JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול מציג שיטות מפורטות להערכה אם ננו-אמולסיה אופיופוגונין D אדג'ובנט מקדם תגובות חיסוניות תאיות יעילות.

Abstract

כמרכיב עיקרי בחיסונים, אדג'ובנטים יכולים לגרום או לשפר באופן ישיר את התגובות החיסוניות החזקות, הנפוצות, המולדות והנרכשות הקשורות לאנטיגנים. Epiopogonin D (OP-D), רכיב מטוהר המופק מהצמח Ophiopogon japonicus, נמצא שימושי כאדג'ובנט לחיסון. ניתן להתגבר ביעילות על הבעיות של המסיסות והרעילות הנמוכה של OP-D על ידי שימוש בשיטת תחליב באנרגיה נמוכה להכנת ננו-אמולסיה אופיופוגונין D (NOD). במאמר זה נבחנת סדרה של פרוטוקולים חוץ-גופיים להערכת פעילות תאית. ההשפעות הציטוטוקסיות של L929 נקבעו באמצעות בדיקת ערכת ספירת תאים-8. לאחר מכן, רמות הציטוקינים המופרשים ומספר תאי החיסון המתאימים לאחר הגירוי והתרבית של ספלנוציטים מעכברים מחוסנים זוהו בשיטות ELISA ו-ELISpot. בנוסף, יכולת ספיגת האנטיגן בתאים דנדריטיים שמקורם במח עצם (BMDCs), שבודדו מעכברי C57BL/6 והבשילו לאחר הדגירה עם GM-CSF בתוספת IL-4, נצפתה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית של סריקת לייזר (CLSM). חשוב לציין שהפעלת המקרופאגים אושרה על ידי מדידת הרמות של ציטוקינים מסוג IL-1β, IL-6 וגורם נמק הגידול אלפא (TNF-α) על ידי ערכות ELISA לאחר שקוקולט מקרופאגים פריטוניאליים (PMs) מעכברים ריקים עם האדג'ובנט במשך 24 שעות. התקווה היא שפרוטוקול זה יספק לחוקרים אחרים גישות ניסוייות ישירות ויעילות להערכת יעילות התגובה התאית של אדג'ובנטים חדשניים לחיסונים.

Introduction

חיסונים הם אמצעי חשוב למניעה וטיפול במחלות זיהומיות ולא קומוניקטיביות. התוספת המתאימה של אדג'ובנטים וכלי משלוח לפורמולציות חיסונים מועילה להגברת האימונוגניות של אנטיגנים וליצירת תגובות חיסוניות ארוכות טווח1. בנוסף לאלום האדג'ובנטי הקלאסי (מלח אלומיניום), ישנם שישה סוגים של אדג'ובנטים לחיסונים המשווקים כיום: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 ומטריצה-M5. בדרך כלל, כאשר גוף האדם נתקל בהתקפה ויראלית, קווי ההגנה הראשון והשני (עור, רירית ומקרופאגים) לוקחים את ההובלה בניקוי הנגיף, ולבסוף, קו ההגנה השלישי, הכולל את איברי החיסון ותאי החיסון, מופעל. מלחי אלומיניום ואלומיניום הם האדג'ובנטים הנפוצים ביותר לחיסונים אנושיים מאז תחילת שנות ה-20 של המאה ה-20, מה שמעורר תגובה חיסונית מולדת יעילה6. עם זאת, הוצע כי הפעלת תאים המציגים אנטיגן (APCs) על ידי אדג'ובנטים קלאסיים, אשר מגרה את תאי החיסון ליצור קבוצות ספציפיות של ציטוקינים וכמוקינים, היא המנגנון שבאמצעותו אדג'ובנטים פועלים ועשויה להיות אחת הסיבות לכך שאדג'ובנטים מפעילים רק השפעות חולפות על תגובות חיסוניות ספציפיות7. נוכחותם של אדג'ובנטים מורשים מוגבלים לשימוש אנושי היא גורם מגביל לפיתוח חיסונים המעוררים תגובות חיסוניות יעילות8.

כיום, מספר גדל והולך של מחקרים אדג'ובנטיים מדגימים את היכולת לגרום לתגובה חיסונית תאית חזקה בעכברים. הוכח כי QS-21 משרה תגובה חיסונית מאוזנת של T-helper 1 (Th1) ו-T-helper 2 (Th2), מייצר רמות גבוהות יותר של טיטרים של נוגדנים ומאריך את ההגנה כאדג'ובנט, אך רעילותו החזקה ותכונותיו ההמוליטיות מגבילות את התפתחותו כאדג'ובנט קליניעצמאי 9,10. OP-D (רוסקוגנין-O-α-L-ראמנופירנוזיל1-(1→2)-β-D-קסילופירנוזיל-(1→3)-β-D-fucopyranoside) הוא אחד הספונינים הסטרואידים שבודדו משורש צמח המרפא הסיני Ophiopogon japonicas4. בנוסף, זהו המרכיב הפרמקולוגי הפעיל העיקרי (שן מאי סאן) שנמצא ברדיקס אופיופוגוניס וידוע כבעל תכונות פרמקולוגיות מסוימות11. יתר על כן, הוא חבר במשפחת Liliaceae והוא נמצא בשימוש נרחב עבור ההשפעות המעכבות והמגינות שלו בדלקת תאית ופגיעה בשריר הלב. לדוגמה, OP-D משמיד נגעים דמויי אטופיק דרמטיטיס המושרים על-ידי DNCB ותאי HaCaT דלקתיים של גורם נמק הגידול אלפא (TNF-α) בעכברי BALB/c12. חשוב לציין כי OP-D מקדם את ההגנה נוגדת החמצון של מערכת הלב וכלי הדם ומגן על הלב מפני פגיעה אוטופגית הנגרמת על ידי דוקסורוביצין על ידי הפחתת ייצור מיני חמצן תגובתי ושיבוש הנזק לממברנה המיטוכונדריאלית. ניסויים הראו כי נטילת OP-D עם מונו-דסמוזיד עוזרת לשפר את בריאות מערכת החיסון, להגביר את ספירת תאי הדם הלבנים ואת סינתזת הדנ"א, ולגרום לנוגדנים להחזיק מעמד זמן רב יותר13. בעבר נמצא כי OP-D יש אפקט אדג'ובנטי14.

ננו-מולקולות הן ננו-מולקולות שמן במים המורכבות משילוב של חומרים פעילי שטח, נפט, חומרים פעילי שטח ומים12,15. עיצובים אלה של ננו-חיסונים מאפשרים לעטוף אנטיגנים ואדג'ובנטים יחד כדי להגביר את הגירוי החיסוני, להגן על האנטיגנים ולקדם התבגרות של תאים דנדריטיים (DC)16. לצורך פיתוח של אדג'ובנטים חדשניים אלה המתקבלים מהקרנה, חשוב למצוא שיטות מתאימות להערכת יכולות התגובה התאית שלהם.

מטרת פרוטוקול זה היא להעריך באופן שיטתי אם אדג'ובנטים יכולים לשפר את הפאגוציטוזה ואת הביטוי של תאי מערכת החיסון בתרבית תאים במבחנה ולפרט על שיטות הניסוי העיקריות. הניסוי מחולק לארבעה סעיפי משנה: (1) הרעילות של OP-D ו-NOD לתאי L929 נקבעת על ידי בדיקת ערכת ספירת התאים 8 (CCK-8); (2) רמות הציטוקינים של IFN-γ ו-IL-17A האנדוקריניים ומספרי התאים המתאימים בעכברים מחוסנים מזוהים על ידי גירוי ספלנוציטים ומבחני ELISpot; (3) יכולת הצגת האנטיגן של DCs לאחר גירוי אדג'ובנטי נצפית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית; ו-(4) מזוהים שלושת סוגי הציטוקינים, IL-1β, IL-6 ו-TNF-α, בסופרנטנטים המתקבלים ממקרופאגים של הצפק (PMs) בעכברים רגילים שעברו התרבות יחד עם אדג'ובנטים.

Protocol

כל הניסויים בתאים בוצעו במעבדה להנדסת תאים המצוידת בחדרי ניתוח בסיסיים, חדרי חיץ, חדרי תרבית סטרילית וחדרי זיהוי וניתוח. סביבת העבודה והתנאים היו נקיים מזיהום מיקרוביאלי וגורמים מזיקים אחרים. הניסויים בבעלי חיים נערכו על בסיס ההנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי ועדת הרווחה והאתיקה של חיות המעבדה של האוניברסיטה הרפואית הצבאית השלישית.

1. אוטוקלבינג והכנת חומרים

  1. הכינו את הריאגנטים והחומרים המתכלים, כגון תמיסת מלח עם אגירת פוספט (PBS), מספריים, מלקחיים ורשת שוחקת, על ידי עיקור בחום לח על ידי עיקור אוטומטי בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  2. לריאגנטים ולציוד הנדרשים, עיין בטבלת החומרים. עבור הנוסחה של הננו-אמולסיה הריקה (BNE), עיין בטבלה 1.

