In vitro Valutazione dell'attività cellulare del vaccino adiuvante nanoemulsione ofiopogonina D

Riepilogo

Il protocollo presenta metodi dettagliati per valutare se l'adiuvante nanoemulsione ofiopogonina D promuove risposte immunitarie cellulari efficaci.

Abstract

Come ingrediente principale dei vaccini, gli adiuvanti possono indurre o migliorare direttamente le risposte immunitarie potenti, diffuse, innate e adattative associate agli antigeni. Ophiopogonin D (OP-D), un componente purificato estratto dalla pianta Ophiopogon japonicus, è stato trovato utile come adiuvante del vaccino. I problemi della bassa solubilità e tossicità dell'OP-D possono essere efficacemente superati utilizzando un metodo di emulsificazione a bassa energia per preparare la nanoemulsione ofiopogonina D (NOD). In questo articolo vengono esaminati una serie di protocolli in vitro per la valutazione dell'attività cellulare. Gli effetti citotossici di L929 sono stati determinati utilizzando un test kit-8 per il conteggio delle cellule. Quindi, i livelli di citochine secreti e il corrispondente numero di cellule immunitarie dopo la stimolazione e la coltura di splenociti da topi immunizzati sono stati rilevati con metodi ELISA ed ELISpot. Inoltre, la capacità di assorbimento dell'antigene nelle cellule dendritiche derivate dal midollo osseo (BMDC), che sono state isolate da topi C57BL / 6 e maturate dopo l'incubazione con GM-CSF più IL-4, è stata osservata mediante microscopia confocale a scansione laser (CLSM). È importante sottolineare che l'attivazione dei macrofagi è stata confermata misurando i livelli di IL-1β, IL-6 e citochine del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) mediante kit ELISA dopo aver cocoltivato macrofagi peritoneali (PM) da topi bianchi con l'adiuvante per 24 ore. Si spera che questo protocollo fornirà ad altri ricercatori approcci sperimentali diretti ed efficaci per valutare l'efficacia della risposta cellulare di nuovi adiuvanti vaccinali.

Introduzione

I vaccini sono un mezzo importante per prevenire e curare le malattie infettive e non trasmissibili. L'aggiunta appropriata di adiuvanti e veicoli di somministrazione alle formulazioni dei vaccini è utile per migliorare l'immunogenicità degli antigeni e generare risposte immunitarie durature¹. Oltre al classico allume adiuvante (sale di alluminio), ci sono sei tipi di adiuvanti per i vaccini che sono attualmente commercializzati: MF59^2,3, AS04 3, AS03 3, AS01 ³, CpG1018⁴ e Matrix-M⁵. Generalmente, quando il corpo umano incontra un attacco virale, la prima e la seconda linea di difesa (pelle, mucosa e macrofagi) prendono il comando nell'eliminazione del virus e, infine, viene attivata la terza linea di difesa, che coinvolge gli organi immunitari e le cellule immunitarie. L'alluminio e i sali di alluminio sono stati gli adiuvanti più utilizzati per i vaccini umani sin dai primi anni 1920, suscitando un'efficace risposta immunitaria innata⁶. Tuttavia, è stato proposto che l'attivazione delle cellule presentanti l'antigene (APC) da parte degli adiuvanti classici, che stimola le cellule immunitarie a generare serie specifiche di citochine e chemochine, è il meccanismo attraverso il quale funzionano gli adiuvanti e può essere uno dei motivi per cui gli adiuvanti esercitano solo effetti transitori su specifiche risposte immunitarie⁷. La presenza di adiuvanti autorizzati limitati per uso umano è un fattore restrittivo per lo sviluppo di vaccini che suscitano risposte immunitarie efficaci⁸.

Attualmente, un numero crescente di studi adiuvanti sta dimostrando la capacità di indurre una forte risposta immunitaria cellulare nei topi. QS-21 ha dimostrato di indurre una risposta immunitaria bilanciata T-helper 1 (Th1) e T-helper 2 (Th2), produrre livelli più elevati di titoli anticorpali e prolungare la protezione come adiuvante, ma la sua forte tossicità e le proprietà emolitiche limitano il suo sviluppo come adiuvante clinico autonomo ^9,10. OP-D (ruscogenina-O-α-L-ramnopiranosia1-(1→2)-β-D-xilopiranosil-(1→3)-β-D-fucopyranoside) è una delle saponine steroidee isolate dalla radice della pianta medicinale cinese Ophiopogon japonicas⁴. Inoltre, è il principale componente farmacologicamente attivo (Shen Mai San) trovato in Radix Ophiopogonis ed è noto per avere alcune proprietà farmacologiche¹¹. Inoltre, è un membro della famiglia delle Liliaceae ed è ampiamente utilizzato per i suoi effetti inibitori e protettivi nell'infiammazione cellulare e nel danno miocardico. Ad esempio, OP-D migliora le lesioni simili alla dermatite atopica indotte da DNCB e le cellule HaCaT infiammatorie del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) nei topi BALB / c¹². È importante sottolineare che OP-D promuove la protezione antiossidante del sistema cardiovascolare e protegge il cuore dal danno autofagico indotto dalla doxorubicina riducendo sia la generazione di specie reattive dell'ossigeno che interrompendo il danno alla membrana mitocondriale. Gli esperimenti hanno dimostrato che l'assunzione di OP-D con mono-desmoside aiuta a migliorare la salute immunitaria, aumentare la conta dei globuli bianchi e la sintesi del DNA e far durare più a lungo gli anticorpi¹³. In precedenza è stato riscontrato che l'OP-D ha un effetto adiuvante¹⁴.

Le nanoemulsioni sono nanoformulazioni olio-in-acqua composte da una combinazione di tensioattivi, olio, tensioattivi e acqua^12,15. Questi progetti di nanovaccini consentono di incapsulare insieme antigeni e adiuvanti per migliorare la stimolazione immunitaria, proteggere gli antigeni e promuovere la maturazione delle cellule dendritiche (DC)¹⁶. Per lo sviluppo di questi nuovi adiuvanti ottenuti dallo screening, è importante trovare metodi appropriati per valutare le loro capacità di risposta cellulare.

Lo scopo di questo protocollo è quello di valutare sistematicamente se gli adiuvanti possono migliorare la fagocitosi e l'espressione di cellule immunitarie in colture cellulari in vitro e di elaborare i principali metodi sperimentali. L'esperimento è diviso in quattro sottosezioni: (1) la tossicità di OP-D e NOD per le cellule L929 è determinata dal test del kit-8 (CCK-8) per il conteggio delle cellule; (2) i livelli di citochine di IFN-γ endocrino e IL-17A e il numero di cellule corrispondenti nei topi immunizzati sono rilevati mediante stimolazione degli splenociti e saggi ELISpot; (3) la capacità di presentazione dell'antigene delle DC dopo stimolazione adiuvante è osservata utilizzando la microscopia confocale; e (4) vengono rilevati i tre tipi di citochine, IL-1β, IL-6 e TNF-α, nei supernatanti ottenuti da macrofagi peritoneali (PM) in topi normali in cocoltura con adiuvanti.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sulle cellule sono stati eseguiti in un laboratorio di ingegneria cellulare dotato di sale operatorie di base, sale tampone, sale di coltura sterili e sale di identificazione e analisi. L'ambiente e le condizioni di lavoro erano privi di contaminazione microbica e altri fattori dannosi. Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti sulla base delle linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato etico e benessere degli animali da laboratorio della Terza Università medica militare.

1. Autoclave e preparazione del materiale

1. Preparare i reagenti e i materiali di consumo, come soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), forbici, pinze e rete abrasiva, mediante sterilizzazione a calore umido mediante autoclave a 121 °C per 20 minuti.
2. Per i reagenti e le attrezzature necessari, vedere la tabella dei materiali. Per la formula della nanoemulsione in bianco (BNE), controllare la Tabella 1.

2. Saggio di citotossicità L929

1. Accendere il bagnomaria e regolare la temperatura a 37 °C. Raccogliere un tubo di cellule L929 congelate dall'azoto liquido e scongelare rapidamente a bagnomaria a 37 °C.
2. Pipettare le cellule in una provetta da centrifuga sterile da 15 ml subito dopo lo scongelamento, aggiungere 2 ml di DMEM e mescolare bene.
3. Centrifugare i campioni a 129 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Quindi, aggiungere 2 ml di DMEM per risospendere le cellule e centrifugare nuovamente i campioni a 129 x g per 5 minuti.
4. Eliminare il surnatante, aggiungere 6 mL di terreno completo DMEM (contenente il 10% di FBS) per la risospensione e trasferirlo in un matraccio di coltura T25 in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂ in coltura per 48 ore.
5. Eliminare il terreno di coltura nel pallone di coltura e lavare le cellule due volte con 2 ml di PBS. Quindi, aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,25% per digerire le cellule per 1-2 minuti a 37 °C.
6. Quando si osserva l'arrotondamento delle cellule, aggiungere 4 ml di mezzo completo DMEM per terminare immediatamente la digestione e mescolare bene. Quindi, aspirare le cellule in una provetta sterile da 15 ml e centrifugare a 129 x g per 5 minuti.
7. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di terreno completo DMEM. Utilizzare una sospensione cellulare da 20 μL per il conteggio delle cellule utilizzando piastre di conteggio delle cellule e diluire le cellule rimanenti a 1 x 10⁵ cellule / ml con DMEM mezzo completo.
8. Aggiungere 100 μL di acqua ultrapura alla periferia di una piastra a 96 pozzetti e aggiungere 100 μL di diluente cellulare solo ai pozzetti interni. Posizionare la piastra nell'incubatore per coltura aderente per 4 ore a 37 °C.
9. Dopo che le cellule aderiscono, aggiungere OP-D e NOD separatamente nel mezzo completo DMEM a un volume finale di 200 μL / pozzetto (le concentrazioni finali di ciascun farmaco sono 480 μg / mL, 240 μg / mL, 120 μg / mL, 60 μg / mL e 30 μg / mL). Per ogni concentrazione, utilizzare tre pozzetti come repliche. Quindi, riposizionare le cellule nell'incubatore e nella coltura per altre 24 ore.
10. Diluire CCK-8 al 10% con mezzo completo DMEM e aggiungere 100 μL/pozzetto di diluizioni contenenti l'adiuvante e le soluzioni cellulari alla piastra a 96 pozzetti. Rimettere la piastra nell'incubatore e incubare per altre 2-3 ore.
11. Mescolare frequentemente durante la placcatura della soluzione cellulare per evitare disomogeneità dovute alla precipitazione cellulare. Agitare delicatamente la piastra più volte prima e dopo aver aggiunto CCK-8 per mescolare bene il mezzo e la soluzione CCK-8.
12. Misurare l'assorbanza a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre. Impostare un pozzetto di azzeramento con solo mezzo e CCK-8 per un valore di assorbanza di base. Calcolare valori di assorbanza accurati sottraendo il valore di assorbanza azzerato dal valore di assorbanza ottenuto durante il plottaggio.
13. Verificare che non siano presenti bolle in nessun pozzetto prima di eseguire il test con il lettore di micropiastre perché le bolle interferiranno con il test.

3. Stimolazione degli splenociti

1. Immunizzare topi BALB/c di età compresa tra 6-8 settimane con 30 μg di antigene proteico più 30 μg di adiuvante tramite iniezione intramuscolare (200 μL) il giorno 0, giorno 7 e giorno 14 secondo i seguenti gruppi sperimentali: (1) gruppo PBS, (2) gruppo antigene (Ag), (3) gruppo antigene + OP-D (Ag/OP-D), (4) gruppo antigene + BNE (Ag/BNE), (5) gruppo antigene + NOD (Ag/NOD) e (6) gruppo antigene + AlPO₄ (Ag/Al).
2. Sala di preparazione: Il giorno 24 dopo l'immunizzazione primaria, rimuovere i topi dalla stanza degli animali e eutanasizzarli mediante un'iniezione intraperitoneale di 100 mg / kg di pentobarbital di sodio all'1%. Mettere i topi in un piatto di vetro e immergere in alcool al 75% per 5 minuti.
3. Posizionare le provette da centrifuga su una griglia per tubi da centrifuga, numerare le piastre di Petri monouso e aggiungere 5 ml di PBS a ciascuna piastra di Petri con una pipetta da 10 ml.
4. Fai un'incisione di 6-8 cm con le forbici nel mezzo del lato ventrale sinistro del mouse, apri la pelle, esponi la parete addominale e individua la lunga striscia rossa della milza.
5. Sollevare il peritoneo sul lato inferiore della milza con una pinza, tagliarlo e girarlo verso l'alto per esporre la milza. Sollevare la milza con una pinza, separare il tessuto connettivo sotto la milza con forbici oftalmiche e rimuovere la milza.
6. Mettere la milza in una piastra di Petri contenente 5 ml di PBS e macinare con un setaccio (200 maglie, 70 μm) e una barra di macinazione. Dopo la macinazione, trasferire il liquido in una provetta da centrifuga da 15 ml con un contagocce, secondo la numerazione.
7. Centrifugare il liquido a 453 x g per 5 min. Scartare il surnatante, aggiungere 3 ml di tampone di lisi dei globuli rossi a ciascuna provetta, risospendere le cellule e lisare a temperatura ambiente per 10 minuti.
8. Aggiungere 10-12 ml di PBS a ciascun tubo, mescolare il tubo capovolto e centrifugare a 453 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante, aggiungere 10 ml di PBS a ciascuna provetta da centrifuga e risospendere le cellule.
9. Prelevare 20 μL di ciascun campione in un pozzetto della piastra di conteggio delle cellule e registrare il numero di cellule vive utilizzando un contatore automatico delle celle.
10. Centrifugare i campioni a 453 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Risospendere le cellule, diluire a 2,5 x 10⁶ cellule/ml con mezzo RF-10 (informazioni sulla formulazione nella Tabella 2) e aggiungere a una piastra da 96 pozzetti a 100 μL/pozzetto.
11. Diluire l'antigene con RF-10 medio a 10 μg/ml, aggiungere 100 μL a ciascun pozzetto e incubare per 3 giorni a 37 °C in 5% di CO₂.
12. Aspirare la sospensione cellulare ottenuta da ciascun gruppo di cellule in provette da centrifuga da 1,5 ml, centrifugare a 453 x g per 20 minuti e aspirare il surnatante in una provetta da centrifuga pulita.
13. Eseguire il rilevamento del contenuto di IFN-γ e IL-17A rigorosamente secondo le istruzioni del kit ELISA. I metodi e le procedure sono i seguenti.
14. Preparare 1x soluzione tampone di lavaggio funzionante (fornita con il kit), soluzione standard di concentrazione gradiente (soluzione standard di citochine diluite a 500 pg/mL, 250 pg/mL, 125 pg/mL, 62,5 pg/mL, 31,3 pg/ml e 15,6 pg/mL nel tampone di diluizione R [1x] fornito con il kit), soluzione di lavoro anticorpale biotinilata (soluzione anticorpale biotinilata diluita a 1:100 utilizzando il tampone di diluizione R [1x] fornito con il kit per formare la soluzione di lavoro), e soluzione di lavoro streptavidina-HRP secondo necessità.
15. Aggiungere 100 μL/pozzetto di soluzione standard di citochine diluite nel pozzetto standard, 100 μL/pozzetto del campione nel pozzetto del campione (il tampone di diluizione R [1x] fornito con il kit viene utilizzato per la diluizione del campione) e 100 μL/pozzetto del tampone di diluizione R (1x) nel pozzetto di controllo in bianco.
16. Aggiungere la soluzione di lavoro di anticorpi biotinilati a 50 μL/pozzetto. Mescolare bene, coprire con una membrana sigillante e incubare a 37 °C per 90 minuti.
17. Rimuovere il liquido dai pozzetti e aggiungere 1x soluzione tampone di lavaggio funzionante a 300 μL/pozzetto. Scartare il liquido dai pozzetti dopo 1 min. Ripetere questo processo 4 volte lasciando asciugare il liquido su carta da filtro ogni volta.
18. Aggiungere 100 μL/pozzetto di soluzione di lavoro streptavidina-HRP. Coprire e incubare i campioni a 37 °C per 30 minuti. Centrifugare i campioni a 453 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
    NOTA: La soluzione di lavaggio che rimane nel pozzetto di reazione durante il processo di lavaggio deve essere accuratamente tamponata fino a quando non è possibile vedere alcuna filigrana sulla carta da filtro.
19. Aggiungere TMB a 100 μL/pozzetto, incubare le piastre a 37 °C per 5-30 minuti al buio e giudicare la reazione di terminazione in base alla profondità di colore nel pozzetto (blu scuro). Di solito, 10-20 minuti per lo sviluppo del colore possono ottenere buoni risultati.
20. Terminare rapidamente la reazione aggiungendo soluzione di arresto a 100 μL/pozzetto. Rilevare il valore di assorbanza a 450 nm entro 10 minuti dalla terminazione.
    NOTA: Equilibrare il reagente a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso.

4. Saggio ELISpot

1. Eseguire l'immunizzazione dei topi e la raccolta di splenociti esattamente come descritto nei passaggi 3.1-3.10 sopra. Eseguire i test per IFN-γ e IL-17A in stretta conformità con le istruzioni del kit. I metodi e le procedure sono i seguenti.
2. Rimuovere la piastra dalla confezione sigillata, lavare 4 volte con PBS sterile (200 μL/pozzetto) e aggiungere 1640 terreno di coltura completo (200 μL/pozzetto) per bilanciarlo a temperatura ambiente per 2 ore.
3. Rimuovere il terreno e diluire la sospensione di splenociti con RF-10 medio a 2 x 10⁵ cellule/ml, aggiungendo 50 μL di cellule e antigene per pozzetto (concentrazione finale: 10 μg/mL).
4. Posizionare la piastra in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO₂ per 48 ore. Non spostare la piastra durante questo periodo e adottare misure per evitare l'evaporazione (ad esempio, avvolgere la piastra con un foglio di alluminio).
5. Diluire l'anticorpo di rilevazione (BVD6-24G2-biotina) a 1 μg/mL (1:1.000) in soluzione salina tamponata fosfato (0,5 mL:100 mL) contenente 0,5% siero fetale bovino (PBS-0,5% FBS). Aggiungere 100 μL/pozzetto alla piastra e incubarla a temperatura ambiente per 2 ore dopo la filtrazione attraverso una membrana da 0,22 μm.
6. Decantare il liquido nei pozzetti, aggiungere 1x tampone di lavaggio a 200 μL/pozzetto e lavare 5x. Lasciare agire per 30-60 secondi ogni volta e, per l'ultima volta, lasciare asciugare su carta assorbente.
7. Diluire la streptavidina-rafano perossidasi (1:1.000) in PBS-0,5% FBS e aggiungere 100 μL/pozzetto. Incubare la piastra per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare la piastra come al punto 4.6.
8. Aggiungere 100 μL/pozzetto di soluzione di substrato TMB pronta all'uso e sviluppare fino a quando non appare un punto chiaro. Interrompere lo sviluppo del colore lavando abbondantemente in acqua deionizzata (risciacquare 5x-6x ripetutamente). Se necessario, rimuovere il canale sotterraneo (la plastica morbida sotto la piastra) e sciacquare il lato inferiore della membrana.
9. Esaminare e contare le macchie su un lettore ELISpot o un microscopio da dissezione dopo che la lastra si è asciugata.

5. Adozione da parte dei paesi in via di sviluppo

1. Eutanasia di topi normali BALB/c mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di pentobarbital di sodio all'1%. Immergere i topi in alcool al 75% per 5 minuti.
2. Tagliare un'incisione di 6-8 cm sotto l'addome del mouse con le forbici e bloccare le due estremità dell'apertura per separarlo in direzioni diverse ed esporre le gambe del mouse. Separare il femore del topo dal corpo del topo e la tibia dall'articolazione e mantenere intatte le ossa ad entrambe le estremità.
3. Rimuovere il tessuto residuo e la cartilagine dalle articolazioni articolari ad entrambe le estremità del femore con forbici e pinze. Immergere i femori in alcool al 75% per 5 minuti, quindi immergerli in una soluzione sterile di PBS per lavare via l'alcol superficiale.
4. Tagliare le estremità dei femori con le forbici e sciacquare il midollo osseo in una capsula di Petri sterile con soluzione sterile di PBS seguita da aspirazione con una siringa da 1 ml. Ripetere il lavaggio 3x-5x.
5. Filtrare mediante un setaccio cellulare (200 mesh, 70 μm) e raccogliere i BMDC in una provetta da centrifuga da 15 ml. Centrifugare i campioni a 290 x g per 5 minuti. Eliminare il surnatante, aggiungere 4 ml di tampone di lisi dei globuli rossi, risospendere e lisare a temperatura ambiente per 5 minuti.
6. Aggiungere 10 mL di soluzione sterile di PBS per neutralizzare il lisato, centrifugare a 290 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
7. Risospendere le cellule in 1 mL di DMEM contenente una soluzione di penicillina-streptomicina all'1% e FBS al 10% e contare. Quindi, aggiungere GM-CSF (20 ng / mL) più IL-4 (10 ng / mL) al mezzo, regolare la concentrazione cellulare a 5 x 10⁵ / ml e inoculare le cellule su vetrini.
8. Aggiungere la sospensione della cella in una piastra a 6 pozzetti a 2 mL/pozzetto e posizionare la piastra in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO₂ per 48 ore. Cambia completamente il mezzo dopo 2 giorni e cambia metà del mezzo dopo 4 giorni.
9. Selezionare cinque pozzetti con cellule in buone condizioni (cellule grandi e radiotrasparenti con sporgenze dendritiche sulla superficie cellulare) utilizzando un microscopio invertito con ingrandimento 100x per l'esperimento il settimo giorno di coltura. Scartare il surnatante, aggiungere 2 mL di soluzioni GFP, OP-D + GFP e NOD + GFP diluite con DMEM mezzo completo (concentrazione finale GFP: 20 μg/mL; concentrazione finale adiuvante: 10 μg/mL) a ciascun pozzetto e incubare le piastre a 37 °C per 30 minuti al buio.
10. Lavare le piastre 3 volte con PBS, aggiungere 1 ml di paraformaldeide al 4% a ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Rimuovere la paraformaldeide dopo la fissazione, incubare le cellule con falloidina e DAPI ad una concentrazione finale di 10 μg / ml per 10 minuti per la colorazione, quindi lavare 3 volte con PBS.
11. Aggiungere 1 mL di PBS a ciascun pozzetto e osservare l'assorbimento dell'antigene utilizzando CLSM, come descritto di seguito.
    1. Aprire il software CLSM, fare clic su ZEN System e attendere il completamento dell'inizializzazione dell'hardware.
    2. Fare clic sulle scorciatoie GFP e DAPI nella scheda Trova per trovare l'area che può essere osservata. Spegnere la luce fluorescente e la luce trasmessa.
    3. Fare clic su Smart Setup nel menu di acquisizione per aprire la libreria di coloranti e aggiungere tre coloranti fluorescenti: EGFP, falloidina e DAPI. Fare clic su Miglior segnale > OK. Fare clic sul canale EGFP nella scheda canali e fare clic su Live per selezionare il campo visivo corretto sull'interfaccia a destra.
    4. Selezionate 1 UA per il foro stenopeico, ruotate la vite di messa a fuoco fine per regolare la lunghezza focale, quindi selezionate il piano focale appropriato. Fare clic su Indicatore di intervallo e regolare la combinazione di potenza laser e guadagno principale in modo che solo sporadici punti rossi appaiano sull'immagine.
    5. Regolare i canali falloidina e DAPI con gli stessi parametri senza modificare la potenza del laser.
    6. Selezionare Stop Live e fare clic su Modalità di acquisizione per modificare i parametri di ripresa: Dimensioni fotogramma: 1024 pixel x 1024 pixel; Velocità di scansione: 7; Media: 2x. Clicca su Snap e seleziona Dividi per visualizzare tutte le immagini scattate. Salvare le immagini.

6. Attivazione dei macrofagi

1. Immergere i topi C57BL/6 in alcool al 75% dopo l'eutanasia e metterli a faccia in su in una capsula di Petri di vetro in ordine numerato.
2. Passare i topi attraverso la finestra di trasferimento nella sala operatoria sterile e posizionarli sul tavolo operatorio per 5 minuti.
3. Utilizzando una siringa, aspirare 10 mL di soluzione salina, inclinare i topi verso il basso di circa 45° e iniettarli al centro della cavità addominale. Aspirare circa 5 mL di sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL per ogni 10 mL e ripetere l'iniezione 3x.
4. Centrifugare la sospensione cellulare a 129 x g per 5 minuti per ottenere macrofagi primari peritoneali di topo. Risospendere le cellule, regolare la concentrazione cellulare a 2 x 10⁶ cellule/ml con RPMI 1640 mezzo completo (contenente il 10% di FBS) e inoculare la sospensione cellulare in una piastra a 24 pozzetti per garantire un numero costante di cellule per pozzetto (1 mL/pozzetto).
5. Coltura a 37 °C in 5% di CO 2 durante la notte (circa 16-20 ore), seguita da incubazione con PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD e Ag/Al (concentrazione finale di Ag: 5 μg/ml; concentrazione finale adiuvante: 10 μg/ml; volume totale:₂ ml) per 24 ore. Rilevare i livelli di IL-1β, IL-6 e TNF-α nel surnatante di coltura con kit ELISA utilizzando i metodi e le procedure descritti nei passaggi 3.12-3.19.

Risultati

La valutazione dell'attività cellulare degli adiuvanti OP-D e NOD è stata completata in vitro secondo il protocollo. I fibroblasti L929 sono un utile modello di screening per i test di tossicità in vitro di NOD (Figura 1). La quantificazione dei livelli di citochine infiammatorie nella milza può aiutare i ricercatori a comprendere meglio la risposta immunitaria (Figura 2). Il monitoraggio dei CTL con ELISpot è il gold standard per valutare...

Discussione

I vaccini a subunità forniscono un'eccellente sicurezza ma scarsa immunogenicità. La strategia principale per migliorare l'immunogenicità consiste nell'assorbire fisicamente o accoppiare gli antigeni con adiuvanti e incorporarli nei sistemi di somministrazione dei farmaci per promuovere l'assorbimento e la presentazione da parte delle DC. Le saponine vegetali naturali come la saponina di quillaia e i suoi derivati sono altamente tossiche e non sono adatte allo sviluppo di vaccini umani¹⁷. Perta...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	GIBCO, USA	25200056
96-well filter plates	Millipore. Billerica, MA	CLS3922
AlPO4	General Chemical Company, USA	null
Automated Cell Counter	Countstar, China	IC1000
BALB/c mice and C57BL/6 mice	Beijing HFK Bioscience Co. Ltd	null
caprylic/capric triglyceride (GTCC)	Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China	null
CCK-8 kits	Dojindo, Japan	CK04
Cell Counting Plate	Costar, Corning, USA	CO010101
Cell Sieve	biosharp, China	BS-70-CS
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D9542
DMEM basic(1x) medium	GIBCO, USA	C11885500BT
DSZ5000X Inverted Microscope	Nikon,Japan	DSZ5000X
EL-35 (Cremophor-35)	Mumbai, India	null
ELISpot classic	AID, Germany	ELR06
Fetal Bovine Serum	GIBCO, USA	10099141C
Full-function Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific, USA	VL0000D2
GFP	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P42212
Glutamax	Invitrogen, USA	35050061
Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor	GM-CSF, R&D Systems, USA	315-03
HEPES	Invitrogen, USA	15630106
HF 90/240 Incubator	Heal Force, Switzerland	null
IL-4	PeproTech, USA	042149
L929 cell line	FENGHUISHENGWU, China	NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462)
Laser Scanning Confocal Microscopy	Zeiss, Germany	LSM 980
MONTANE 85 PPI	SEPPIC, France	L12910
MONTANOX 80 PPI	SEPPIC, France	36372K
Mouse IFN-γ ELISA kit	Dakewe, China	1210002
Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit	Dakewe, China	DKW22-2000-096
Mouse IL-17A ELISA kit	Dakewe, China	1211702
Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit	ebiosciences, USA	3521-4HPW-2
Mouse IL-1β ELISA kit	Dakewe, China	1210122
Mouse IL-6 ELISA kit	Dakewe, China	1210602
Mouse TNF-α ELISA kit	Dakewe, China	1217202
Non-essential amino acids(100x)	Invitrogen, USA	11140050
Ophiopogonin-D	Chengdu Purui Technology Co. Ltd	945619-74-9
Penicillin-Streptomycin Solution	Invitrogen, USA	15070063
Phalloidin	Solarbio, China	CA1620
Phosphate Buffered Saline	ZSGB-BIO, China	ZLI-9062
Red Blood Cell Lysis Buffer	Solarbio, China	R1010
RPMI 1640 medium	Hyclone (Life Technology), USA	SH30809.01
Sodium pyruvate(100 mM)	Invitrogen, USA	11360070
Squalene	Sigma, USA	S3626
β- Mercaptoethanol	Invitrogen, USA	21985023