In vitro Bewertung der zellulären Aktivität des Nanoemulsionsimpfstoff-Adjuvans Ophiopogonin D

Zusammenfassung

Das Protokoll enthält detaillierte Methoden, um zu beurteilen, ob die Nanoemulsion Ophiopogonin D Adjuvans eine effektive zelluläre Immunantwort fördert.

Zusammenfassung

Als Hauptbestandteil von Impfstoffen können Adjuvantien die starken, weit verbreiteten, angeborenen und adaptiven Immunantworten, die mit Antigenen verbunden sind, direkt induzieren oder verstärken. Ophiopogonin D (OP-D), eine gereinigte Komponente, die aus der Pflanze Ophiopogon japonicus extrahiert wird, hat sich als nützliches Impfstoff-Adjuvans erwiesen. Die Probleme der geringen Löslichkeit und Toxizität von OP-D können durch die Verwendung eines niederenergetischen Emulgierungsverfahrens zur Herstellung der Nanoemulsion Ophiopogonin D (NOD) effektiv überwunden werden. In diesem Artikel wird eine Reihe von In-vitro-Protokollen zur Bewertung der Zellaktivität untersucht. Die zytotoxischen Wirkungen von L929 wurden mit einem Zellzähl-Kit-8-Assay bestimmt. Dann wurden die sezernierten Zytokinspiegel und die entsprechenden Immunzellzahlen nach der Stimulation und Kultur von Splenozyten von immunisierten Mäusen durch ELISA- und ELISpot-Methoden nachgewiesen. Darüber hinaus wurde die Antigenaufnahmefähigkeit in aus dem Knochenmark stammenden dendritischen Zellen (BMDCs), die aus C57BL/6-Mäusen isoliert und nach Inkubation mit GM-CSF plus IL-4 gereift waren, durch konfokale Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) beobachtet. Wichtig ist, dass die Makrophagenaktivierung durch die Messung der Zytokine von IL-1β, IL-6 und Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) durch ELISA-Kits bestätigt wurde, nachdem Peritonealmakrophagen (PMs) von leeren Mäusen mit dem Adjuvans für 24 Stunden kokulturiert wurden. Es ist zu hoffen, dass dieses Protokoll anderen Forschern direkte und effektive experimentelle Ansätze zur Verfügung stellen wird, um die Wirksamkeit der zellulären Reaktion neuartiger Impfstoffadjuvantien zu bewerten.

Einleitung

Impfstoffe sind ein wichtiges Mittel zur Verhütung und Behandlung von Infektionskrankheiten und nichtübertragbaren Krankheiten. Die angemessene Zugabe von Adjuvantien und Verabreichungsvehikeln zu Impfstoffformulierungen ist vorteilhaft für die Verbesserung der Immunogenität von Antigenen und die Erzeugung lang anhaltender Immunantworten¹. Neben dem klassischen Adjuvans Alaun (Aluminiumsalz) gibt es sechs Arten von Adjuvantien für Impfstoffe, die derzeit auf dem Markt sind: MF59^2,3, AS04 3, AS03 3, AS01 ^3, CpG1018

Protokoll

Alle Zellexperimente wurden in einem zelltechnischen Labor durchgeführt, das mit einfachen Operationssälen, Pufferräumen, sterilen Kulturräumen sowie Identifikations- und Analyseräumen ausgestattet war. Die Arbeitsumgebung und die Arbeitsbedingungen waren frei von mikrobieller Kontamination und anderen schädlichen Faktoren. Die Tierversuche wurden auf der Grundlage der Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt und von der Versuchstierschutz- und Ethikkommission der Dritten Militärmedizinischen Universität genehmigt.

1. Autoklavieren und Materialaufbereitung

1. Bereiten Sie die Reagenzi....

Ergebnisse

Die Bewertung der zellulären Aktivität der Adjuvantien OP-D und NOD wurde in vitro gemäß dem Protokoll durchgeführt. L929-Fibroblasten sind ein nützliches Screening-Modell für die In-vitro-Toxizitätsprüfung von NOD (Abbildung 1). Die Quantifizierung der inflammatorischen Zytokinspiegel in der Milz kann den Forschern helfen, die Immunantwort besser zu verstehen (Abbildung 2). Die Überwachung von CTLs mit ELISpot ist der Goldstandard f?.......

Diskussion

Subunit-Impfstoffe bieten eine ausgezeichnete Sicherheit, aber eine schlechte Immunogenität. Die Hauptstrategie zur Verbesserung der Immunogenität besteht darin, Antigene physisch zu adsorbieren oder mit Adjuvantien zu koppeln und sie in die Wirkstoffabgabesysteme zu integrieren, um die Aufnahme und Präsentation durch DCs zu fördern. Natürliche Pflanzensaponine wie Quillaia-Saponin und seine Derivate sind hochtoxisch und nicht für die Entwicklung von Humanimpfstoffen^{geeignet 17}. Daher ist di.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	GIBCO, USA	25200056
96-well filter plates	Millipore. Billerica, MA	CLS3922
AlPO4	General Chemical Company, USA	null
Automated Cell Counter	Countstar, China	IC1000
BALB/c mice and C57BL/6 mice	Beijing HFK Bioscience Co. Ltd	null
caprylic/capric triglyceride (GTCC)	Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China	null
CCK-8 kits	Dojindo, Japan	CK04
Cell Counting Plate	Costar, Corning, USA	CO010101
Cell Sieve	biosharp, China	BS-70-CS
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D9542
DMEM basic(1x) medium	GIBCO, USA	C11885500BT
DSZ5000X Inverted Microscope	Nikon,Japan	DSZ5000X
EL-35 (Cremophor-35)	Mumbai, India	null
ELISpot classic	AID, Germany	ELR06
Fetal Bovine Serum	GIBCO, USA	10099141C
Full-function Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific, USA	VL0000D2
GFP	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P42212
Glutamax	Invitrogen, USA	35050061
Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor	GM-CSF, R&D Systems, USA	315-03
HEPES	Invitrogen, USA	15630106
HF 90/240 Incubator	Heal Force, Switzerland	null
IL-4	PeproTech, USA	042149
L929 cell line	FENGHUISHENGWU, China	NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462)
Laser Scanning Confocal Microscopy	Zeiss, Germany	LSM 980
MONTANE 85 PPI	SEPPIC, France	L12910
MONTANOX 80 PPI	SEPPIC, France	36372K
Mouse IFN-γ ELISA kit	Dakewe, China	1210002
Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit	Dakewe, China	DKW22-2000-096
Mouse IL-17A ELISA kit	Dakewe, China	1211702
Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit	ebiosciences, USA	3521-4HPW-2
Mouse IL-1β ELISA kit	Dakewe, China	1210122
Mouse IL-6 ELISA kit	Dakewe, China	1210602
Mouse TNF-α ELISA kit	Dakewe, China	1217202
Non-essential amino acids(100x)	Invitrogen, USA	11140050
Ophiopogonin-D	Chengdu Purui Technology Co. Ltd	945619-74-9
Penicillin-Streptomycin Solution	Invitrogen, USA	15070063
Phalloidin	Solarbio, China	CA1620
Phosphate Buffered Saline	ZSGB-BIO, China	ZLI-9062
Red Blood Cell Lysis Buffer	Solarbio, China	R1010
RPMI 1640 medium	Hyclone (Life Technology), USA	SH30809.01
Sodium pyruvate(100 mM)	Invitrogen, USA	11360070
Squalene	Sigma, USA	S3626
β- Mercaptoethanol	Invitrogen, USA	21985023