JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Protokol, nanoemülsiyon ofiyopogonin D adjuvanının etkili hücresel immün yanıtları destekleyip desteklemediğini değerlendirmek için ayrıntılı yöntemler sunar.

Özet

Aşıların temel bir bileşeni olarak, adjuvanlar antijenlerle ilişkili güçlü, yaygın, doğuştan gelen ve adaptif immün yanıtları doğrudan indükleyebilir veya artırabilir. Ophiopogon japonicus bitkisinden ekstrakte edilen saflaştırılmış bir bileşen olan Ophiopogonin D (OP-D), bir aşı adjuvanı olarak yararlı bulunmuştur. OP-D'nin düşük çözünürlüğü ve toksisitesi sorunları, nanoemülsiyon ofiyopogonin D (NOD) hazırlamak için düşük enerjili bir emülsifikasyon yöntemi kullanılarak etkili bir şekilde üstesinden gelinebilir. Bu makalede, hücresel aktivitenin değerlendirilmesi için bir dizi in vitro protokol incelenmiştir. L929'un sitotoksik etkileri, hücre sayma kit-8 testi kullanılarak belirlendi. Daha sonra, immünize farelerden splenositlerin stimülasyonu ve kültürü sonrasında salgılanan sitokin düzeyleri ve buna karşılık gelen immün hücre sayıları ELISA ve ELISpot yöntemleri ile tespit edildi. Ek olarak, C57BL / 6 farelerden izole edilen ve GM-CSF artı IL-4 ile inkübasyondan sonra olgunlaşan kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerde (BMDC'ler) antijen alım yeteneği, lazer taramalı konfokal mikroskopi (CLSM) ile gözlenmiştir. Önemli olarak, makrofaj aktivasyonu, IL-1β, IL-6 ve tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) sitokinlerinin seviyelerinin, boş farelerden peritoneal makrofajların (PM'ler) adjuvanla 24 saat boyunca birlikte kültürlenmesinden sonra ELISA kitleri ile ölçülmesiyle doğrulandı. Bu protokolün, diğer araştırmacılara yeni aşı adjuvanlarının hücresel yanıt etkinliklerini değerlendirmek için doğrudan ve etkili deneysel yaklaşımlar sağlayacağı umulmaktadır.

Giriş

Aşılar, bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan hastalıkların önlenmesi ve tedavisinde önemli bir araçtır. Aşı formülasyonlarına adjuvanların ve dağıtım araçlarının uygun şekilde eklenmesi, antijenlerin immünojenitesini arttırmak ve uzun süreli immün yanıtlar oluşturmak için faydalıdır1. Klasik adjuvan şaplara (alüminyum tuzu) ek olarak, şu anda pazarlanan aşılar için altı çeşit adjuvan vardır: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 ve Matrix-M5. Genel olarak, insan vücudu viral bir saldırıyla karşılaştığında, birinci ve ikinci savunma hatları (cilt, mukoza ve makrofajlar) virüsün temizlenmesinde öncülük eder ve son olarak, bağışıklık organlarını ve bağışıklık hücrelerini içeren üçüncü savunma hattı aktive edilir. Alüminyum ve alüminyum tuzları, 1920'lerin başından beri insan aşıları için en yaygın kullanılan adjuvanlar olmuştur ve etkili bir doğuştan gelen bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmıştır6. Bununla birlikte, antijen sunan hücrelerin (APC'ler) klasik adjuvanlar tarafından aktivasyonunun, immün hücreleri spesifik sitokin ve kemokin setleri üretmeye teşvik eden, adjuvanların çalıştığı mekanizma olduğu ve adjuvanların spesifik immün yanıtlar üzerinde sadece geçici etkiler göstermesinin nedenlerinden biri olabileceği öne sürülmüştür7. İnsan kullanımı için sınırlı lisanslı adjuvanların varlığı, etkili bağışıklık tepkilerini ortaya çıkaran aşıların geliştirilmesinde kısıtlayıcı bir faktördür8.