2. מבחן ציטוטוקסיות L929

  1. הפעל את אמבט המים והתאם את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס. אסוף צינור אחד של תאי L929 קפואים מחנקן נוזלי והפשרה מהירה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  2. צמחו את התאים לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל במהירות לאחר ההפשרה, הוסיפו 2 מ"ל של DMEM וערבבו היטב.
  3. צנטריפוגה את הדגימות ב 129 x g במשך 5 דקות ולהשליך את supernatant. לאחר מכן, הוסף 2 מ"ל של DMEM כדי להשעות את התאים, וצנטריפוגה את הדגימות שוב ב 129 x g במשך 5 דקות.
  4. יש להשליך את הסופר-נטנט, להוסיף 6 מ"ל של מדיום שלם של DMEM (המכיל 10% FBS) לצורך חידוש, ולהעביר לבקבוק תרבית T25 בחממה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 לתרבית למשך 48 שעות.
  5. יש להשליך את מדיום התרבית בבקבוקון התרבית ולשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של PBS. לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין כדי לעכל את התאים במשך 1-2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  6. כאשר עיגול של התאים הוא ציין, להוסיף 4 מ"ל של DMEM מדיום שלם כדי לסיים את העיכול מיד לערבב היטב. לאחר מכן, שאפו את התאים לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל וצנטריפוגה בגודל 129 x g למשך 5 דקות.
  7. הסר את הסופרנטנט ושלח מחדש את התאים ב-1 מ"ל של מדיום שלם של DMEM. השתמש בתרחיף תאים של 20 μL לספירת תאים באמצעות לוחות ספירת תאים ודלל את התאים הנותרים ל-1 x 105 תאים /מ"ל עם מדיום שלם של DMEM.
  8. הוסף 100 μL של מים אולטרה-פוריים לפריפריה של צלחת 96 בארות והוסף 100 μL של דילול תאים לבארות הפנימיות בלבד. מניחים את הצלחת באינקובטור לתרבית דבק למשך 4 שעות ב-37 מעלות צלזיוס.
  9. לאחר שהתאים נדבקים, יש להוסיף OP-D ו-NOD בנפרד במדיום השלם של DMEM לנפח סופי של 200 μL/well (הריכוזים הסופיים של כל תרופה הם 480 מיקרוגרם/מ"ל, 240 מיקרוגרם/מ"ל, 120 מיקרוגרם/מ"ל, 60 מיקרוגרם/מ"ל ו-30 מיקרוגרם/מ"ל). עבור כל ריכוז, השתמש בשלוש בארות כשכפולים. לאחר מכן, החזירו את התאים לאינקובטור ולתרבית למשך 24 שעות נוספות.
  10. יש לדלל את CCK-8 עד 10% עם מדיום שלם של DMEM ולהוסיף דילולים של 100 μL/well המכילים את תמיסות האדג'ובנט והתאים לצלחת 96 הבארות. מניחים את הצלחת בחזרה לתוך האינקובטור ודוגרים עוד 2-3 שעות.
  11. מערבבים לעתים קרובות תוך כדי ציפוי תמיסת התא כדי למנוע אי-הומוגניות כתוצאה ממשקעים בתאים. נערו בעדינות את הצלחת מספר פעמים לפני ואחרי הוספת ה- CCK-8 כדי לערבב היטב את התמיסה הבינונית וה- CCK-8.
  12. מדוד את הספיגה ב-450 ננומטר באמצעות קורא microplate. הגדר באר אפס עם מדיום בלבד ו- CCK-8 לקבלת ערך ספיגה בסיסי. חשב ערכי ספיגה מדויקים על-ידי הפחתת ערך הספיגה האפסית מערך הספיגה המתקבל בעת התוויה.
  13. ודא שאין בועות קיימות בבארות כלשהן לפני הבדיקה עם קורא המיקרו-פלטות מכיוון שבועות יפריעו לבדיקה.

3. גירוי Splenocyte

  1. לחסן עכברי BALB/c בגילאי 6-8 שבועות עם 30 מיקרוגרם של אנטיגן חלבון בתוספת 30 מיקרוגרם של אדג'ובנט באמצעות זריקה תוך שרירית (200 μL) ביום 0, ביום 7 וביום 14 על פי קבוצות הניסוי הבאות: (1) קבוצת PBS, (2) קבוצת אנטיגן (Ag), (3) קבוצת אנטיגן + OP-D (Ag/OP-D), (4) קבוצת אנטיגן + BNE (Ag/BNE), (5) קבוצת אנטיגן + NOD (Ag/NOD), וקבוצת (6) אנטיגן + AlPO4 (Ag/Al).
  2. חדר הכנה: ביום ה-24 לאחר החיסון הראשוני, הוציאו את העכברים מחדר בעלי החיים והרדימו אותם בזריקה תוך-צפקית של 100 מ"ג/ק"ג של 1% נתרן פנטוברביטל. מניחים את העכברים בכלי זכוכית ומשרים ב-75% אלכוהול למשך 5 דקות.
  3. הניחו את צינורות הצנטריפוגה על מתלה צינורות צנטריפוגה, ספרו את צלחות הפטרי החד פעמיות והוסיפו 5 מ"ל של PBS לכל צלחת פטרי עם פיפטה של 10 מ"ל.
  4. בצע חתך של 6-8 ס"מ עם מספריים באמצע הצד הגחוני השמאלי של העכבר, קרע לפתוח את העור, לחשוף את דופן הבטן, ולאתר את הרצועה האדומה הארוכה של הטחול.
  5. הרם את הצפק בצד התחתון של הטחול עם מלקחיים, לחתוך אותו פתוח, ולהפוך אותו כלפי מעלה כדי לחשוף את הטחול. מרימים את הטחול עם מלקחיים, מפרידים את רקמת החיבור מתחת לטחול עם מספריים עיניים, ומסירים את הטחול.
  6. מניחים את הטחול בצלחת פטרי המכילה 5 מ"ל של PBS וטוחנים עם מסננת (200 רשת, 70 מיקרומטר) ומוט השחזה. לאחר הטחינה, העבירו את הנוזל לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל עם טפטפת מרפקים בהתאם למספור.
  7. צנטריפוגה של הנוזל ב 453 x גרם במשך 5 דקות. יש להשליך את הסופר-נטנט, להוסיף 3 מ"ל של חיץ תזה של תאי דם אדומים לכל צינור, להשעות את התאים, וליז בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  8. הוסף 10-12 מ"ל של PBS לכל צינור, ערבב את הצינור הפוך, וצנטריפוגה בגודל 453 x g למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו 10 מ"ל של PBS לכל צינור צנטריפוגה, והניחו מחדש את התאים.
  9. קח 20 μL מכל דגימה בבאר של צלחת ספירת התאים ותעד את מספר התאים החיים באמצעות מונה תאים אוטומטי.
  10. צנטריפוגה את הדגימות ב 453 x g במשך 5 דקות ולהשליך את supernatant. יש להדליף את התאים, לדלל ל-2.5 x 106 תאים /מ"ל עם מדיום RF-10 (מידע על הניסוח בטבלה 2), ולהוסיף לצלחת של 96 בארות ב-100 μL/well.
  11. לדלל את האנטיגן עם מדיום RF-10 עד 10 מיקרוגרם / מ"ל, להוסיף 100 μL לכל באר, ולדגור במשך 3 ימים ב 37 °C ב 5% CO2.
  12. שאפו את תרחיף התאים המתקבל מכל קבוצת תאים בצינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, צנטריפוגה בגודל 453 x גרם למשך 20 דקות, ושאפו את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה נקי.
  13. בצע זיהוי תוכן IFN-γ ו- IL-17A אך ורק בהתאם להוראות ערכת ELISA. השיטות והנהלים הם כדלקמן.
  14. הכן תמיסת עבודה אחת של מאגר כביסה (מסופקת עם הערכה), תמיסת ריכוז שיפוע סטנדרטית (תמיסת ציטוקינים סטנדרטית מדוללת ל-500 pg/mL, 250 pg/mL, 125 pg/mL, 62.5 pg/mL, 31.3 pg/mL ו-15.6 pg/mL במאגר הדילול R [1x] המסופק עם הערכה), תמיסת עבודה של נוגדנים ביוטינילציה (דילול תמיסת נוגדנים ביוטינילציה ל-1:100 באמצעות מאגר הדילול R [1x] המסופק עם הערכה ליצירת הפתרון העובד), ופתרון עבודה של סטרפטווידין-HRP לפי הצורך.
  15. הוסף 100 μL/well של תמיסה סטנדרטית של ציטוקינים מדוללים לתוך הבאר הסטנדרטית, 100 μL/well של דגימה לתוך באר הדגימה (מאגר הדילול R [1x] המסופק עם הערכה משמש לדילול הדגימה), ו-100 μL/well של מאגר דילול R (1x) לתוך באר הבקרה הריקה.
  16. יש להוסיף תמיסת נוגדנים שעברו ביוטינילציה בטמפרטורה של 50 μL/well. מערבבים היטב, מכסים בקרום איטום ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.
  17. הסר את הנוזל מהבארות והוסף תמיסת עבודה אחת של מאגר כביסה בטמפרטורה של 300 μL/well. יש להשליך את הנוזל מהבארות לאחר דקה. חזור על תהליך זה 4x ומאפשר לנוזל להתייבש על נייר סינון בכל פעם.
  18. הוסף 100 μL / באר של פתרון עבודה streptavidin-HRP. מכסים ומדגרים את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. צנטריפוגה את הדגימות ב 453 x g במשך 5 דקות ולהשליך את supernatant.
    הערה: יש לטפוח היטב על תמיסת הכביסה שנותרה בתגובה במהלך תהליך הכביסה עד שלא ניתן לראות סימן מים על נייר הסינון.
  19. מוסיפים TMB ב-100 μL/well, מדגרים את הלוחות ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5-30 דקות בחושך, ושופטים את תגובת הסיום לפי עומק הצבע בבאר (כחול כהה). בדרך כלל, 10-20 דקות לפיתוח צבע יכול להשיג תוצאות טובות.
  20. סיים את התגובה במהירות על ידי הוספת תמיסת עצירה ב-100 μL/well. זהה את ערך הספיגה ב-450 ננומטר תוך 10 דקות לאחר הסיום.
    הערה: יש לאזן את הריאגנט בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני השימוש.

4. מבחן ELISpot

  1. בצע חיסון של העכברים ואת אוסף של splenocytes בדיוק כפי שתואר בשלבים 3.1-3.10 לעיל. בצע את הבדיקות עבור IFN-γ ו- IL-17A בהתאם קפדנית להוראות הערכה. השיטות והנהלים הם כדלקמן.
  2. מוציאים את הצלחת מהאריזה האטומה, שוטפים 4x עם PBS סטרילי (200 μL/well), ומוסיפים 1640 מדיום תרבית שלם (200 μL/well) כדי לאזן אותה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.
  3. הסר את המדיום ודלל את תרחיף הספלנוציטים עם מדיום RF-10 ל 2 x 105 תאים / מ"ל, הוספת 50 μL של תאים ואנטיגן לכל באר (ריכוז סופי: 10 מיקרוגרם / מ"ל).
  4. מניחים את הצלחת באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 48 שעות. אין להזיז את הצלחת במהלך תקופה זו, ולנקוט באמצעים למניעת אידוי (למשל, לעטוף את הצלחת בנייר אלומיניום).
  5. יש לדלל את נוגדן הזיהוי (BVD6-24G2-ביוטין) ל-1 מיקרוגרם/מ"ל (1:1,000) בתמיסת מלח חצובה בפוספט (0.5 מ"ל:100 מ"ל) המכילה 0.5% סרום בקר עוברי (PBS-0.5% FBS). יש להוסיף 100 μL/באר לצלחת, ולדגירה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לאחר הסינון דרך קרום של 0.22 מיקרומטר.
  6. יש לרוקן את הנוזל בבארות, להוסיף חיץ כביסה 1x ב-200 μL/well, ולשטוף פי 5. להשאיר במשך 30-60 שניות בכל פעם, ובפעם האחרונה, לאפשר להתייבש על נייר הכתמה.
  7. יש לדלל את הסטרפטאווידין-חזרת פרוקסידאז (1:1,000) ב-PBS-0.5% FBS ולהוסיף 100 μL/well. לדגור את הצלחת במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לשטוף את הצלחת כמו בשלב 4.6.
  8. הוסף 100 μL/באר של פתרון מצע TMB מוכן לשימוש ופתח עד להופעת נקודה ברורה. עצרו את התפתחות הצבע על ידי שטיפה נרחבת במים שעברו דה-יוניזציה (יש לשטוף 5x-6x שוב ושוב). במידת הצורך, הסר את culvert (פלסטיק רך מתחת לצלחת), ולשטוף את הצד התחתון של הממברנה.
  9. בדקו וספרו את הכתמים בקורא ELISpot או במיקרוסקופ מנתח לאחר שהצלחת התייבשה.

5. ספיגה על ידי DCs

  1. המתת עכברים רגילים BALB/c על ידי הזרקה תוך-צפקית של 100 מ"ג/ק"ג של 1% נתרן פנטוברביטל. השרו את העכברים ב-75% אלכוהול למשך 5 דקות.
  2. חותכים חתך של 6-8 ס"מ מתחת לבטן העכבר במספריים, ומהדקים את שני קצוות הפתח כדי להפריד אותו לכיוונים שונים וחושפים את רגלי העכבר. הפרד את עצם הירך של העכבר מגוף העכבר ואת השוקה מהמפרק, ושמור על העצמות שלמות בשני הקצוות.
  3. הסר את הרקמה השיורית והסחוס מהמפרקים המפרקיים בשני קצות עצם הירך עם מספריים ומלקחיים. השרו את עצם הירך ב-75% אלכוהול למשך 5 דקות, ולאחר מכן השרו בתמיסת PBS סטרילית כדי לשטוף את האלכוהול שעל פני השטח.
  4. חותכים את קצות עצם הירך עם מספריים, ושוטפים את מח העצם בצלחת פטרי סטרילית עם תמיסת PBS סטרילית ואחריה שאיפה עם מזרק 1 מ"ל. יש לחזור על הכביסה 3x-5x.
  5. סנן על ידי מסננת תא (200 רשת, 70 מיקרומטר) ואסוף את BMDCs לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל. צנטריפוגה את הדגימות ב 290 x גרם במשך 5 דקות. יש להשליך את הסופרנטנט, להוסיף 4 מ"ל של חיץ תזה של תאי דם אדומים, לבצע החייאה וליז בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  6. הוסף 10 מ"ל של תמיסת PBS סטרילית כדי לנטרל את הליזאט, צנטריפוגה ב 290 x גרם במשך 5 דקות, ולהשליך את supernatant.
  7. יש לתלות את התאים ב-1 מ"ל של DMEM המכיל 1% תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין ו-10% FBS ולספור. לאחר מכן, הוסיפו לתווך את ה-GM-CSF (20 נ"ג/מ"ל) בתוספת IL-4 (10 נ"ג/מ"ל), התאימו את ריכוז התאים ל-5 x 105/מ"ל וחסנו את התאים על גבי כיסויים.
  8. הוסיפו את מתלה התאים לצלחת של 6 בארות ב-2 מ"ל/באר, והניחו את הצלחת באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 48 שעות. שנה את המדיום לחלוטין לאחר יומיים, ושנה מחצית מהמדיום לאחר 4 ימים.
  9. בחר חמש בארות עם תאים במצב טוב (תאים גדולים ורדיולוסנטיים עם בליטות דנדריטיות על פני התא) באמצעות מיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 100 לניסוי ביום השביעי של התרבית. השליכו את הסופר-נטנט, הוסיפו 2 מ"ל של תמיסות GFP, OP-D + GFP ו-NOD + GFP מדוללות במדיום שלם של DMEM (ריכוז סופי של GFP: 20 מיקרוגרם/מ"ל; ריכוז סופי אדג'ובנטי: 10 מיקרוגרם/מ"ל) לכל באר, ודגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך.
  10. לשטוף את הצלחות 3x עם PBS, להוסיף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde לכל באר, ולדגור בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. הסר את paraformaldehyde לאחר קיבוע, דגירה של התאים עם phalloidin ו DAPI לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל במשך 10 דקות עבור מכתים, ולאחר מכן לשטוף 3x עם PBS.
  11. הוסף 1 מ"ל של PBS לכל באר, ולבחון את ספיגת האנטיגן באמצעות CLSM, כמתואר להלן.
    1. פתח את תוכנת CLSM, לחץ על מערכת ZEN והמתן עד להשלמת אתחול החומרה.
    2. לחץ על קיצורי הדרך GFP ו- DAPI בכרטיסיית איתור כדי למצוא את האזור שניתן לצפות בו. כבו את אור הפלואורסצנט ואת האור המועבר.
    3. לחצו על Smart Setup בתפריט הרכישה כדי לפתוח את ספריית הצבעים, והוסיפו שלושה צבעים פלואורסצנטיים: EGFP, phalloidin ו-DAPI. לחץ על האות הטוב ביותר > אישור. לחץ על ערוץ EGFP בכרטיסייה ערוצים ולחץ על Live כדי לבחור את שדה הראייה הנכון בממשק הנכון.
    4. בחר 1 AU עבור חור הפין, סובב את בורג המיקוד העדין כדי להתאים את אורך המוקד ובחר את מישור המוקד המתאים. לחץ על מחוון טווח והתאם את השילוב של כוח לייזר ורווח מאסטר כך שרק נקודות אדומות ספורדיות יופיעו בתמונה.
    5. התאם את ערוצי הפאלוידין וה- DAPI עם אותם פרמטרים מבלי לשנות את עוצמת הלייזר.
    6. בחר עצור בשידור חי ולחץ על מצב רכישה כדי לשנות את פרמטרי הצילום: גודל מסגרת: 1024 פיקסלים x 1024 פיקסלים; מהירות סריקה: 7; ממוצע: 2x. לחץ על הצמדה ובחר פצל כדי להציג את כל התמונות שצולמו. שמור את התמונות.

6. הפעלת מקרופאגים

  1. יש לטבול את עכברי C57BL/6 ב-75% אלכוהול לאחר המתת חסד, ולהניח אותם עם הפנים כלפי מעלה בצלחת פטרי מזכוכית בסדר ממוספר.
  2. מעבירים את העכברים דרך חלון ההעברה לחדר הניתוח הסטרילי ומניחים על שולחן הניתוחים למשך 5 דקות.
  3. באמצעות מזרק, לשאוף 10 מ"ל של מלח, להטות את העכברים כלפי מטה בטמפרטורה של כ-45°, ולהזריק למרכז חלל הבטן. משוך כ -5 מ"ל של תרחיף התא לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל עבור כל 10 מ"ל וחזור על ההזרקה 3x.
  4. צנטריפוגה של מתלה התא ב 129 x g במשך 5 דקות כדי לקבל מקרופאגים ראשוניים הצפק של העכבר. יש להשעות את התאים, להתאים את ריכוז התאים ל-2 x 106 תאים למ"ל עם RPMI 1640 בינוני שלם (המכיל 10% FBS), ולחסן את תרחיף התאים בצלחת של 24 באר כדי להבטיח מספר עקבי של תאים לכל באר (1 מ"ל/טוב).
  5. תרבית ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO 2 למשך הלילה (כ-16-20 שעות), ולאחר מכן דגירה עם PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD ו-Ag/Al (ריכוז סופי של Ag: 5 מיקרוגרם/מ"ל; ריכוז סופי אדג'ובנטי: 10 מיקרוגרם/מ"ל; נפח כולל:2 מ"ל) למשך 24 שעות. זהה את הרמות של IL-1β, IL-6 ו- TNF-α בתרבית עם ערכות ELISA באמצעות השיטות והנהלים המתוארים בשלבים 3.12-3.19.

תוצאות

הערכת הפעילות התאית של האדג'ובנטים OP-D ו-NOD הושלמה במבחנה על פי הפרוטוקול. פיברובלסטים L929 הם מודל סינון שימושי לבדיקת רעילות במבחנה של NOD (איור 1). כימות רמות הציטוקינים הדלקתיים בטחול יכול לעזור לחוקרים להבין טוב יותר את התגובה החיסונית (איור 2). ניטו...

Discussion

חיסונים תת-יחידות מספקים בטיחות מצוינת אך אימונוגניות ירודה. האסטרטגיה העיקרית לשיפור האימונוגניות היא לספוח פיזית או להצמיד אנטיגנים עם אדג'ובנטים ולשלב אותם במערכות אספקת התרופות כדי לקדם את הקליטה וההצגה על ידי DCs. ספונינים צמחיים טבעיים כגון quillaia saponin ונגזרותיו הם רעילים מאוד ואינם מ...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים או אישיים מתחרים שהיו יכולים להשפיע על העבודה המדווחת במאמר זה.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענק מס '2021YFC2302603 של תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין, מענקים מס '31670938, 32070924, 82041045 ו- 32000651 של תוכנית הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין, מענקים מס ' 2014jcyjA0107 ומס ' 2019jcyjA-msxmx0159 של תוכנית פרויקט הקרן למדעי הטבע של צ'ונגצ'ינג, מענק מס 'CYS21519 של פרויקט המחקר והחדשנות לתואר שני של צ'ונגצ'ינג, מענק מס '2020XBK24 של פרויקטים מיוחדים של האוניברסיטה הרפואית הצבאית, ומענק מס '202090031021 של התוכנית הלאומית לחדשנות ויזמות לסטודנטים במכללה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTA (1x)GIBCO, USA25200056
96-well filter platesMillipore. Billerica, MACLS3922
AlPO4General Chemical Company, USAnull
Automated Cell CounterCountstar, ChinaIC1000
BALB/c mice and C57BL/6 miceBeijing HFK Bioscience Co. Ltdnull
caprylic/capric triglyceride (GTCC)Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, Chinanull
CCK-8 kitsDojindo, JapanCK04
Cell Counting PlateCostar, Corning, USACO010101
Cell Sievebiosharp, ChinaBS-70-CS
Centrifuge 5810 REppendorf, Germany 5811000398
DAPISigma-Aldrich, St. Louis, USAD9542
DMEM basic(1x) mediumGIBCO, USAC11885500BT
DSZ5000X Inverted MicroscopeNikon,JapanDSZ5000X
EL-35 (Cremophor-35)Mumbai, Indianull
ELISpot classicAID, GermanyELR06
Fetal Bovine SerumGIBCO, USA10099141C
Full-function Microplate ReaderThermo Fisher Scientific, USAVL0000D2
GFPSigma-Aldrich, St. Louis, USAP42212
GlutamaxInvitrogen, USA35050061
Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating FactorGM-CSF, R&D Systems, USA315-03
HEPESInvitrogen, USA15630106
HF 90/240 IncubatorHeal Force, Switzerlandnull
IL-4PeproTech, USA042149
L929 cell lineFENGHUISHENGWU, China NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462)
Laser Scanning Confocal MicroscopyZeiss, GermanyLSM 980
MONTANE 85 PPISEPPIC, FranceL12910
MONTANOX 80 PPISEPPIC, France36372K
Mouse IFN-γ ELISA kitDakewe, China1210002
Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kitDakewe, ChinaDKW22-2000-096
Mouse IL-17A ELISA kitDakewe, China1211702
Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kitebiosciences, USA3521-4HPW-2
Mouse IL-1β ELISA kitDakewe, China1210122
Mouse IL-6 ELISA kitDakewe, China1210602
Mouse TNF-α ELISA kitDakewe, China1217202
Non-essential amino acids(100x)Invitrogen, USA11140050
Ophiopogonin-DChengdu Purui Technology Co. Ltd945619-74-9
Penicillin-Streptomycin SolutionInvitrogen, USA15070063
PhalloidinSolarbio, ChinaCA1620
Phosphate Buffered SalineZSGB-BIO, ChinaZLI-9062
Red Blood Cell Lysis BufferSolarbio, ChinaR1010
RPMI 1640 mediumHyclone (Life Technology), USASH30809.01
Sodium pyruvate(100 mM)Invitrogen, USA11360070
SqualeneSigma, USAS3626
β- MercaptoethanolInvitrogen, USA21985023

References

  1. Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
  2. Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
  3. Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
  4. Kuo, T. Y., et al. Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19. Scientific Reports. 10, 20085 (2020).
  5. Twentyman, E., et al. Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged >/=18 years - United States, July 2022. MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).
  6. Wang, Z., et al. Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens. ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).
  7. Wang, N., Chen, M., Wang, T. Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization. Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).
  8. Akin, I., et al. Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis. Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).
  9. Lacaille-Dubois, M. A. Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review. Phytomedicine. 60, 152905 (2019).
  10. Marty-Roix, R., et al. Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).
  11. Zhang, Y. Y., et al. Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).
  12. An, E. J., et al. Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).
  13. Song, X., et al. Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken. Pesquisa Veterinária Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).
  14. Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
  15. Lin, C. A., et al. Hyaluronic acid-glycine-cholesterol conjugate-based nanoemulsion as a potent vaccine adjuvant for T cell-mediated immunity. Pharmaceutics. 13 (10), 1569 (2021).
  16. Xu, H. H., et al. Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D' in vivo. Chinese Medicine. 16 (1), 3 (2021).
  17. Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines. Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).
  18. Rudolf, R., et al. Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite. Materials. 13 (12), 2717 (2020).
  19. Cannella, V., et al. Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line. BioMed Research International. 2019, 3469525 (2019).
  20. Jiao, G., et al. Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity. RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).
  21. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
  22. Li, W., Zhou, J., Xu, Y. Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices. Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).
  23. Wu, F., et al. Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury. Journal of Neuroimmunology. 344, 577264 (2020).
  24. Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. Structure and function of the immune system in the spleen. Science Immunology. 4 (33), (2019).
  25. Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay. Methods. 38 (4), 274-282 (2006).
  26. Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
  27. Zhou, Y., et al. CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis. Frontiers in Immunology. 13, 967410 (2022).
  28. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Frontiers in Bioscience. 13, 453-461 (2008).
  29. Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. Adjuvant activity on murine and human macrophages. Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved