In vitro Bewertung der zellulären Aktivität des Nanoemulsionsimpfstoff-Adjuvans Ophiopogonin D

Zusammenfassung

Das Protokoll enthält detaillierte Methoden, um zu beurteilen, ob die Nanoemulsion Ophiopogonin D Adjuvans eine effektive zelluläre Immunantwort fördert.

Zusammenfassung

Als Hauptbestandteil von Impfstoffen können Adjuvantien die starken, weit verbreiteten, angeborenen und adaptiven Immunantworten, die mit Antigenen verbunden sind, direkt induzieren oder verstärken. Ophiopogonin D (OP-D), eine gereinigte Komponente, die aus der Pflanze Ophiopogon japonicus extrahiert wird, hat sich als nützliches Impfstoff-Adjuvans erwiesen. Die Probleme der geringen Löslichkeit und Toxizität von OP-D können durch die Verwendung eines niederenergetischen Emulgierungsverfahrens zur Herstellung der Nanoemulsion Ophiopogonin D (NOD) effektiv überwunden werden. In diesem Artikel wird eine Reihe von In-vitro-Protokollen zur Bewertung der Zellaktivität untersucht. Die zytotoxischen Wirkungen von L929 wurden mit einem Zellzähl-Kit-8-Assay bestimmt. Dann wurden die sezernierten Zytokinspiegel und die entsprechenden Immunzellzahlen nach der Stimulation und Kultur von Splenozyten von immunisierten Mäusen durch ELISA- und ELISpot-Methoden nachgewiesen. Darüber hinaus wurde die Antigenaufnahmefähigkeit in aus dem Knochenmark stammenden dendritischen Zellen (BMDCs), die aus C57BL/6-Mäusen isoliert und nach Inkubation mit GM-CSF plus IL-4 gereift waren, durch konfokale Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) beobachtet. Wichtig ist, dass die Makrophagenaktivierung durch die Messung der Zytokine von IL-1β, IL-6 und Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) durch ELISA-Kits bestätigt wurde, nachdem Peritonealmakrophagen (PMs) von leeren Mäusen mit dem Adjuvans für 24 Stunden kokulturiert wurden. Es ist zu hoffen, dass dieses Protokoll anderen Forschern direkte und effektive experimentelle Ansätze zur Verfügung stellen wird, um die Wirksamkeit der zellulären Reaktion neuartiger Impfstoffadjuvantien zu bewerten.

Einleitung

Impfstoffe sind ein wichtiges Mittel zur Verhütung und Behandlung von Infektionskrankheiten und nichtübertragbaren Krankheiten. Die angemessene Zugabe von Adjuvantien und Verabreichungsvehikeln zu Impfstoffformulierungen ist vorteilhaft für die Verbesserung der Immunogenität von Antigenen und die Erzeugung lang anhaltender Immunantworten¹. Neben dem klassischen Adjuvans Alaun (Aluminiumsalz) gibt es sechs Arten von Adjuvantien für Impfstoffe, die derzeit auf dem Markt sind: MF59^2,3, AS04 3, AS03 3, AS01 ^3, CpG1018⁴ und Matrix-M⁵. Wenn der menschliche Körper auf einen Virusangriff trifft, übernehmen im Allgemeinen die erste und zweite Verteidigungslinie (Haut, Schleimhaut und Makrophagen) die Führung bei der Beseitigung des Virus, und schließlich wird die dritte Verteidigungslinie, an der die Immunorgane und Immunzellen beteiligt sind, aktiviert. Aluminium und Aluminiumsalze sind seit den frühen 1920er Jahren die am häufigsten verwendeten Adjuvantien für Impfstoffe beim Menschen und lösen eine wirksame angeborene Immunantwort aus⁶. Es wurde jedoch vorgeschlagen, dass die Aktivierung von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) durch klassische Adjuvantien, die die Immunzellen dazu anregen, spezifische Sätze von Zytokinen und Chemokinen zu erzeugen, der Mechanismus ist, durch den Adjuvantien wirken und einer der Gründe sein kann, warum Adjuvantien nur vorübergehende Wirkungen auf spezifische Immunantworten ausüben⁷. Das Vorhandensein von begrenzt zugelassenen Adjuvantien für den menschlichen Gebrauch ist ein einschränkender Faktor für die Entwicklung von Impfstoffen, die wirksame Immunantworten hervorrufen⁸.

Derzeit zeigen immer mehr adjuvante Studien die Fähigkeit, eine starke zelluläre Immunantwort bei Mäusen zu induzieren. Es wurde gezeigt, dass QS-21 eine ausgewogene T-Helfer-1 (Th1) und T-Helfer 2 (Th2) Immunantwort induziert, höhere Konzentrationen von Antikörpertitern produziert und den Schutz als Adjuvans verlängert, aber seine starke Toxizität und hämolytischen Eigenschaften begrenzen seine Entwicklung als eigenständiges klinisches Adjuvans ^9,10. OP-D (Ruscogenin-O-α-L-rhamnopyranosy1-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-fucopyranosid) ist eines der steroidalen Saponine, die aus der Wurzel der chinesischen Heilpflanze Ophiopogon japonicas⁴ isoliert wurden. Darüber hinaus ist es die pharmakologisch aktive Hauptkomponente (Shen Mai San), die in Radix Ophiopogonis gefunden wird und von der bekannt ist, dass sie bestimmte pharmakologische Eigenschaften aufweist¹¹. Darüber hinaus ist es ein Mitglied der Familie der Liliaceae und wird häufig wegen seiner hemmenden und schützenden Wirkung bei zellulären Entzündungen und Myokardverletzungen verwendet. Zum Beispiel verbessert OP-D DNCB-induzierte atopische Dermatitis-ähnliche Läsionen und Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) entzündliche HaCaT-Zellen in BALB/c-Mäusen¹². Wichtig ist, dass OP-D den antioxidativen Schutz des Herz-Kreislauf-Systems fördert und das Herz vor Doxorubicin-induzierten autophagischen Verletzungen schützt, indem es sowohl die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies als auch die Schädigung der mitochondrialen Membran reduziert. Experimente haben gezeigt, dass die Einnahme von OP-D mit Monodesmosid dazu beiträgt, die Immungesundheit zu stärken, die Anzahl der weißen Blutkörperchen und die DNA-Synthese zu erhöhen und die Antikörper länger haltbar zu machen¹³. Es wurde bereits festgestellt, dass OP-D eine adjuvante Wirkung^{hat 14}.

Nanoemulsionen sind Öl-in-Wasser-Nanoformulierungen, die aus einer Kombination von Tensiden, Öl, Cotensiden und Wasser^12,15 bestehen. Diese Nanoimpfstoff-Designs ermöglichen es, Antigene und Adjuvantien zusammen zu verkapseln, um die Immunstimulation zu verbessern, die Antigene zu schützen und die Reifung der dendritischen Zellen (DC) zu fördern¹⁶. Für die Entwicklung dieser neuartigen Adjuvantien, die aus dem Screening gewonnen werden, ist es wichtig, geeignete Methoden zu finden, um ihre zellulären Reaktionsfähigkeiten zu bewerten.

Ziel dieses Protokolls ist es, systematisch zu bewerten, ob Adjuvantien die Phagozytose und die Expression von Immunzellen in In-vitro-Zellkulturen verbessern können, und die wichtigsten experimentellen Methoden zu erläutern. Das Experiment ist in vier Unterabschnitte unterteilt: (1) Die Toxizität von OP-D und NOD für L929-Zellen wird durch den Zellzählkit-8 (CCK-8) Assay bestimmt; (2) Die Zytokinspiegel von endokrinem IFN-γ und IL-17A und die entsprechenden Zellzahlen in immunisierten Mäusen werden durch Splenozytenstimulation und ELISpot-Assays nachgewiesen. (3) Die Antigenpräsentationsfähigkeit von DCs nach adjuvanter Stimulation wird mittels konfokaler Mikroskopie beobachtet. und (4) die drei Arten von Zytokinen, IL-1β, IL-6 und TNF-α, in den Überständen nachgewiesen werden, die aus Peritonealmakrophagen (PMs) in normalen Mäusen gewonnen werden, die mit Adjuvantien kokultiviert wurden.

Protokoll

Alle Zellexperimente wurden in einem zelltechnischen Labor durchgeführt, das mit einfachen Operationssälen, Pufferräumen, sterilen Kulturräumen sowie Identifikations- und Analyseräumen ausgestattet war. Die Arbeitsumgebung und die Arbeitsbedingungen waren frei von mikrobieller Kontamination und anderen schädlichen Faktoren. Die Tierversuche wurden auf der Grundlage der Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt und von der Versuchstierschutz- und Ethikkommission der Dritten Militärmedizinischen Universität genehmigt.

1. Autoklavieren und Materialaufbereitung

1. Bereiten Sie die Reagenzien und Verbrauchsmaterialien wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), Schere, Pinzette und Schleifgewebe durch Sterilisation mit feuchter Hitze durch Autoklavieren bei 121 °C für 20 min vor.
2. Informationen zu den erforderlichen Reagenzien und Geräten finden Sie in der Materialtabelle. Die Formel der Blank-Nanoemulsion (BNE) finden Sie in Tabelle 1.

2. L929 Zytotoxizitätstest

1. Schalten Sie das Wasserbad ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein. Ein Röhrchen gefrorener L929-Zellen wird aus flüssigem Stickstoff entnommen und in einem 37 °C warmen Wasserbad schnell aufgetaut.
2. Pipettieren Sie die Zellen schnell nach dem Auftauen in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 2 ml DMEM hinzu und mischen Sie gut.
3. Die Proben werden bei 129 x g 5 min lang zentrifugiert und der Überstand verworfen. Fügen Sie dann 2 ml DMEM hinzu, um die Zellen zu resuspendieren, und zentrifugieren Sie die Proben erneut bei 129 x g für 5 Minuten.
4. Der Überstand wird verworfen, 6 ml vollständiges DMEM-Medium (mit 10 % FBS) zur Resuspension zugegeben und 48 h in einen T25-Kulturkolben in einem 37 °C-Inkubator mit 5 %_CO2 in die Kultur überführt.
5. Entsorgen Sie das Nährmedium im Kulturkolben und waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml PBS. Dann fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin hinzu, um die Zellen für 1-2 min bei 37 ° C zu verdauen.
6. Wenn eine Rundung der Zellen beobachtet wird, fügen Sie 4 ml DMEM-Füllmedium hinzu, um die Verdauung sofort zu beenden und gut zu mischen. Anschließend werden die Zellen in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen abgesaugt und bei 129 x g für 5 min zentrifugiert.
7. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml DMEM-Vollmedium. Verwenden Sie eine 20 μL Zellsuspension für die Zellzählung mit Zellzählplatten und verdünnen Sie die verbleibenden Zellen auf 1 x 10⁵ Zellen/ml mit DMEM-Füllmedium.
8. Geben Sie 100 μL Reinstwasser an den Rand einer 96-Well-Platte und geben Sie 100 μL Zellverdünnungsmittel nur in die internen Vertiefungen. Legen Sie die Platte für 4 h bei 37 °C in den Inkubator für adhärente Kultur.
9. Nachdem die Zellen anhaften, fügen Sie OP-D und NOD separat im vollständigen DMEM-Medium zu einem Endvolumen von 200 μl / Well hinzu (die Endkonzentrationen jedes Arzneimittels betragen 480 μg / ml, 240 μg / ml, 120 μg / ml, 60 μg / ml und 30 μg / ml). Verwenden Sie für jede Konzentration drei Vertiefungen als Replikate. Dann legen Sie die Zellen für weitere 24 Stunden zurück in den Inkubator und kultivieren Sie.
10. CCK-8 wird mit vollständigem DMEM-Medium auf 10 % verdünnt und 100 μL/Well-Verdünnungen, die das Adjuvans und die Zelllösungen enthalten, in die 96-Well-Platte gegeben. Legen Sie die Platte zurück in den Inkubator und inkubieren Sie für weitere 2-3 h.
11. Mischen Sie häufig, während Sie die Zelllösung plattieren, um Inhomogenität durch Zellausfällung zu vermeiden. Schütteln Sie die Platte vor und nach der Zugabe des CCK-8 vorsichtig mehrmals, um das Medium und die CCK-8-Lösung gut zu mischen.
12. Die Extinktion wird bei 450 nm mit einem Mikrotiterplatten-Reader gemessen. Richten Sie eine Nullbohrung mit nur Medium und CCK-8 ein, um einen Absorptionswert zu erhalten. Berechnen Sie genaue Extinktionswerte, indem Sie beim Plotten den Null-Absorptionswert vom erhaltenen Absorptionswert subtrahieren.
13. Vergewissern Sie sich, dass keine Blasen in den Vertiefungen vorhanden sind, bevor Sie mit dem Mikrotiterplatten-Reader testen, da die Blasen den Assay stören.

3. Stimulation der Splenozyten

1. Immunisierung von BALB/c-Mäusen im Alter von 6-8 Wochen mit 30 μg Proteinantigen plus 30 μg Adjuvans über eine intramuskuläre Injektion (200 μl) an Tag 0, Tag 7 und Tag 14 gemäß den folgenden Versuchsgruppen: (1) PBS-Gruppe, (2) Antigengruppe (Ag), (3) Antigen + OP-D (Ag/OP-D)-Gruppe, (4) Antigen + BNE (Ag/BNE)-Gruppe, (5) Antigen + NOD (Ag/NOD) Gruppe und (6) Antigen + AlPO₄ (Ag/Al) Gruppe.
2. Vorbereitungsraum: Am 24. Tag nach der Grundimmunisierung werden die Mäuse aus dem Tierraum entnommen und durch eine intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg 1%igem Natriumpentobarbital eingeschläfert. Die Mäuse in eine Glasschale geben und 5 Minuten in 75% Alkohol einweichen.
3. Legen Sie die Zentrifugenröhrchen auf ein Zentrifugenröhrchengestell, nummerieren Sie die Einweg-Petrischalen und geben Sie 5 ml PBS mit einer 10-ml-Pipette in jede Petrischale.
4. Machen Sie einen 6-8 cm langen Schnitt mit einer Schere in der Mitte der linken Bauchseite der Maus, reißen Sie die Haut auf, legen Sie die Bauchdecke frei und lokalisieren Sie den langen roten Streifen der Milz.
5. Heben Sie das Peritoneum auf der unteren Seite der Milz mit einer Pinzette an, schneiden Sie es auf und drehen Sie es nach oben, um die Milz freizulegen. Heben Sie die Milz mit einer Pinzette an, trennen Sie das Bindegewebe unter der Milz mit einer Augenschere und entfernen Sie die Milz.
6. Die Milz in eine Petrischale mit 5 ml PBS geben und mit einem Sieb (200 mesh, 70 μm) und einem Mahlstab mahlen. Nach dem Mahlen wird die Flüssigkeit entsprechend der Nummerierung in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit einem Winkeltropfer überführt.
7. Zentrifugieren Sie die Flüssigkeit bei 453 x g für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand, geben Sie 3 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen in jedes Röhrchen, resuspendieren Sie die Zellen und lysieren Sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
8. Geben Sie 10-12 ml PBS in jedes Röhrchen, mischen Sie das Röhrchen kopfüber und zentrifugieren Sie es bei 453 x g für 5 Minuten. Verwerfen Sie den Überstand, geben Sie 10 ml PBS in jedes Zentrifugenröhrchen und resuspendieren Sie die Zellen.
9. Nehmen Sie 20 μL jeder Probe in eine Vertiefung der Zellzählplatte und erfassen Sie die Anzahl der lebenden Zellen mit einem automatisierten Zellzähler.
10. Die Proben werden bei 453 x g 5 min lang zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Zellen resuspendieren, auf 2,5 x 10⁶ Zellen/ml mit RF-10-Medium verdünnen (Formulierungsinformationen in Tabelle 2) und bei 100 μl/Well auf eine 96-Well-Platte geben.
11. Das Antigen wird mit RF-10-Medium auf 10 μg/ml verdünnt, 100 μl in jede Vertiefung gegeben und 3 Tage bei 37 °C in 5%_CO2 inkubiert.
12. Die aus jeder Zellgruppe erhaltene Zellsuspension wird in 1,5 ml Zentrifugenröhrchen abgesaugt, 20 Minuten lang bei 453 x g zentrifugiert und der Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen abgesaugt.
13. Führen Sie die IFN-γ- und IL-17A-Inhaltserkennung streng gemäß den Anweisungen des ELISA-Kits durch. Die Methoden und Verfahren sind wie folgt.
14. Bereiten Sie 1x Waschpuffer-Arbeitslösung (im Lieferumfang enthalten), Standard-Gradientenkonzentrationslösung (verdünnte Zytokin-Standardlösung auf 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62,5 pg/ml, 31,3 pg/ml und 15,6 pg/ml in dem mit dem Kit gelieferten Verdünnungspuffer R [1x]), biotinylierte Antikörper-Arbeitslösung (verdünnte biotinylierte Antikörperlösung auf 1:100 unter Verwendung des mit dem Kit gelieferten Verdünnungspuffers R [1x] zur Bildung der Arbeitslösung), und Streptavidin-HRP-Arbeitslösung nach Bedarf.
15. Geben Sie 100 μl/Well verdünnte Zytokin-Standardlösung in die Standardvertiefung, 100 μL/Well der Probe in die Probenvertiefung (der mit dem Kit gelieferte Verdünnungspuffer R [1x] wird für die Probenverdünnung verwendet) und 100 μL/Well des Verdünnungspuffers R (1x) in die Blindkontrollmulde.
16. Fügen Sie eine biotinylierte Antikörper-Arbeitslösung in einer Dosis von 50 μl/well hinzu. Gut mischen, mit einer Dichtungsmembran abdecken und bei 37 °C 90 min inkubieren.
17. Entfernen Sie die Flüssigkeit aus den Vertiefungen und fügen Sie 1x Waschpuffer-Arbeitslösung bei 300 μL/Welle hinzu. Entsorgen Sie die Flüssigkeit nach 1 Minute aus den Vertiefungen. Wiederholen Sie diesen Vorgang 4x und lassen Sie die Flüssigkeit jedes Mal auf Filterpapier trocknen.
18. Fügen Sie 100 μl/Well Streptavidin-HRP-Arbeitslösung hinzu. Die Proben werden abgedeckt und 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Proben werden bei 453 x g 5 min lang zentrifugiert und der Überstand verworfen.
    HINWEIS: Die Waschlösung, die während des Waschvorgangs in der Reaktionsmulde verbleibt, sollte gründlich abgeklopft werden, bis kein Wasserzeichen mehr auf dem Filterpapier zu sehen ist.
19. TMB bei 100 μL/Welle zugeben, die Platten bei 37 °C für 5-30 min im Dunkeln inkubieren und die Abbruchreaktion entsprechend der Farbtiefe in der Vertiefung (dunkelblau) beurteilen. In der Regel können 10-20 Minuten für die Farbentwicklung gute Ergebnisse erzielen.
20. Beenden Sie die Reaktion schnell durch Zugabe von Stopplösung bei 100 μl/Well. Der Extinktionswert bei 450 nm ist innerhalb von 10 Minuten nach Beendigung zu bestimmen.
    HINWEIS: Gleichgewichten Sie das Reagenz vor Gebrauch 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

4. ELISpot-Assay

1. Führen Sie die Immunisierung der Mäuse und die Entnahme von Splenozyten genau wie in den Schritten 3.1-3.10 oben beschrieben durch. Führen Sie die Tests für IFN-γ und IL-17A in strikter Übereinstimmung mit den Anweisungen des Kits durch. Die Methoden und Verfahren sind wie folgt.
2. Nehmen Sie die Platte aus der versiegelten Verpackung, waschen Sie sie 4x mit sterilem PBS (200 μL/Well) und fügen Sie 1640 komplettes Kulturmedium (200 μL/Well) hinzu, um sie bei Raumtemperatur für 2 h auszugleichen.
3. Entfernen Sie das Medium und verdünnen Sie die Splenozytensuspension mit RF-10-Medium auf 2 x 10⁵ Zellen/ml, wobei 50 μL Zellen und Antigen pro Vertiefung hinzugefügt werden (Endkonzentration: 10 μg/ml).
4. Stellen Sie die Platte in einen befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5%_CO2 für 48 h. Bewegen Sie die Platte während dieser Zeit nicht und ergreifen Sie Maßnahmen, um Verdunstung zu vermeiden (z. B. die Platte mit Alufolie umwickeln).
5. Verdünnen Sie den Nachweisantikörper (BVD6-24G2-Biotin) auf 1 μg/ml (1:1.000) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,5 ml:100 ml), die 0,5 % fötales Rinderserum (PBS-0,5 % FBS) enthält. Geben Sie 100 μL/Well in die Platte und inkubieren Sie sie nach der Filtration durch eine 0,22 μm Membran 2 h bei Raumtemperatur.
6. Dekantieren Sie die Flüssigkeit in den Vertiefungen, geben Sie 1x Waschpuffer bei 200 μL/Well, und waschen Sie 5x. Jeweils 30-60 s einwirken lassen und ein letztes Mal auf Löschpapier trocknen lassen.
7. Verdünnen Sie die Streptavidin-Meerrettichperoxidase (1:1.000) in PBS-0,5% FBS und fügen Sie 100 μL/Well hinzu. Inkubieren Sie die Platte für 1 h bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Platte wie in Schritt 4.6.
8. Fügen Sie 100 μL/Well gebrauchsfertige TMB-Substratlösung hinzu und entwickeln Sie, bis ein klarer Fleck erscheint. Stoppen Sie die Farbentwicklung, indem Sie ausgiebig in entionisiertem Wasser waschen (5x-6x wiederholt spülen). Entfernen Sie bei Bedarf den Düker (den weichen Kunststoff unter der Platte) und spülen Sie die Unterseite der Membran ab.
9. Untersuchen und zählen Sie die Flecken auf einem ELISpot-Lesegerät oder Seziermikroskop, nachdem die Platte getrocknet ist.

5. Aufnahme durch die Entwicklungsländer

1. Einschläferung normaler BALB/c-Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg 1%igem Natriumpentobarbital. Die Mäuse 5 Minuten lang in 75% Alkohol einweichen.
2. Schneiden Sie mit einer Schere einen 6-8 cm langen Schnitt unter dem Bauch der Maus und klemmen Sie die beiden Enden der Öffnung ein, um sie in verschiedene Richtungen zu trennen und die Beine der Maus freizulegen. Trennen Sie den Oberschenkelknochen der Maus vom Körper der Maus und das Schienbein vom Gelenk und halten Sie die Knochen an beiden Enden intakt.
3. Entfernen Sie das restliche Gewebe und den Knorpel aus den Gelenkgelenken an beiden Enden des Oberschenkelknochens mit Schere und Pinzette. Weichen Sie die Oberschenkelknochen 5 Minuten lang in 75% igem Alkohol ein und weichen Sie sie dann in steriler PBS-Lösung ein, um den Oberflächenalkohol abzuwaschen.
4. Schneiden Sie die Enden der Oberschenkelknochen mit einer Schere ab und spülen Sie das Knochenmark in einer sterilen Petrischale mit steriler PBS-Lösung ab, gefolgt von einer Aspiration mit einer 1-ml-Spritze. Wiederholen Sie das Waschen 3x-5x.
5. Mit einem Zellsieb (200 mesh, 70 μm) filtrieren und die BMDCs in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen sammeln. Zentrifugieren Sie die Proben bei 290 x g für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand, fügen Sie 4 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen hinzu, resuspendieren Sie und lysieren Sie bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
6. Fügen Sie 10 ml sterile PBS-Lösung hinzu, um das Lysat zu neutralisieren, zentrifugieren Sie bei 290 x g für 5 min und verwerfen Sie den Überstand.
7. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml DMEM, das 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung und 10% FBS enthält, und zählen Sie. Geben Sie dann GM-CSF (20 ng / ml) plus IL-4 (10 ng / ml) in das Medium, stellen Sie die Zellkonzentration auf 5 x 10⁵ / ml ein und impfen Sie die Zellen auf Deckgläsern.
8. Die Zellsuspension wird auf eine 6-Well-Platte mit 2 ml/Vertiefung gegeben und 48 h lang bei 37 °C mit 5 %_CO2 in einen befeuchteten Inkubator gestellt. Wechseln Sie das Medium nach 2 Tagen vollständig und wechseln Sie die Hälfte des Mediums nach 4 Tagen.
9. Wählen Sie fünf Vertiefungen mit Zellen in gutem Zustand (große und röntgendurchlässige Zellen mit dendritischen Vorsprüngen auf der Zelloberfläche) mit einem inversen Mikroskop mit 100-facher Vergrößerung für das Experiment am siebten Tag der Kultur. Verwerfen Sie den Überstand, geben Sie 2 ml GFP-, OP-D + GFP- und NOD + GFP-Lösungen, verdünnt mit DMEM-Komplettmedium (GFP-Endkonzentration: 20 μg/ml; adjuvante Endkonzentration: 10 μg/ml) in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 30 min im Dunkeln.
10. Waschen Sie die Platten 3x mit PBS, geben Sie 1 ml 4% Paraformaldehyd in jede Vertiefung und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 15 min. Entfernen Sie das Paraformaldehyd nach der Fixierung, inkubieren Sie die Zellen mit Phalloidin und DAPI auf eine Endkonzentration von 10 μg/ml für 10 min zur Färbung und waschen Sie dann 3x mit PBS.
11. Geben Sie 1 ml PBS in jede Vertiefung und beobachten Sie die Antigenaufnahme mit CLSM, wie unten beschrieben.
    1. Öffnen Sie die CLSM-Software, klicken Sie auf ZEN-System und warten Sie, bis die Hardwareinitialisierung abgeschlossen ist.
    2. Klicken Sie auf die GFP- und DAPI-Verknüpfungen auf der Registerkarte "Suchen", um den Bereich zu finden, der beobachtet werden kann. Schalten Sie das Leuchtstofflicht und das Durchlicht aus.
    3. Klicken Sie im Erfassungsmenü auf Smart Setup , um die Farbstoffbibliothek zu öffnen, und fügen Sie drei Fluoreszenzfarbstoffe hinzu: EGFP, Phalloidin und DAPI. Klicken Sie auf Bestes Signal > OK. Klicken Sie auf den EGFP-Kanal auf der Registerkarte Kanäle und klicken Sie auf Live , um das richtige Sichtfeld auf der rechten Benutzeroberfläche auszuwählen.
    4. Wählen Sie 1 AE für die Lochblende, drehen Sie die Feinfokussierschraube, um die Brennweite einzustellen, und wählen Sie die entsprechende Brennebene. Klicken Sie auf Reichweitenanzeige und passen Sie die Kombination aus Laserleistung und Hauptverstärkung so an, dass nur sporadische rote Punkte auf dem Bild erscheinen.
    5. Stellen Sie die Phalloidin- und DAPI-Kanäle mit den gleichen Parametern ein, ohne die Laserleistung zu ändern.
    6. Wählen Sie Live stoppen und klicken Sie auf Aufnahmemodus, um die Aufnahmeparameter zu ändern: Bildgröße: 1024 Pixel x 1024 Pixel; Scan-Geschwindigkeit: 7; Mittelwert: 2x. Klicken Sie auf Snap und wählen Sie Split, um alle aufgenommenen Bilder anzuzeigen. Speichern Sie die Bilder.

6. Makrophagenaktivierung

1. Tauchen Sie C57BL / 6-Mäuse nach der Euthanasie in 75% Alkohol ein und legen Sie sie mit dem Gesicht nach oben in eine gläserne Petrischale in nummerierter Reihenfolge.
2. Führen Sie die Mäuse durch das Transferfenster in den sterilen Operationssaal und legen Sie sie für 5 Minuten auf den Operationstisch.
3. Mit einer Spritze 10 ml Kochsalzlösung absaugen, die Mäuse um ca. 45° nach unten kippen und in die Mitte der Bauchhöhle injizieren. Ziehen Sie etwa 5 ml Zellsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen für jeweils 10 ml und wiederholen Sie die Injektion 3x.
4. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 129 x g für 5 Minuten, um peritoneale primäre Makrophagen der Maus zu erhalten. Resuspendieren Sie die Zellen, stellen Sie die Zellkonzentration auf 2 x 10⁶ Zellen/ml mit RPMI 1640 vollständigem Medium (mit 10% FBS) ein und beimpfen Sie die Zellsuspension in einer 24-Well-Platte, um eine konstante Anzahl von Zellen pro Welle (1 ml/Well) zu gewährleisten.
5. Kultur bei 37 °C in 5%_CO2 über Nacht (ca. 16-20 h), gefolgt von Inkubation mit PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD und Ag/Al (Ag-Endkonzentration: 5 μg/ml; adjuvante Endkonzentration: 10 μg/ml; Gesamtvolumen: 2 ml) für 24 h. Die Konzentrationen von IL-1β, IL-6 und TNF-α im Kulturüberstand werden mit ELISA-Kits unter Verwendung der in den Schritten 3.12-3.19 beschriebenen Methoden und Verfahren nachgewiesen.

Ergebnisse

Die Bewertung der zellulären Aktivität der Adjuvantien OP-D und NOD wurde in vitro gemäß dem Protokoll durchgeführt. L929-Fibroblasten sind ein nützliches Screening-Modell für die In-vitro-Toxizitätsprüfung von NOD (Abbildung 1). Die Quantifizierung der inflammatorischen Zytokinspiegel in der Milz kann den Forschern helfen, die Immunantwort besser zu verstehen (Abbildung 2). Die Überwachung von CTLs mit ELISpot ist der Goldstandard f?...

Diskussion

Subunit-Impfstoffe bieten eine ausgezeichnete Sicherheit, aber eine schlechte Immunogenität. Die Hauptstrategie zur Verbesserung der Immunogenität besteht darin, Antigene physisch zu adsorbieren oder mit Adjuvantien zu koppeln und sie in die Wirkstoffabgabesysteme zu integrieren, um die Aufnahme und Präsentation durch DCs zu fördern. Natürliche Pflanzensaponine wie Quillaia-Saponin und seine Derivate sind hochtoxisch und nicht für die Entwicklung von Humanimpfstoffen^{geeignet 17}. Daher ist di...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	GIBCO, USA	25200056
96-well filter plates	Millipore. Billerica, MA	CLS3922
AlPO4	General Chemical Company, USA	null
Automated Cell Counter	Countstar, China	IC1000
BALB/c mice and C57BL/6 mice	Beijing HFK Bioscience Co. Ltd	null
caprylic/capric triglyceride (GTCC)	Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China	null
CCK-8 kits	Dojindo, Japan	CK04
Cell Counting Plate	Costar, Corning, USA	CO010101
Cell Sieve	biosharp, China	BS-70-CS
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D9542
DMEM basic(1x) medium	GIBCO, USA	C11885500BT
DSZ5000X Inverted Microscope	Nikon,Japan	DSZ5000X
EL-35 (Cremophor-35)	Mumbai, India	null
ELISpot classic	AID, Germany	ELR06
Fetal Bovine Serum	GIBCO, USA	10099141C
Full-function Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific, USA	VL0000D2
GFP	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P42212
Glutamax	Invitrogen, USA	35050061
Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor	GM-CSF, R&D Systems, USA	315-03
HEPES	Invitrogen, USA	15630106
HF 90/240 Incubator	Heal Force, Switzerland	null
IL-4	PeproTech, USA	042149
L929 cell line	FENGHUISHENGWU, China	NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462)
Laser Scanning Confocal Microscopy	Zeiss, Germany	LSM 980
MONTANE 85 PPI	SEPPIC, France	L12910
MONTANOX 80 PPI	SEPPIC, France	36372K
Mouse IFN-γ ELISA kit	Dakewe, China	1210002
Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit	Dakewe, China	DKW22-2000-096
Mouse IL-17A ELISA kit	Dakewe, China	1211702
Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit	ebiosciences, USA	3521-4HPW-2
Mouse IL-1β ELISA kit	Dakewe, China	1210122
Mouse IL-6 ELISA kit	Dakewe, China	1210602
Mouse TNF-α ELISA kit	Dakewe, China	1217202
Non-essential amino acids(100x)	Invitrogen, USA	11140050
Ophiopogonin-D	Chengdu Purui Technology Co. Ltd	945619-74-9
Penicillin-Streptomycin Solution	Invitrogen, USA	15070063
Phalloidin	Solarbio, China	CA1620
Phosphate Buffered Saline	ZSGB-BIO, China	ZLI-9062
Red Blood Cell Lysis Buffer	Solarbio, China	R1010
RPMI 1640 medium	Hyclone (Life Technology), USA	SH30809.01
Sodium pyruvate(100 mM)	Invitrogen, USA	11360070
Squalene	Sigma, USA	S3626
β- Mercaptoethanol	Invitrogen, USA	21985023