Şu anda, artan sayıda adjuvan çalışma, farelerde güçlü bir hücresel bağışıklık tepkisi indükleme yeteneğini göstermektedir. QS-21'in dengeli bir T-helper 1 (Th1) ve T-helper 2 (Th2) immün yanıtını indüklediği, daha yüksek seviyelerde antikor titreleri ürettiği ve bir adjuvan olarak korumayı uzattığı gösterilmiştir, ancak güçlü toksisitesi ve hemolitik özellikleri, bağımsız bir klinik adjuvan 9,10 olarak gelişimini sınırlar. OP-D (ruscogenin-O-α-L-rhamnopyranosy1-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-fucopyranoside), Çin şifalı bitkisi Ophiopogon japonicas4'ün kökünden izole edilen steroidal saponinlerden biridir. Ek olarak, Radix Ophiopogonis'te bulunan baş farmakolojik olarak aktif bileşendir (Shen Mai San) ve bazı farmakolojik özelliklere sahip olduğu bilinmektedir11. Ayrıca, Liliaceae ailesinin bir üyesidir ve hücresel inflamasyon ve miyokard hasarında inhibitör ve koruyucu etkileri için yaygın olarak kullanılmaktadır. Örneğin, OP-D, BALB / C farelerde DNCB ile indüklenen atopik dermatit benzeri lezyonları ve tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) inflamatuar HaCaT hücrelerini iyileştirir12. Önemli olarak, OP-D, kardiyovasküler sistemin antioksidatif korumasını teşvik eder ve hem reaktif oksijen türlerinin üretimini azaltarak hem de mitokondriyal membran hasarını bozarak kalbi doksorubisin kaynaklı otofajik hasara karşı korur. Deneyler, OP-D'yi mono-desmosid ile almanın bağışıklık sağlığını artırmaya, beyaz kan hücresi sayımlarını ve DNA sentezini artırmaya ve antikorların daha uzun süre dayanmasına yardımcı olduğunu göstermiştir13. Daha önce OP-D'nin adjuvan etkisi olduğu bulunmuştur14.

Nanoemülsiyonlar, yüzey aktif maddeler, yağ, kosürfaktanlar ve su12,15'in bir kombinasyonundan oluşan su içinde yağ nanoformülasyonlarıdır. Bu nanoaşı tasarımları, immün stimülasyonu arttırmak, antijenleri korumak ve dendritik hücre (DC) olgunlaşmasını teşvik etmek için antijenlerin ve adjuvanların birlikte kapsüllenmesine izin verir16. Taramadan elde edilen bu yeni adjuvanların gelişimi için, hücresel yanıt yeteneklerini değerlendirmek için uygun yöntemler bulmak önemlidir.

Bu protokolün amacı, adjuvanların fagositozu ve immün hücrelerin in vitro hücre kültüründeki ekspresyonunu artırıp artıramayacağını sistematik olarak değerlendirmek ve ana deneysel yöntemleri detaylandırmaktır. Deney dört alt bölüme ayrılmıştır: (1) OP-D ve NOD'nin L929 hücrelerine toksisitesi, hücre sayma kit-8 (CCK-8) testi ile belirlenir; (2) endokrin IFN-γ ve IL-17A'nın sitokin seviyeleri ve immünize farelerde karşılık gelen hücre sayıları splenosit stimülasyonu ve ELISpot testleri ile tespit edilir; (3) Adjuvan stimülasyondan sonra DC'lerin antijen sunum kabiliyeti konfokal mikroskopi kullanılarak gözlenir; ve (4) adjuvanlarla birlikte kültürlenmiş normal farelerde periton makrofajlarından (PM'ler) elde edilen süpernatantlarda üç çeşit sitokin, IL-1β, IL-6 ve TNF-α tespit edilir.

Protokol

Tüm hücre deneyleri, temel ameliyathaneler, tampon odalar, steril kültür odaları, tanımlama ve analiz odaları ile donatılmış bir hücre mühendisliği laboratuvarında gerçekleştirildi. Çalışma ortamı ve koşulları mikrobiyal kontaminasyon ve diğer zararlı faktörlerden arındırılmıştır. Hayvan deneyleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Kılavuz'a dayanarak yürütülmüş ve Üçüncü Askeri Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Refahı ve Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. Otoklavlama ve malzeme hazırlama

  1. Fosfat tamponlu salin (PBS), makas, forseps ve aşındırıcı ağ gibi reaktifleri ve sarf malzemelerini, 121 °C'de 20 dakika boyunca otoklavlama yaparak nemli ısı sterilizasyonu ile hazırlayın.
  2. Gerekli reaktifler ve ekipmanlar için Malzeme Tablosu'na bakınız. Boş nanoemülsiyon (BNE) formülü için Tablo 1'e bakın.

2. L929 sitotoksisite testi

  1. Su banyosunu açın ve sıcaklığı 37 ° C'ye ayarlayın. Bir tüp donmuş L929 hücresini sıvı azottan toplayın ve 37 ° C'lik bir su banyosunda hızla çözün.
  2. Hücreleri çözüldükten hemen sonra 15 mL'lik steril bir santrifüj tüpüne pipetleyin, 2 mL DMEM ekleyin ve iyice karıştırın.
  3. Numuneleri 5 dakika boyunca 129 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Ardından, hücreleri yeniden askıya almak için 2mL DMEM ekleyin ve numuneleri 5 dakika boyunca 129 x g'de tekrar santrifüj edin.
  4. Süper nantantı atın, yeniden süspansiyon için 6 mL DMEM tam ortamı (% 10 FBS içeren) ekleyin ve 37 ° C'lik bir inkübatörde bir T25 kültür şişesine% 5 CO2 ile 48 saat boyunca kültüre aktarın.
  5. Kültür ortamını kültür şişesine atın ve hücreleri 2 mL PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, hücreleri 37 ° C'de 1-2 dakika boyunca sindirmek için 1 mL% 0.25 tripsin ekleyin.
  6. Hücrelerin yuvarlanması gözlendiğinde, sindirimi hemen sonlandırmak ve iyice karıştırmak için 4 mL DMEM tam ortamı ekleyin. Daha sonra, hücreleri 15 mL'lik steril bir santrifüj tüpüne aspire edin ve 5 dakika boyunca 129 x g'de santrifüj yapın.
  7. Süpernatantı çıkarın ve hücreleri 1 mL DMEM tam ortamında yeniden askıya alın. Hücre sayma plakalarını kullanarak hücre sayımı için 20 μL'lik bir hücre süspansiyonu kullanın ve kalan hücreleri DMEM tam ortamı ile 1 x 105 hücre / mL'ye seyreltin.
  8. 96 kuyucuklu bir plakanın çevresine 100 μL ultra saf su ekleyin ve sadece iç kuyucuklara 100 μL hücre seyreltici ekleyin. Plakayı 37 ° C'de 4 saat boyunca yapışkan kültür için inkübatöre yerleştirin.
  9. Hücreler yapıştıktan sonra, OP-D ve NOD'yi DMEM tam ortamında ayrı ayrı 200 μL / kuyucuk nihai hacmine ekleyin (her ilacın nihai konsantrasyonları 480 μg / mL, 240 μg / mL, 120 μg / mL, 60 μg / mL ve 30 μg / mL'dir). Her konsantrasyon için, kopya olarak üç kuyucuk kullanın. Ardından, hücreleri 24 saat daha inkübatöre ve kültüre geri yerleştirin.
  10. CCK-8'i DMEM tam ortamı ile% 10 oranında seyreltin ve 96 delikli plakaya adjuvan ve hücre çözeltilerini içeren 100 μL / kuyu seyreltmeleri ekleyin. Plakayı tekrar inkübatöre yerleştirin ve 2-3 saat daha inkübe edin.
  11. Hücre çökelmesi nedeniyle homojensizliği önlemek için hücre çözeltisini kaplarken sık sık karıştırın. Orta ve CCK-8 çözeltisini iyice karıştırmak için CCK-8'i eklemeden önce ve sonra plakayı birkaç kez hafifçe sallayın.
  12. Bir mikro plaka okuyucu kullanarak emiciliği 450 nm'de ölçün. Temel absorbans değeri için sadece orta ve CCK-8 ile bir sıfırlama kuyusu kurun. Çizim sırasında sıfırlanmış absorbans değerini elde edilen absorbans değerinden çıkararak doğru absorbans değerlerini hesaplayın.
  13. Mikroplaka okuyucu ile test etmeden önce herhangi bir kuyucukta kabarcık bulunmadığını doğrulayın, çünkü kabarcıklar tahlili engelleyecektir.

3. Splenosit stimülasyonu

  1. 6-8 haftalık BALB/c fareleri 0., 7. gün ve 14. günde kas içi enjeksiyon (200 μL) yoluyla 30 μg protein antijeni artı 30 μg adjuvan ile aşağıdaki deney gruplarına göre bağışıklayın: (1) PBS grubu, (2) antijen (Ag) grubu, (3) antijen + OP-D (Ag/OP-D) grubu, (4) antijen + BNE (Ag/BNE) grubu, (5) antijen + NOD (Ag/NOD) grubu ve (6) antijen + AlPO4 (Ag/Al) grubu.
  2. Hazırlık odası: Birincil bağışıklamadan sonraki 24. günde, fareleri hayvan odasından çıkarın ve 100 mg / kg% 1 sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksiyonla ötenazi yapın. Fareleri bir cam kaba koyun ve 5 dakika boyunca% 75 alkole batırın.
  3. Santrifüj tüplerini bir santrifüj tüp rafına yerleştirin, tek kullanımlık Petri kaplarını numaralandırın ve 10 mL'lik bir pipetle her Petri kabına 5 mL PBS ekleyin.
  4. Farenin sol ventral tarafının ortasında makasla 6-8 cm'lik bir kesi yapın, cildi yırtın, karın duvarını açığa çıkarın ve dalağın uzun kırmızı şeridini bulun.
  5. Dalağın alt tarafındaki peritonu, forsepslerle kaldırın, kesin ve dalağı açığa çıkarmak için yukarı doğru çevirin. Dalağı forseps ile kaldırın, dalağın altındaki bağ dokusunu oftalmik makasla ayırın ve dalağı çıkarın.
  6. Dalağı 5 mL PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin ve bir elek (200 ağ, 70 μm) ve öğütme çubuğu ile öğütün. Taşlamadan sonra, sıvıyı numaralandırmaya uygun olarak dirsek damlalıklı 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
  7. Sıvıyı 5 dakika boyunca 453 x g'de santrifüj yapın. Süper natantı atın, her tüpe 3 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin, hücreleri yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca lize edin.
  8. Her tüpe 10-12 mL PBS ekleyin, tüpü baş aşağı karıştırın ve 5 dakika boyunca 453 x g'de santrifüj yapın. Süper nantantı atın, her santrifüj tüpüne 10 mL PBS ekleyin ve hücreleri yeniden askıya alın.
  9. Hücre sayma plakasının bir kuyucuğuna her numunenin 20 μL'sini alın ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak canlı hücrelerin sayısını kaydedin.
  10. Numuneleri 5 dakika boyunca 453 x g'de santrifüj edin ve süpernatanı atın. Hücreleri yeniden askıya alın, RF-10 ortamı ile 2.5 x 106 hücre / mL'ye seyreltin ( Tablo 2'deki formülasyon bilgileri) ve 100 μL / kuyucukta 96 delikli bir plakaya ekleyin.
  11. Antijeni RF-10 ortamı ile 10 μg / mL arasında seyreltin, her bir oyuğa 100 μL ekleyin ve% 5 CO2'de 37 ° C'de 3 gün boyunca inkübe edin.
  12. Her bir hücre grubundan elde edilen hücre süspansiyonunu 1.5 mL santrifüj tüplerinde aspire edin, 20 dakika boyunca 453 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı temiz bir santrifüj tüpüne aspire edin.
  13. IFN-γ ve IL-17A içerik algılamasını kesinlikle ELISA kiti talimatlarına göre gerçekleştirin. Yöntem ve prosedürler aşağıdaki gibidir.
  14. 1x yıkama tamponu çalışma çözeltisi (kit ile birlikte verilir), standart gradyan konsantrasyon çözeltisi (sitokin standart çözeltisini 500 pg / mL, 250 pg / mL, 125 pg / mL, 62.5 pg / mL, 31.3 pg / mL ve 15.6 pg / mL'ye seyreltin R [1x] kitle birlikte verilir), biyotinillenmiş antikor çalışma çözeltisi (çalışma çözeltisini oluşturmak için kit ile birlikte verilen seyreltme tamponu R [1x] kullanarak biyotinillenmiş antikor çözeltisini 1:100'e kadar seyreltin), ve gerektiğinde streptavidin-HRP çalışma çözümü.
  15. Standart kuyucuğuna 100 μL/kuyucuk seyreltilmiş sitokin standart çözeltisi, numune kuyucuğuna 100 μL/kuyucuk numune (numune seyreltme için kit ile birlikte verilen seyreltme tamponu R [1x] kullanılır) ve boş kontrol kuyucuğuna 100 μL/kuyucuk seyreltme tamponu R (1x) ekleyin.
  16. 50 μL/kuyucukta biyotinile antikor çalışma solüsyonu ekleyin. İyice karıştırın, bir sızdırmazlık membranı ile örtün ve 90 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  17. Sıvıyı kuyucuklardan çıkarın ve 300 μL / kuyucukta 1x yıkama tamponu çalışma çözeltisi ekleyin. Sıvıyı 1 dakika sonra kuyucuklardan atın. Sıvının her seferinde filtre kağıdında kurumasına izin vererek bu işlemi 4 kat tekrarlayın.
  18. 100 μL/kuyucuk streptavidin-HRP çalışma çözeltisi ekleyin. Numuneleri 37 °C'de 30 dakika boyunca örtün ve inkübe edin. Numuneleri 5 dakika boyunca 453 x g'de santrifüj edin ve süpernatanı atın.
    NOT: Yıkama işlemi sırasında reaksiyonda iyi kalan yıkama çözeltisi, filtre kağıdında filigran görünmeyene kadar iyice okşanmalıdır.
  19. TMB'yi 100 μL / kuyucukta ekleyin, plakaları karanlıkta 5-30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve sonlandırma reaksiyonunu kuyudaki renk derinliğine göre yargılayın (koyu mavi). Genellikle, renk gelişimi için 10-20 dakika iyi sonuçlar elde edebilir.
  20. 100 μL/kuyucukta durdurma çözeltisi ekleyerek reaksiyonu hızlı bir şekilde sonlandırın. Absorbans değerini, sonlandırmadan sonraki 10 dakika içinde 450 nm'de tespit edin.
    NOT: Reaktifi kullanmadan önce 30 dakika boyunca oda sıcaklığında dengeleyin.

4. ELISpot testi

  1. Farelerin bağışıklanmasını ve plenositlerin toplanmasını tam olarak yukarıdaki 3.1-3.10 numaralı adımlarda açıklandığı gibi gerçekleştirin. IFN-γ ve IL-17A testlerini kit talimatlarına tam olarak uygun olarak yapın. Yöntem ve prosedürler aşağıdaki gibidir.
  2. Plakayı kapalı paketten çıkarın, steril PBS (200 μL / kuyu) ile 4x yıkayın ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında dengelemek için 1640 tam kültür ortamı (200 μL / kuyu) ekleyin.
  3. Ortamı çıkarın ve süspansiyonunu RF-10 orta ila 2 x 105 hücre / mL ile seyreltin, kuyucuk başına 50 μL hücre ve antijen ekleyin (son konsantrasyon: 10 μg / mL).
  4. Plakayı 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatöre 48 saat boyunca% 5 CO2 ile yerleştirin. Bu süre zarfında plakayı hareket ettirmeyin ve buharlaşmayı önlemek için önlemler alın (örneğin, plakayı alüminyum folyo ile sarın).
  5. Tespit antikorunu (BVD6-24G2-biotin) %0,5 fetal sığır serumu (PBS-%0,5 FBS) içeren fosfat tamponlu salin (0,5 mL:100 mL) içinde 1 μg/mL'ye (1:1.000) kadar seyreltin. Plakaya 100 μL/kuyucuk ekleyin ve 0,22 μm'lik bir membrandan filtrasyondan sonra 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  6. Sıvıyı kuyucuklara boşaltın, 200 μL / kuyuya 1x yıkama tamponu ekleyin ve 5x'i yıkayın. Her seferinde 30-60 s bekletin ve son kez leke kağıdında kurumaya bırakın.
  7. PBS-%0.5 FBS'de streptavidin-yaban turpu peroksidazını (1:1.000) seyreltin ve 100 μL/kuyucuk ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin. Plakayı adım 4.6'daki gibi yıkayın.
  8. 100 μL/kuyucuk kullanıma hazır TMB substrat çözeltisi ekleyin ve net bir nokta görünene kadar geliştirin. Deiyonize suda yoğun bir şekilde yıkayarak renk gelişimini durdurun (tekrar tekrar 5x-6x durulayın). Gerekirse, menfezi (plakanın altındaki yumuşak plastik) çıkarın ve zarın alt tarafını durulayın.
  9. Plaka kuruduktan sonra bir ELISpot okuyucu veya diseksiyon mikroskobundaki lekeleri inceleyin ve sayın.

5. DC'ler tarafından alım

  1. BALB / c normal fareleri, 100 mg / kg% 1 sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksiyon ile ötenazileştirin. Fareleri 5 dakika boyunca% 75 alkole batırın.
  2. Farenin karnının altında 6-8 cm'lik bir kesiyi makasla kesin ve farklı yönlerde ayırmak ve farenin bacaklarını ortaya çıkarmak için açıklığın iki ucunu kelepçeleyin. Fare femurunu fare gövdesinden ve tibiası eklemden ayırın ve kemikleri her iki ucunda da sağlam tutun.
  3. Femurun her iki ucundaki eklem eklemlerinden kalan doku ve kıkırdakları makas ve forseps ile çıkarın. Femurları 5 dakika boyunca% 75 alkole batırın ve ardından yüzey alkolünü yıkamak için steril PBS çözeltisine batırın.
  4. Femurların uçlarını makasla kesin ve kemik iliğini steril PBS çözeltisi ile steril bir Petri kabında durulayın, ardından 1 mL'lik bir şırınga ile aspirasyon yapın. Yıkamayı 3x-5x tekrarlayın.
  5. Bir hücre eleği (200 ağ, 70 μm) ile filtreleyin ve BMDC'leri 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın. Numuneleri 5 dakika boyunca 290 x g'da santrifüj yapın. Süper nantantı atın, 4 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin, yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca lize edin.
  6. Lisatı nötralize etmek için 10 mL steril PBS çözeltisi ekleyin, 5 dakika boyunca 290 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
  7. % 1 penisilin-streptomisin çözeltisi ve% 10 FBS içeren 1 mL'lik DMEM'deki hücreleri yeniden askıya alın ve sayın. Daha sonra, ortama GM-CSF (20 ng / mL) artı IL-4 (10 ng / mL) ekleyin, hücre konsantrasyonunu 5 x 105 / mL'ye ayarlayın ve hücreleri kapak kapaklarına aşılayın.
  8. Hücre süspansiyonunu 2 mL / kuyucukta 6 delikli bir plakaya ekleyin ve plakayı 48 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. Ortamı 2 gün sonra tamamen değiştirin ve 4 gün sonra ortamın yarısını değiştirin.
  9. Kültürün yedinci günündeki deney için 100x büyütmede ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak iyi durumda hücrelere (hücre yüzeyinde dendritik çıkıntılara sahip büyük ve radyolüsan hücreler) sahip beş kuyucuk seçin. Süpernatanı atın, DMEM tam ortamı (GFP nihai konsantrasyonu: 20 μg / mL; adjuvan nihai konsantrasyon: 10 μg / mL) ile seyreltilmiş 2 mL GFP, OP-D + GFP ve NOD + GFP çözeltilerini her bir kuyucuğa ekleyin ve plakaları karanlıkta 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  10. Plakaları PBS ile 3x yıkayın, her bir oyuğa 1 mL% 4 paraformaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Fiksasyondan sonra paraformaldehiti çıkarın, hücreleri falloidin ve DAPI ile boyama için 10 dakika boyunca 10 μg / mL'lik son bir konsantrasyona inkübe edin ve ardından PBS ile 3x'i yıkayın.
  11. Her bir oyuğa 1 mL PBS ekleyin ve aşağıda açıklandığı gibi CLSM kullanarak antijen alımını gözlemleyin.
    1. CLSM yazılımını açın, ZEN Sistemi'ne tıklayın ve donanım başlatmanın tamamlanmasını bekleyin.
    2. Gözlemlenebilecek alanı bulmak için bul sekmesindeki GFP ve DAPI kısayollarına tıklayın. Floresan ışığı ve iletilen ışığı kapatın.
    3. Boya kütüphanesini açmak için edinme menüsündeki Akıllı Kurulum'a tıklayın ve üç floresan boya ekleyin: EGFP, falloidin ve DAPI. Tamam' > En İyi Sinyal'e tıklayın. Kanallar sekmesindeki EGFP kanalına tıklayın ve sağ arayüzde doğru görüş alanını seçmek için Canlı'ya tıklayın.
    4. İğne deliği için 1 AU öğesini seçin, netleme uzaklığını ayarlamak için ince netleme vidasını döndürün ve uygun odak düzlemini seçin. Aralık Göstergesi'ne tıklayın ve lazer gücü ile ana kazanç kombinasyonunu ayarlayın, böylece görüntüde yalnızca ara sıra kırmızı noktalar görünür.
    5. Lazer gücünü değiştirmeden falloidin ve DAPI kanallarını aynı parametrelerle ayarlayın.
    6. Canlı Yayını Durdur'u seçin ve çekim parametrelerini değiştirmek için Edinme Modu'na tıklayın: Çerçeve Boyutu: 1024 piksel x 1024 piksel; Tarama Hızı: 7; Ortalama: 2x. Snap'e tıklayın ve çekilen tüm görüntüleri görüntülemek için Böl'ü seçin. Görüntüleri kaydedin.

6. Makrofaj aktivasyonu

  1. C57BL / 6 farelerini ötenaziden sonra% 75 alkole batırın ve yüzüstü bir cam Petri kabına numaralandırılmış sırayla yerleştirin.
  2. Fareleri transfer penceresinden steril ameliyathaneye geçirin ve 5 dakika boyunca ameliyat masasına yerleştirin.
  3. Bir şırınga kullanarak, 10 mL salin aspire edin, fareleri yaklaşık 45 ° C'de aşağı doğru eğin ve karın boşluğunun ortasına enjekte edin. Her 10 mL için 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yaklaşık 5 mL hücre süspansiyonu çekin ve enjeksiyonu 3x tekrarlayın.
  4. Fare periton primer makrofajlarını elde etmek için hücre süspansiyonunu 129 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Hücreleri yeniden askıya alın, hücre konsantrasyonunu RPMI1640 tam ortam (% 10 FBS içeren) ile 2 x 10 6 hücre / mL'ye ayarlayın ve hücre süspansiyonunu kuyu başına tutarlı sayıda hücre (1 mL / kuyu) sağlamak için 24 delikli bir plakada aşılayın.
  5. Gece boyunca% 5 CO 2'de (yaklaşık16-20 saat) 37 ° C'de kültür, ardından PBS, Ag, Ag / OP-D, Ag / NOD ve Ag / Al (Ag nihai konsantrasyon: 5 μg / mL; adjuvan nihai konsantrasyon: 10 μg / mL; toplam hacim: 2 mL) ile inkübasyon. Adım 3.12-3.19'da açıklanan yöntem ve prosedürleri kullanarak ELISA kitleri ile kültür süpernastanındaki IL-1β, IL-6 ve TNF-α seviyelerini tespit edin.

Sonuçlar

OP-D ve NOD adjuvanlarının hücresel aktivite değerlendirmesi protokole göre in vitro olarak tamamlandı. L929 fibroblastları, NOD'nin in vitro toksisite testi için yararlı bir tarama modelidir (Şekil 1). Dalaktaki inflamatuar sitokin seviyelerinin miktarı, araştırmacıların bağışıklık tepkisini daha iyi anlamalarına yardımcı olabilir (Şekil 2). CTL'lerin ELISpot ile izlenmesi, klinik çalışmalarda antijene özgü T hücr...

Tartışmalar

Alt ünite aşılar mükemmel güvenlik sağlar, ancak immünojenisitesi zayıftır. İmmünojeniteyi arttırmanın ana stratejisi, antijenleri adjuvanlarla fiziksel olarak adsorbe etmek veya eşleştirmek ve DC'ler tarafından alımını ve sunumunu teşvik etmek için bunları ilaç dağıtım sistemlerine dahil etmektir. quillaia saponin ve türevleri gibi doğal bitki saponinleri oldukça toksiktir ve insan aşılarının geliştirilmesi için uygun değildir17. Bu nedenle, aşıların veya ad...

Açıklamalar

Yazarlar, bu makalede bildirilen çalışmayı etkileyebilecek rakip finansal veya kişisel çıkarların olmadığını beyan etmektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı'nın 2021YFC2302603 numaralı hibesi, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Programı'nın 31670938, 32070924, 82041045 ve 32000651 No'lu hibeleri, Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı Proje Programı'nın 2014jcyjA0107 ve 2019jcyjA-msxmx0159 no'lu hibeleri, Chongqing'in Lisansüstü Araştırma ve İnovasyon Projesi'nin CYS21519 no'lu hibesi, Ordu Tıp Üniversitesi Özel projelerinin 2020XBK24 numaralı hibesi ve üniversite öğrencileri için Ulusal İnovasyon ve Girişimcilik Programı'nın 202090031021 numaralı hibe.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTA (1x)GIBCO, USA25200056
96-well filter platesMillipore. Billerica, MACLS3922
AlPO4General Chemical Company, USAnull
Automated Cell CounterCountstar, ChinaIC1000
BALB/c mice and C57BL/6 miceBeijing HFK Bioscience Co. Ltdnull
caprylic/capric triglyceride (GTCC)Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, Chinanull
CCK-8 kitsDojindo, JapanCK04
Cell Counting PlateCostar, Corning, USACO010101
Cell Sievebiosharp, ChinaBS-70-CS
Centrifuge 5810 REppendorf, Germany 5811000398
DAPISigma-Aldrich, St. Louis, USAD9542
DMEM basic(1x) mediumGIBCO, USAC11885500BT
DSZ5000X Inverted MicroscopeNikon,JapanDSZ5000X
EL-35 (Cremophor-35)Mumbai, Indianull
ELISpot classicAID, GermanyELR06
Fetal Bovine SerumGIBCO, USA10099141C
Full-function Microplate ReaderThermo Fisher Scientific, USAVL0000D2
GFPSigma-Aldrich, St. Louis, USAP42212
GlutamaxInvitrogen, USA35050061
Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating FactorGM-CSF, R&D Systems, USA315-03
HEPESInvitrogen, USA15630106
HF 90/240 IncubatorHeal Force, Switzerlandnull
IL-4PeproTech, USA042149
L929 cell lineFENGHUISHENGWU, China NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462)
Laser Scanning Confocal MicroscopyZeiss, GermanyLSM 980
MONTANE 85 PPISEPPIC, FranceL12910
MONTANOX 80 PPISEPPIC, France36372K
Mouse IFN-γ ELISA kitDakewe, China1210002
Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kitDakewe, ChinaDKW22-2000-096
Mouse IL-17A ELISA kitDakewe, China1211702
Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kitebiosciences, USA3521-4HPW-2
Mouse IL-1β ELISA kitDakewe, China1210122
Mouse IL-6 ELISA kitDakewe, China1210602
Mouse TNF-α ELISA kitDakewe, China1217202
Non-essential amino acids(100x)Invitrogen, USA11140050
Ophiopogonin-DChengdu Purui Technology Co. Ltd945619-74-9
Penicillin-Streptomycin SolutionInvitrogen, USA15070063
PhalloidinSolarbio, ChinaCA1620
Phosphate Buffered SalineZSGB-BIO, ChinaZLI-9062
Red Blood Cell Lysis BufferSolarbio, ChinaR1010
RPMI 1640 mediumHyclone (Life Technology), USASH30809.01
Sodium pyruvate(100 mM)Invitrogen, USA11360070
SqualeneSigma, USAS3626
β- MercaptoethanolInvitrogen, USA21985023

Referanslar

  1. Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
  2. Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
  3. Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
  4. Kuo, T. Y., et al. Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19. Scientific Reports. 10, 20085 (2020).
  5. Twentyman, E., et al. Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged >/=18 years - United States, July 2022. MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).
  6. Wang, Z., et al. Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens. ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).
  7. Wang, N., Chen, M., Wang, T. Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization. Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).
  8. Akin, I., et al. Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis. Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).
  9. Lacaille-Dubois, M. A. Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review. Phytomedicine. 60, 152905 (2019).
  10. Marty-Roix, R., et al. Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).
  11. Zhang, Y. Y., et al. Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).
  12. An, E. J., et al. Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).
  13. Song, X., et al. Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken. Pesquisa Veterinária Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).
  14. Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
  15. Lin, C. A., et al. Hyaluronic acid-glycine-cholesterol conjugate-based nanoemulsion as a potent vaccine adjuvant for T cell-mediated immunity. Pharmaceutics. 13 (10), 1569 (2021).
  16. Xu, H. H., et al. Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D' in vivo. Chinese Medicine. 16 (1), 3 (2021).
  17. Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines. Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).
  18. Rudolf, R., et al. Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite. Materials. 13 (12), 2717 (2020).
  19. Cannella, V., et al. Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line. BioMed Research International. 2019, 3469525 (2019).
  20. Jiao, G., et al. Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity. RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).
  21. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
  22. Li, W., Zhou, J., Xu, Y. Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices. Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).
  23. Wu, F., et al. Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury. Journal of Neuroimmunology. 344, 577264 (2020).
  24. Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. Structure and function of the immune system in the spleen. Science Immunology. 4 (33), (2019).
  25. Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay. Methods. 38 (4), 274-282 (2006).
  26. Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
  27. Zhou, Y., et al. CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis. Frontiers in Immunology. 13, 967410 (2022).
  28. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Frontiers in Bioscience. 13, 453-461 (2008).
  29. Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. Adjuvant activity on murine and human macrophages. Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır