حل العمل) ، وحل عمل ستربتافيدين HRP حسب الحاجة.
  15. أضف 100 ميكرولتر / بئر من محلول السيتوكين القياسي المخفف إلى البئر القياسي ، و 100 ميكرولتر / بئر من العينة في بئر العينة (يتم استخدام مخزن التخفيف R [1x] المقدم مع المجموعة لتخفيف العينة) ، و 100 ميكرولتر / بئر من محلول التخفيف R (1x) في بئر التحكم الفارغ.
  16. أضف محلول عمل الأجسام المضادة البيوتينيل عند 50 ميكرولتر / بئر. تخلط جيدا ، وتغطى بغشاء مانع للتسرب ، وتحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
  17. قم بإزالة السائل من الآبار وأضف 1x محلول عمل عازلة للغسيل عند 300 ميكرولتر / بئر. تخلص من السائل من الآبار بعد 1 دقيقة. كرر هذه العملية 4x للسماح للسائل أن يجف على ورق الترشيح في كل مرة.
  18. أضف 100 ميكرولتر / بئر من محلول عمل الستربتافيدين HRP. قم بتغطية العينات واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. جهاز طرد مركزي للعينات عند 453 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية.
    ملاحظة: يجب التربيت على محلول الغسيل المتبقي في بئر التفاعل أثناء عملية الغسيل جيدا حتى لا يمكن رؤية علامة مائية على ورق الترشيح.
  19. أضف TMB عند 100 ميكرولتر / بئر ، واحتضن الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 5-30 دقيقة في الظلام ، واحكم على تفاعل الإنهاء وفقا لعمق اللون في البئر (الأزرق الداكن). عادة ، 10-20 دقيقة لتطوير اللون يمكن أن تحقق نتائج جيدة.
  20. قم بإنهاء التفاعل بسرعة عن طريق إضافة محلول التوقف عند 100 ميكرولتر / بئر. كشف قيمة الامتصاص عند 450 نانومتر في غضون 10 دقائق بعد الإنهاء.
    ملاحظة: قم بموازنة الكاشف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.

4. مقايسة إليسبوت

  1. إجراء تحصين الفئران وجمع خلايا الطحال تماما كما هو موضح في الخطوات 3.1-3.10 أعلاه. قم بإجراء فحوصات IFN-γ و IL-17A بما يتفق بدقة مع تعليمات المجموعة. الأساليب والإجراءات هي كما يلي.
  2. قم بإزالة اللوحة من العبوة المختومة ، واغسل 4x باستخدام PBS معقم (200 ميكرولتر / بئر) ، وأضف 1640 وسط استزراع كامل (200 ميكرولتر / بئر) لموازنته في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
  3. قم بإزالة الوسط وقم بتخفيف تعليق الخلايا الطحالية باستخدام RF-10 medium إلى 2 × 105 خلايا / مل ، مع إضافة 50 ميكرولتر من الخلايا والمستضد لكل بئر (التركيز النهائي: 10 ميكروغرام / مل).
  4. ضع الطبق في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة. لا تحرك اللوحة خلال هذا الوقت ، واتخذ تدابير لتجنب التبخر (على سبيل المثال ، لف اللوحة بورق الألمنيوم).
  5. قم بتخفيف الجسم المضاد للكشف (BVD6-24G2-biotin) إلى 1 ميكروغرام / مل (1: 1000) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (0.5 مل: 100 مل) يحتوي على 0.5٪ مصل بقري جنيني (PBS-0.5٪ FBS). أضف 100 ميكرولتر / بئر إلى اللوحة ، واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة بعد الترشيح من خلال غشاء 0.22 ميكرومتر.
  6. صب السائل في الآبار ، وأضف 1x عازلة للغسيل عند 200 ميكرولتر / بئر ، واغسل 5x. اتركيه لمدة 30-60 ثانية في كل مرة ، وللمرة الأخيرة ، اتركه يجف على ورق النشاف.
  7. خفف البيروكسيديز الستربتافيدين والفجل (1: 1000) في PBS-0.5٪ FBS وأضف 100 ميكرولتر / بئر. احتضان لوحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الطبق كما في الخطوة 4.6.
  8. أضف 100 ميكرولتر / بئر من محلول ركيزة TMB الجاهز للاستخدام وقم بتطويره حتى تظهر بقعة واضحة. أوقف تطور اللون عن طريق غسله على نطاق واسع في ماء منزوع الأيونات (شطف 5x-6x بشكل متكرر). إذا لزم الأمر ، قم بإزالة القناة (البلاستيك الناعم أسفل اللوحة) ، وشطف الجانب السفلي من الغشاء.
  9. افحص وعد البقع على قارئ ELISpot أو مجهر التشريح بعد جفاف اللوحة.

5. الاستيعاب من قبل البلدان النامية

  1. القتل الرحيم BALB / c الفئران العادية عن طريق حقن داخل الصفاق من 100 ملغ / كغ من 1 ٪ بنتوباربيتال الصوديوم. نقع الفئران في 75 ٪ الكحول لمدة 5 دقائق.
  2. قطع شق 6-8 سم أسفل بطن الفأر بالمقص ، وتثبيت طرفي الفتحة لفصلها في اتجاهات مختلفة وفضح أرجل الماوس. افصل عظم الفخذ عن جسم الفأر والساق عن المفصل ، وحافظ على العظام سليمة من كلا الطرفين.
  3. إزالة الأنسجة المتبقية والغضاريف من المفاصل المفصلية في طرفي عظم الفخذ مع مقص وملقط. نقع عظم الفخذ في الكحول 75 ٪ لمدة 5 دقائق ، ثم نقع في محلول PBS معقم لغسل الكحول السطحي.
  4. قطع نهايات عظم الفخذ بالمقص ، وشطف نخاع العظم في طبق بتري معقم بمحلول PBS معقم متبوعا بالشفط باستخدام حقنة 1 مل. كرر الغسيل 3x-5x.
  5. قم بالتصفية بواسطة غربال خلية (200 شبكة ، 70 ميكرومتر) وجمع BMDCs في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. أجهزة الطرد المركزي العينات في 290 × ز لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 4 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء ، وأعد الاستبدال ، وتحلل في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  6. أضف 10 مل من محلول PBS المعقم لتحييد المحللة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 290 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية.
  7. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من DMEM التي تحتوي على محلول بنسلين ستربتومايسين 1٪ و 10٪ FBS والعد. بعد ذلك ، أضف GM-CSF (20 نانوغرام / مل) بالإضافة إلى IL-4 (10 نانوغرام / مل) إلى الوسط ، واضبط تركيز الخلية على 5 × 105 / مل ، وقم بتلقيح الخلايا على أغطية الغطاء.
  8. أضف معلق الخلية إلى لوحة 6 آبار عند 2 مل / بئر ، وضع اللوحة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة. تغيير الوسط تماما بعد 2 أيام ، وتغيير نصف الوسط بعد 4 أيام.
  9. حدد خمسة آبار بها خلايا في حالة جيدة (خلايا كبيرة ومشعة مع نتوءات شجيرية على سطح الخلية) باستخدام مجهر مقلوب بتكبير 100x للتجربة في اليوم السابع من الثقافة. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 2 مل من محاليل GFP و OP-D + GFP و NOD + GFP المخففة بوسط DMEM الكامل (التركيز النهائي ل GFP: 20 ميكروغرام / مل ؛ التركيز النهائي المساعد: 10 ميكروغرام / مل) إلى كل بئر ، واحتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  10. اغسل الألواح 3x باستخدام PBS ، وأضف 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد إلى كل بئر ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة البارافورمالدهيد بعد التثبيت ، واحتضان الخلايا بالفالويدين و DAPI إلى تركيز نهائي يبلغ 10 ميكروغرام / مل لمدة 10 دقائق للتلطيخ ، ثم اغسل 3x باستخدام PBS.
  11. أضف 1 مل من PBS إلى كل بئر ، ولاحظ امتصاص المستضد باستخدام CLSM ، كما هو موضح أدناه.
    1. افتح برنامج CLSM ، وانقر فوق نظام ZEN ، وانتظر حتى تكتمل تهيئة الأجهزة.
    2. انقر فوق اختصارات GFP و DAPI في علامة تبويب تحديد الموقع للعثور على المنطقة التي يمكن ملاحظتها. أطفئ ضوء الفلورسنت والضوء المرسل.
    3. انقر فوق الإعداد الذكي في قائمة الاستحواذ لفتح مكتبة الأصباغ ، وإضافة ثلاثة أصباغ فلورية: EGFP و phalloidin و DAPI. انقر فوق أفضل إشارة > موافق. انقر فوق قناة EGFP في علامة تبويب القنوات وانقر فوق مباشر لتحديد مجال الرؤية الصحيح على الواجهة اليمنى.
    4. حدد 1 AU للثقب ، وقم بتدوير برغي التركيز الدقيق لضبط البعد البؤري ، وحدد المستوى البؤري المناسب. انقر فوق مؤشر النطاق واضبط مزيج طاقة الليزر والكسب الرئيسي بحيث تظهر النقاط الحمراء المتفرقة فقط على الصورة.
    5. اضبط قنوات phalloidin و DAPI بنفس المعلمات دون تغيير طاقة الليزر.
    6. حدد إيقاف البث المباشر وانقر على وضع الاستحواذ لتغيير معلمات التصوير: حجم الإطار: 1024 بكسل × 1024 بكسل ؛ سرعة المسح الضوئي: 7; المتوسط: 2x. انقر فوق Snap وحدد Split لعرض جميع الصور التي تم التقاطها. احفظ الصور.

6. تفعيل البلاعم

  1. اغمر فئران C57BL / 6 في 75٪ كحول بعد القتل الرحيم وضعها في طبق بتري زجاجي بترتيب مرقم.
  2. مرر الفئران عبر نافذة النقل إلى غرفة العمليات المعقمة وضعها على طاولة العمليات لمدة 5 دقائق.
  3. باستخدام حقنة ، استنشاق 10 مل من المحلول الملحي ، وإمالة الفئران لأسفل عند حوالي 45 درجة ، وحقنها في منتصف تجويف البطن. ارسم حوالي 5 مل من معلق الخلية في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل لكل 10 مل وكرر الحقن 3x.
  4. الطرد المركزي تعليق الخلية في 129 × ز لمدة 5 دقائق للحصول على الضامة الأولية البريتونية الفأر. أعد تعليق الخلايا ، واضبط تركيز الخلية على 2 × 106 خلايا / مل باستخدام وسيط RPMI 1640 الكامل (يحتوي على 10٪ FBS) ، وقم بتلقيح معلق الخلية في لوحة مكونة من 24 بئرا لضمان عدد ثابت من الخلايا لكل بئر (1 مل / بئر).
  5. الاستزراع عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 بين عشية وضحاها (حوالي 16-20 ساعة) ، تليها الحضانة مع PBS و Ag و Ag / OP-D و Ag / NOD و Ag / Al (التركيز النهائي Ag: 5 ميكروغرام / مل ؛ التركيز النهائي المساعد: 10 ميكروغرام / مل ؛ الحجم الكلي:2 مل) لمدة 24 ساعة. الكشف عن مستويات IL-1β و IL-6 و TNF-α في طاف الثقافة باستخدام مجموعات ELISA باستخدام الأساليب والإجراءات الموضحة في الخطوات 3.12-3.19.

النتائج

تم الانتهاء من تقييم النشاط الخلوي للمواد المساعدة OP-D و NOD في المختبر وفقا للبروتوكول. الخلايا الليفية L929 هي نموذج فحص مفيد لاختبار السمية في المختبر ل NOD (الشكل 1). يمكن أن يساعد القياس الكمي لمستويات السيتوكين الالتهابية في الطحال الباحثين على فهم الاستجابة المن?...

Discussion

توفر لقاحات الوحدات الفرعية أمانا ممتازا ولكنها ضعيفة المناعة. تتمثل الاستراتيجية الرئيسية لتعزيز الاستمناع في الامتزاز المادي أو إقران المستضدات بالمواد المساعدة ودمجها في أنظمة توصيل الأدوية لتعزيز امتصاص وعرض المستضدات النامية. الصابونين النباتي الطبيعي مثل quillaia saponin ومشتقاته شديد...

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه لا توجد مصالح مالية أو شخصية متنافسة يمكن أن تؤثر على العمل المذكور في هذه الورقة.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة بالمنحة رقم 2021YFC2302603 من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين ، والمنح رقم 31670938 ، و 32070924 ، و 82041045 ، و 32000651 من برنامج المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين ، والمنح رقم 2014jcyjA0107 ورقم 2019jcyjA-msxmx0159 من برنامج مشروع مؤسسة العلوم الطبيعية في تشونغتشينغ ، المنحة رقم. CYS21519 من مشروع أبحاث الدراسات العليا والابتكار في تشونغتشينغ ، المنحة رقم 2020XBK24 من المشاريع الخاصة بجامعة الجيش الطبية ، والمنحة رقم 202090031021 من البرنامج الوطني للابتكار وريادة الأعمال لطلاب الجامعات.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTA (1x)GIBCO, USA25200056
96-well filter platesMillipore. Billerica, MACLS3922
AlPO4General Chemical Company, USAnull
Automated Cell CounterCountstar, ChinaIC1000
BALB/c mice and C57BL/6 miceBeijing HFK Bioscience Co. Ltdnull
caprylic/capric triglyceride (GTCC)Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, Chinanull
CCK-8 kitsDojindo, JapanCK04
Cell Counting PlateCostar, Corning, USACO010101
Cell Sievebiosharp, ChinaBS-70-CS
Centrifuge 5810 REppendorf, Germany 5811000398
DAPISigma-Aldrich, St. Louis, USAD9542
DMEM basic(1x) mediumGIBCO, USAC11885500BT
DSZ5000X Inverted MicroscopeNikon,JapanDSZ5000X
EL-35 (Cremophor-35)Mumbai, Indianull
ELISpot classicAID, GermanyELR06
Fetal Bovine SerumGIBCO, USA10099141C
Full-function Microplate ReaderThermo Fisher Scientific, USAVL0000D2
GFPSigma-Aldrich, St. Louis, USAP42212
GlutamaxInvitrogen, USA35050061
Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating FactorGM-CSF, R&D Systems, USA315-03
HEPESInvitrogen, USA15630106
HF 90/240 IncubatorHeal Force, Switzerlandnull
IL-4PeproTech, USA042149
L929 cell lineFENGHUISHENGWU, China NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462)
Laser Scanning Confocal MicroscopyZeiss, GermanyLSM 980
MONTANE 85 PPISEPPIC, FranceL12910
MONTANOX 80 PPISEPPIC, France36372K
Mouse IFN-γ ELISA kitDakewe, China1210002
Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kitDakewe, ChinaDKW22-2000-096
Mouse IL-17A ELISA kitDakewe, China1211702
Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kitebiosciences, USA3521-4HPW-2
Mouse IL-1β ELISA kitDakewe, China1210122
Mouse IL-6 ELISA kitDakewe, China1210602
Mouse TNF-α ELISA kitDakewe, China1217202
Non-essential amino acids(100x)Invitrogen, USA11140050
Ophiopogonin-DChengdu Purui Technology Co. Ltd945619-74-9
Penicillin-Streptomycin SolutionInvitrogen, USA15070063
PhalloidinSolarbio, ChinaCA1620
Phosphate Buffered SalineZSGB-BIO, ChinaZLI-9062
Red Blood Cell Lysis BufferSolarbio, ChinaR1010
RPMI 1640 mediumHyclone (Life Technology), USASH30809.01
Sodium pyruvate(100 mM)Invitrogen, USA11360070
SqualeneSigma, USAS3626
β- MercaptoethanolInvitrogen, USA21985023

References

  1. Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
  2. Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
  3. Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
  4. Kuo, T. Y., et al. Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19. Scientific Reports. 10, 20085 (2020).
  5. Twentyman, E., et al. Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged >/=18 years - United States, July 2022. MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).
  6. Wang, Z., et al. Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens. ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).
  7. Wang, N., Chen, M., Wang, T. Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization. Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).
  8. Akin, I., et al. Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis. Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).
  9. Lacaille-Dubois, M. A. Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review. Phytomedicine. 60, 152905 (2019).
  10. Marty-Roix, R., et al. Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).
  11. Zhang, Y. Y., et al. Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).
  12. An, E. J., et al. Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).
  13. Song, X., et al. Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken. Pesquisa Veterinária Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).
  14. Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
  15. Lin, C. A., et al. Hyaluronic acid-glycine-cholesterol conjugate-based nanoemulsion as a potent vaccine adjuvant for T cell-mediated immunity. Pharmaceutics. 13 (10), 1569 (2021).
  16. Xu, H. H., et al. Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D' in vivo. Chinese Medicine. 16 (1), 3 (2021).
  17. Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines. Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).
  18. Rudolf, R., et al. Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite. Materials. 13 (12), 2717 (2020).
  19. Cannella, V., et al. Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line. BioMed Research International. 2019, 3469525 (2019).
  20. Jiao, G., et al. Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity. RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).
  21. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
  22. Li, W., Zhou, J., Xu, Y. Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices. Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).
  23. Wu, F., et al. Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury. Journal of Neuroimmunology. 344, 577264 (2020).
  24. Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. Structure and function of the immune system in the spleen. Science Immunology. 4 (33), (2019).
  25. Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay. Methods. 38 (4), 274-282 (2006).
  26. Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
  27. Zhou, Y., et al. CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis. Frontiers in Immunology. 13, 967410 (2022).
  28. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Frontiers in Bioscience. 13, 453-461 (2008).
  29. Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. Adjuvant activity on murine and human macrophages. Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved