体外 纳米乳剂疫苗佐剂蛇腓磷素D的细胞活性评价

摘要

该协议提供了评估纳米乳剂蛇腓苷D佐剂是否促进有效细胞免疫应答的详细方法。

摘要

作为疫苗的主要成分，佐剂可以直接诱导或增强与抗原相关的强大、广泛、先天和适应性免疫应答。Ophiopogonin D（OP-D）是从植物 Ophiopogon japonicus中提取的纯化成分，已被发现可用作疫苗佐剂。采用低能乳化法制备纳米乳液蛇腓磷素D（NOD）可以有效克服OP-D溶解度低、毒性低的问题。在本文中，研究了一系列用于细胞活性评估的 体外 方案。 使用细胞计数试剂盒-8测定法测定L929的细胞毒性作用。然后，采用ELISA和ELISpot方法检测免疫小鼠脾细胞刺激培养后分泌的细胞因子水平和相应的免疫细胞数。此外，通过激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）观察从C57BL / 6小鼠中分离并在与GM-CSF加IL-4孵育后成熟的骨髓来源树突状细胞（BMDCs）中的抗原摄取能力。重要的是，在用佐剂共培养空白小鼠的腹膜巨噬细胞（PM）24小时后，通过ELISA试剂盒测量IL-1β，IL-6和肿瘤坏死因子α（TNF-α）细胞因子的水平来确认巨噬细胞活化。希望该协议将为其他研究人员提供直接有效的实验方法来评估新型疫苗佐剂的细胞反应有效性。

引言

疫苗是预防和治疗传染病和非传染性疾病的重要手段。在疫苗制剂中适当添加佐剂和递送载体有利于增强抗原的免疫原性并产生持久的免疫应答¹。除了经典的佐剂明矾（铝盐）外，目前上市的疫苗佐剂还有六种:MF59²，3，AS04 3，AS03 3^，AS01 ³，CpG1018⁴和Matrix-M⁵。一般来说，当人体遇到病毒攻击时，第一道和第二级防线（皮肤、粘膜、巨噬细胞）率先清除病毒，最后激活涉及免疫器官和免疫细胞的第三道防线。自 1920 年代初以来，铝盐和铝盐一直是人类疫苗中使用最广泛的佐剂，可引发有效的先天免疫反应⁶。然而，有人提出，经典佐剂激活抗原呈递细胞（APC），刺激免疫细胞产生特定的细胞因子和趋化因子，是佐剂起作用的机制，可能是佐剂仅对特异性^免疫应答产生瞬时作用的原因之一7。有限的人用许可佐剂的存在是开发引起有效免疫反应的疫苗的限制因素⁸。

目前，越来越多的佐剂研究正在证明在小鼠中诱导强烈细胞免疫反应的能力。QS-21已被证明可诱导平衡的T辅助T-1（Th1）和T辅助2（Th2）免疫应答，产生更高水平的抗体滴度，并延长作为佐剂的保护，但其强毒性和溶血特性限制了其作为独立临床佐剂的发展9^，10。OP-D（芦荟皂苷元-O-α-L-鼠李糖吡喃糖1-（1→2）-β-D-吡喃木糖基-（1→3）-β-D-呋喃糖苷）是从中药植物甾本科植物甾体皂苷4中分离出的甾体皂苷^之一。此外，它是在黄桐中发现的主要药理活性成分（神麦山），已知具有一定的药理特性¹¹。此外，它是百合科的成员，因其在细胞炎症和心肌损伤中的抑制和保护作用而被广泛使用。例如，OP-D改善了BALB / c小鼠中DNCB诱导的特应性皮炎样病变和肿瘤坏死因子α（TNF-α）炎性HaCaT细胞¹²。重要的是，OP-D通过减少活性氧的产生和破坏线粒体膜损伤，促进心血管系统的抗氧化保护，并保护心脏免受阿霉素诱导的自噬损伤。实验表明，服用OP-D和单桥粒苷有助于增强免疫健康，增加白细胞计数和DNA合成，并使抗体持续更长时间¹³。先前已发现OP-D具有佐剂作用¹⁴。

纳米乳液是由表面活性剂、油、助表面活性剂和水的组合组成的水包油纳米制剂^12，15。这些纳米疫苗设计允许将抗原和佐剂封装在一起，以增强免疫刺激，保护抗原并促进树突状细胞（DC）成熟¹⁶。为了开发从筛选中获得的这些新型佐剂，重要的是找到适当的方法来评估它们的细胞反应能力。

该协议的目的是系统评估佐剂是否可以增强 体外 细胞培养中的吞噬作用和免疫细胞的表达，并详细说明主要的实验方法。实验分为四个小节:（1）OP-D和NOD对L929细胞的毒性通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测定法确定;（2）通过脾细胞刺激和ELISpot测定检测免疫小鼠内分泌IFN-γ和IL-17A的细胞因子水平以及相应的细胞数;（3）使用共聚焦显微镜观察辅助刺激后DC的抗原呈递能力;（4）检测与佐剂共培养的正常小鼠腹膜巨噬细胞（PMs）获得的上清液中的三种细胞因子IL-1β，IL-6和TNF-α。

研究方案

所有细胞实验均在配备基本手术室、缓冲室、无菌培养室以及鉴定和分析室的细胞工程实验室中进行。工作环境和条件没有微生物污染和其他有害因素。动物实验是根据《实验动物护理和使用指南》进行的，并得到第三军医大学实验动物福利与伦理委员会的批准。

1. 高压灭菌和材料制备

1. 通过在121°C高压灭菌20分钟，通过湿热灭菌来制备试剂和消耗品，例如磷酸盐缓冲盐水（PBS），剪刀，镊子和磨料网。
2. 有关所需的试剂和设备，请参阅 材料表。有关空白纳米乳液（BNE）的分子式，请查看 表1。

2. L929细胞毒性测定

1. 打开水浴并将温度调节到37°C。 从液氮中收集一管冷冻的L929细胞，并在37°C水浴中快速解冻。
2. 解冻后，将细胞快速移液到 15 mL 无菌离心管中，加入 2 mL DMEM，并充分混合。
3. 将样品以129× g 离心5分钟，弃去上清液。然后，加入 2mL DMEM 以重悬细胞，并以 129 x g 再次离心样品 5 分钟。
4. 弃去上清液，加入6mLDMEM完全培养基（含有10%FBS）进行重悬，并转移到37°C培养箱中的T25培养瓶中，用5%CO₂ 培养培养48小时。
5. 将培养基丢弃在培养瓶中，并用2mL PBS洗涤细胞两次。然后，加入1mL的0.25%胰蛋白酶以在37°C下消化细胞1-2分钟。
6. 当观察到细胞变圆时，加入 4 mL DMEM 完全培养基以立即终止消化并充分混合。然后，将细胞吸出到15mL无菌离心管中，并以129× g 离心5分钟。
7. 除去上清液并将细胞重悬于 1 mL DMEM 完全培养基中。使用细胞计数板使用 20 μL 细胞悬液进行细胞计数，并用 DMEM 完全培养基将剩余细胞稀释至 1 x 10⁵ 个细胞/mL。
8. 向 96 孔板的外围添加 100 μL 超纯水，并仅向内部孔中加入 100 μL 细胞稀释剂。将板放入培养箱中，在37°C下进行贴壁培养4小时。
9. 细胞粘附后，在DMEM完全培养基中分别加入OP-D和NOD，最终体积为200μL/孔（每种药物的最终浓度为480μg/mL，240μg/mL，120μg/mL，60μg/mL和30μg/mL）。对于每种浓度，使用三个孔作为重复。然后，将细胞放回培养箱中并再培养24小时。
10. 用 DMEM 完全培养基将 CCK-8 稀释至 10%，并向 96 孔板中加入含有佐剂和细胞溶液的 100 μL/孔稀释液。将板放回培养箱中，再孵育2-3小时。
11. 在电镀细胞溶液时经常混合，以防止由于细胞沉淀而导致的不均匀性。在加入CCK-8之前和之后轻轻摇动板几次，使培养基和CCK-8溶液充分混合。
12. 使用酶标仪测量450nm处的吸光度。设置仅使用培养基和CCK-8的归零孔以获取基线吸光度值。绘图时，通过从获得的吸光度值中减去零化的吸光度值来计算准确的吸光度值。
13. 在使用酶标仪进行测试之前，确认任何孔中不存在气泡，因为气泡会干扰测定。

3.脾细胞刺激

1. 根据第0天，第7天和第14天，通过肌内注射（200μL） 用 30μg蛋白质抗原加30μg佐剂免疫6-8周龄的BALB / c小鼠:（1）PBS组，（2）抗原（Ag）组，（3）抗原+ OP-D（Ag / OP-D）组，（4）抗原+ BNE（Ag / BNE）组， （5）抗原+NOD（Ag/NOD）组，（6）抗原+AlPO₄ （Ag/Al）组。
2. 准备室:在初次免疫后第24天，将小鼠从动物室中取出，并通过腹膜内注射100mg / kg的1%戊巴比妥钠对它们实施安乐死。将小鼠放入玻璃盘中，在75%酒精中浸泡5分钟。
3. 将离心管放在离心管架上，对一次性培养皿进行编号，并用10 mL移液管向每个培养皿中加入5 mL PBS。
4. 在小鼠左腹侧中间用剪刀做一个6-8厘米的切口，撕开皮肤，露出腹壁，找到脾脏的红色长条。
5. 用镊子提起脾脏下侧的腹膜，切开，向上翻转，露出脾脏。用镊子提脾，用眼科剪刀分离脾脏下方的结缔组织，取出脾脏。
6. 将脾脏放入含有5mL PBS的培养皿中，并用筛子（200目，70μm）和研磨棒研磨。研磨后，根据编号将液体转移到带有弯头滴管的 15 mL 离心管中。
7. 将液体以453 x g 离心5分钟。弃去上清液，向每个管中加入3mL红细胞裂解缓冲液，重悬细胞，并在室温下裂解10分钟。
8. 向每个试管中加入 10-12 mL PBS，将试管倒置混合，并以 453 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，向每个离心管中加入 10 mL PBS，并重悬细胞。
9. 在细胞计数板的孔中取 20 μL 的每个样品，并使用自动细胞计数器记录活细胞的数量。
10. 将样品以453× g 离心5分钟，弃去上清液。重悬细胞，用RF-10培养基稀释至2.5 x 10⁶ 个细胞/mL（配方信息见 表2），并以100μL/孔的速度加入96孔板中。
11. 用RF-10培养基将抗原稀释至10μg/ mL，向每个孔中加入100μL，并在37°C的5%CO₂中孵育3天。
12. 在1.5mL离心管中吸出从每组细胞中获得的细胞悬液，以453× g 离心20分钟，并将上清液吸出到干净的离心管中。
13. 严格按照 ELISA 试剂盒说明进行 IFN-γ 和 IL-17A 含量检测。方法和程序如下。
14. 在试剂盒随附的稀释缓冲液R [1x]中制备1x洗涤缓冲液工作溶液（将细胞因子标准溶液稀释至500 pg/mL、250 pg/mL、125 pg/mL、62.5 pg/mL、31.3 pg/mL和15.6 pg/mL），生物素化抗体工作溶液（使用试剂盒随附的稀释缓冲液R [1x]将生物素化抗体溶液稀释至1:100以形成工作溶液）， 和链霉亲和素-HRP工作溶液。
15. 向标准孔中加入100 μL/孔的稀释细胞因子标准溶液，将100 μL/孔的样品加入样品孔中（试剂盒随附的稀释缓冲液R [1x]用于样品稀释），将100 μL/孔的稀释缓冲液R （1x）加入空白对照孔中。
16. 加入 50 μL/孔的生物素化抗体工作溶液。充分混合，用密封膜覆盖，并在37°C下孵育90分钟。
17. 从孔中取出液体，并以 300 μL/孔加入 1x 洗涤缓冲液工作溶液。1分钟后从孔中丢弃液体。重复此过程 4 次，使液体每次在滤纸上干燥。
18. 加入 100 μL/孔的链霉亲和素-HRP 工作溶液。盖上并在37°C孵育样品30分钟。将样品以453× g 离心5分钟，弃去上清液。
    注意:洗涤过程中残留在反应孔中的洗涤溶液应彻底拍打，直到滤纸上看不到水印。
19. 在100μL/孔下加入TMB，将板在37°C下在黑暗中孵育5-30分钟，并根据孔中颜色的深度（深蓝色）判断终止反应。通常，10-20分钟的显色可以达到良好的效果。
20. 通过加入 100 μL/孔的终止溶液快速终止反应。终止后10分钟内检测450nm处的吸光度值。
    注意:使用前在室温下平衡试剂30分钟。

4. 酶联体检测

1. 完全按照上述步骤3.1-3.10中所述对小鼠进行免疫和脾细胞的收集。严格按照试剂盒说明进行IFN-γ和IL-17A的检测。方法和程序如下。
2. 从密封包装中取出板，用无菌PBS（200μL/孔）洗涤4次，然后加入1640完全培养基（200μL/孔）以在室温下平衡2小时。
3. 取出培养基并用 RF-10 培养基将脾细胞悬液稀释至 2 x 10⁵ 个细胞/mL，每孔加入 50 μL 细胞和抗原（终浓度:10 μg/mL）。
4. 将板置于37°C的加湿培养箱中，用5%CO₂ 放置48小时。在此期间不要移动板，并采取措施避免蒸发（例如，用铝箔包裹板）。
5. 将检测抗体 （BVD6-24G2-生物素） 稀释至 1 μg/mL （1:1，000） 在含有 0.5% 胎牛血清 （PBS-0.5% FBS） 的磷酸盐缓冲盐水 （0.5 mL:100 mL） 中。向板中加入100μL /孔，并通过0.22μm膜过滤后在室温下孵育2小时。
6. 倒出孔中的液体，以 200 μL/孔加入 1x 洗涤缓冲液，然后洗涤 5 次。每次放置30-60秒，最后一次，在吸墨纸上干燥。
7. 在PBS-0.5%FBS中稀释链霉亲和素-辣根过氧化物酶（1:1，000），并加入100μL/孔。将板在室温下孵育1小时。按照步骤4.6清洗盘子。
8. 加入 100 μL/孔即用型 TMB 底物溶液并显影直至出现清晰斑点。通过在去离子水中大量洗涤（反复冲洗5x-6x）来阻止显色。如有必要，取下涵洞（板下的软塑料），然后冲洗膜的下侧。
9. 板干燥后，在ELISpot读数仪或解剖显微镜上检查并计数斑点。

5. 发展中国家对发展中国家的吸收

1. 通过腹膜内注射100mg / kg的1%戊巴比妥钠对BALB / c正常小鼠实施安乐死。将小鼠浸泡在75%酒精中5分钟。
2. 用剪刀在小鼠腹部下方切一个6-8厘米的切口，夹住开口的两端，使其向不同方向分开，露出小鼠的腿。将小鼠股骨与小鼠身体分开，将胫骨与关节分开，并保持两端骨骼完整。
3. 用剪刀和镊子从股骨两端的关节中去除残留的组织和软骨。将股骨浸泡在75%酒精中5分钟，然后浸泡在无菌PBS溶液中以洗去表面酒精。
4. 用剪刀剪掉股骨的末端，并在无菌培养皿中用无菌PBS溶液冲洗骨髓，然后用1mL注射器抽吸。重复洗涤3x-5x。
5. 用细胞筛（200目，70μm）过滤，并将BMDC收集到15 mL离心管中。将样品以290× g 离心5分钟。弃去上清液，加入4mL红细胞裂解缓冲液，重悬，并在室温下裂解5分钟。
6. 加入 10 mL 无菌 PBS 溶液以中和裂解物，以 290 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
7. 将细胞重悬于含有 1% 青霉素-链霉素溶液和 10% FBS 的 1 mL DMEM 中并计数。然后，向培养基中加入GM-CSF（20ng / mL）加IL-4（10ng / mL），将细胞浓度调节至5 x 10^{5 /} mL，并在盖玻片上接种细胞。
8. 将细胞悬液以2mL /孔加入6孔板中，并将板置于37°C的加湿培养箱中，用5%CO₂ 放置48小时。2天后完全更换培养基，4天后更换一半培养基。
9. 在培养的第七天，使用倒置显微镜以100倍放大倍率选择五个细胞状况良好的孔（细胞表面具有树突状突起的大而射线可透的细胞），以进行实验。弃去上清液，向每个孔中加入 2 mL GFP、OP-D + GFP 和用 DMEM 完全培养基稀释的 NOD + GFP 溶液（GFP 终浓度:20 μg/mL;佐剂终浓度:10 μg/mL），并将板在 37 °C 下在黑暗中孵育 30 分钟。
10. 用PBS洗涤板3次，向每个孔中加入1mL的4%多聚甲醛，并在室温下孵育15分钟。固定后除去多聚甲醛，用鬼笔环肽和DAPI孵育细胞至终浓度10μg/ mL染色10分钟，然后用PBS洗涤3x。
11. 向每个孔中加入 1 mL PBS，并使用 CLSM 观察抗原摄取，如下所述。
    1. 打开 CLSM 软件，单击 ZEN 系统，等待硬件初始化完成。
    2. 单击定位选项卡中的 GFP 和 DAPI 快捷方式以查找可以观察的区域。关闭荧光灯和透射光。
    3. 单击采集菜单中的 智能设置 以打开染料库，并添加三种荧光染料:EGFP、鬼笔环肽和 DAPI。点击 最佳信号 > 确定。单击频道选项卡中的 EGFP 频道，然后单击 实时 以在右侧界面上选择正确的视野。
    4. 选择 1个AU 作为针孔，旋转细聚焦螺钉调整焦距，并选择合适的焦平面。单击 范围指示器 并调整激光功率和主增益的组合，以便图像上仅出现零星的红点。
    5. 使用相同的参数调整鬼笔环肽和DAPI通道，而无需更改激光功率。
    6. 选择停止直播，然后单击采集模式以更改拍摄参数: 帧尺寸:1024像素x 1024像素;扫描速度:7;平均:2倍。单击快照并选择拆分以查看拍摄的所有图像。保存图像。

6.巨噬细胞活化

1. 安乐死后将C57BL / 6小鼠浸入75%酒精中，并按编号顺序将它们面朝上放入玻璃培养皿中。
2. 将小鼠通过转移窗口进入无菌手术室，并放在手术台上5分钟。
3. 使用注射器吸出10mL盐水，将小鼠向下倾斜约45°，然后注射到腹腔中间。每 10 mL 将约 5 mL 细胞悬液吸入 15 mL 离心管中，重复注射 3 次。
4. 将细胞悬液以129× g 离心5分钟以获得小鼠腹膜原代巨噬细胞。重悬细胞，用RPMI 1640完全培养基（含有10%FBS）将细胞浓度调节至2 x 10⁶ 个细胞/ mL，并将细胞悬液接种在24孔板中，以确保每孔细胞数量一致（1 mL /孔）。
5. 在37°C下在5%CO₂ 中培养过夜（约16-20小时），然后与PBS，Ag，Ag / OP-D，Ag / NOD和Ag / Al（银终浓度:5μg/ mL;佐剂终浓度:10μg/ mL;总体积:2mL）孵育24小时。使用步骤3.12-3.19中描述的方法和程序，用ELISA试剂盒检测培养物上清液中IL-1β，IL-6和TNF-α的水平。

结果

佐剂OP-D和NOD的细胞活性评估根据方案在 体外 完成。L929成纤维细胞是NOD体 外 毒性测试的有用筛选模型（图1）。脾脏中炎性细胞因子水平的定量可以帮助研究人员更好地了解免疫反应（图2）。使用ELISpot监测CTL是在临床试验中评估抗原特异性T细胞免疫和筛选候选疫苗的金标准（图3）。DC对抗原摄取的增加可以引发增...

讨论

亚单位疫苗具有极佳的安全性，但免疫原性较差。增强免疫原性的主要策略是物理吸附抗原或偶联佐剂，并将其纳入药物递送系统，以促进DC的摄取和呈递。 天然植物皂苷如奎莱皂苷及其衍生物剧毒，不适合开发人类疫苗¹⁷。因此，研究疫苗或佐剂对细胞的毒性作用是评价新疫苗的必要第一步。

本研究中提出的方案是根据ISO 10993-5:2009¹⁸进行...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	GIBCO, USA	25200056
96-well filter plates	Millipore. Billerica, MA	CLS3922
AlPO4	General Chemical Company, USA	null
Automated Cell Counter	Countstar, China	IC1000
BALB/c mice and C57BL/6 mice	Beijing HFK Bioscience Co. Ltd	null
caprylic/capric triglyceride (GTCC)	Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China	null
CCK-8 kits	Dojindo, Japan	CK04
Cell Counting Plate	Costar, Corning, USA	CO010101
Cell Sieve	biosharp, China	BS-70-CS
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D9542
DMEM basic(1x) medium	GIBCO, USA	C11885500BT
DSZ5000X Inverted Microscope	Nikon,Japan	DSZ5000X
EL-35 (Cremophor-35)	Mumbai, India	null
ELISpot classic	AID, Germany	ELR06
Fetal Bovine Serum	GIBCO, USA	10099141C
Full-function Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific, USA	VL0000D2
GFP	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P42212
Glutamax	Invitrogen, USA	35050061
Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor	GM-CSF, R&D Systems, USA	315-03
HEPES	Invitrogen, USA	15630106
HF 90/240 Incubator	Heal Force, Switzerland	null
IL-4	PeproTech, USA	042149
L929 cell line	FENGHUISHENGWU, China	NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462)
Laser Scanning Confocal Microscopy	Zeiss, Germany	LSM 980
MONTANE 85 PPI	SEPPIC, France	L12910
MONTANOX 80 PPI	SEPPIC, France	36372K
Mouse IFN-γ ELISA kit	Dakewe, China	1210002
Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit	Dakewe, China	DKW22-2000-096
Mouse IL-17A ELISA kit	Dakewe, China	1211702
Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit	ebiosciences, USA	3521-4HPW-2
Mouse IL-1β ELISA kit	Dakewe, China	1210122
Mouse IL-6 ELISA kit	Dakewe, China	1210602
Mouse TNF-α ELISA kit	Dakewe, China	1217202
Non-essential amino acids(100x)	Invitrogen, USA	11140050
Ophiopogonin-D	Chengdu Purui Technology Co. Ltd	945619-74-9
Penicillin-Streptomycin Solution	Invitrogen, USA	15070063
Phalloidin	Solarbio, China	CA1620
Phosphate Buffered Saline	ZSGB-BIO, China	ZLI-9062
Red Blood Cell Lysis Buffer	Solarbio, China	R1010
RPMI 1640 medium	Hyclone (Life Technology), USA	SH30809.01
Sodium pyruvate(100 mM)	Invitrogen, USA	11360070
Squalene	Sigma, USA	S3626
β- Mercaptoethanol	Invitrogen, USA	21985023