JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توفر الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية (hiPSC-CMs) بديلا لاستخدام الحيوانات لفحص السمية القلبية قبل السريرية. من القيود المفروضة على التبني الواسع النطاق ل hiPSC-CMs في فحص السمية قبل السريرية هو النمط الظاهري غير الناضج الذي يشبه الجنين للخلايا. تظهر هنا بروتوكولات للنضج القوي والسريع ل hiPSC-CMs.

Abstract

تستخدم الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية (hiPSC-CMs) لتحل محل وتقليل الاعتماد على الحيوانات والخلايا الحيوانية لاختبار السمية القلبية قبل السريرية. في تنسيقات أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد ، تلخص hiPSC-CMs بنية ووظيفة خلايا عضلة القلب البشرية البالغة عند زراعتها على مصفوفة مثالية خارج الخلية (ECM). ينضج ECM المشتق من الخلايا الجذعية البشرية في الفترة المحيطة بالولادة (مصفوفة خارج الخلية تحفز النضج) هيكل hiPSC-CM ووظيفته وحالة التمثيل الغذائي في 7 أيام بعد الطلاء.

تستجيب أحاديات الطبقة الناضجة hiPSC-CM أيضا كما هو متوقع للأدوية ذات الصلة سريريا ، مع وجود خطر معروف للتسبب في عدم انتظام ضربات القلب والسمية القلبية. كان نضوج الطبقات الأحادية hiPSC-CM عقبة أمام الاعتماد الواسع النطاق لهذه الخلايا القيمة للعلوم التنظيمية وفحص السلامة ، حتى الآن. تقدم هذه المقالة طرقا تم التحقق من صحتها للطلاء والنضج والتنميط الظاهري الوظيفي عالي الإنتاجية لوظيفة الفيزيولوجيا الكهربية والانقباض hiPSC-CM. تنطبق هذه الطرق على خلايا عضلة القلب النقية المتاحة تجاريا ، وكذلك خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية التي يتم إنشاؤها داخليا باستخدام بروتوكولات تمايز عالية الكفاءة خاصة بالغرفة.

يتم قياس وظيفة الفيزيولوجيا الكهربية عالية الإنتاجية باستخدام إما الأصباغ الحساسة للجهد (VSDs ؛ الانبعاثات: 488 نانومتر) ، أو الفلوروفورات الحساسة للكالسيوم (CSFs) ، أو مستشعرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GCaMP6). يتم استخدام جهاز رسم الخرائط الضوئية عالي الإنتاجية للتسجيلات البصرية لكل معلمة وظيفية ، ويتم استخدام برنامج مخصص مخصص لتحليل البيانات الكهربية. يتم تطبيق بروتوكولات MECM لفحص الأدوية باستخدام مؤثرات إينوتروب إيجابية (إيزوبرينالين) وحاصرات خاصة بقناة الجينات البشرية المرتبطة بالأثير (hERG). ستمكن هذه الموارد الباحثين الآخرين من الاستفادة بنجاح من hiPSC-CMs الناضجة لفحص السمية القلبية قبل السريرية عالي الإنتاجية واختبار فعالية أدوية القلب وأبحاث القلب والأوعية الدموية.

Introduction

تم التحقق من صحة الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية (hiPSC-CMs) على نطاق دولي ، وهي متاحة لفحص السمية القلبية في المختبر 1. يمكن إنشاء hiPSC-CMs عالية النقاء بأعداد غير محدودة تقريبا ، وحفظها بالتبريد ، وإذابتها. عند إعادة الطلاء ، يقومون أيضا بإعادة التنشيط ويبدأون في التعاقد مع إيقاع يذكرنا بقلب الإنسان 2,3. ومن اللافت للنظر أن hiPSC-CMs الفردية تتزاوج مع بعضها البعض وتشكل تخليقية وظيفية تنبض كنسيج واحد. في الوقت الحاضر ، يتم اشتقاق hiPSCs بشكل روتيني من عينات دم المريض ، لذلك يمكن تمثيل أي شخص باستخدام فحوصات فحص السمية القلبية hiPSC-CM في المختبر 4,5. هذا يخلق الفرصة لإجراء "التجارب السريرية في طبق" ، مع تمثيل كبير من مجموعات سكانية متنوعة6.

تتمثل إحدى المزايا الحاسمة على مناهج فحص السمية القلبية للخلايا الحيوانية والحيوانية الحالية في أن hiPSC-CMs تستخدم الجينوم البشري الكامل وتقدم نظاما في المختبر مع أوجه تشابه وراثية مع قلب الإنسان. هذا جذاب بشكل خاص لعلم الصيدلة الجيني والطب الشخصي - من المتوقع أن يوفر استخدام hiPSC-CMs للأدوية وتطوير العلاجات الأخرى وصفات أدوية أكثر دقة ودقة وأمانا. في الواقع ، أثبتت فحوصات أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد (2D) hiPSC-CM أنها تنبئ بسمية القلب للأدوية ، باستخدام لوحة من الأدوية المستخدمة سريريا مع خطر معروف للتسبب في عدم انتظام ضربات القلب1،7،8،9. على الرغم من الإمكانات الهائلة ل hiPSC-CMs والوعد بتبسيط وجعل تطوير الأدوية أرخص ، كان هناك إحجام عن استخدام هذه المقايسات الجديدة10،11،12.

حتى الآن ، فإن أحد القيود الرئيسية على التبني والقبول الواسع النطاق لفحوصات فحص hiPSC-CM هو مظهرها غير الناضج الشبيه بالجنين ، فضلا عن وظيفتها. تمت مراجعة ومناقشة القضية الحرجة لنضج hiPSC-CM في الأدبيات العلمية ad nauseum13،14،15،16. وبالمثل ، تم استخدام العديد من الأساليب لتعزيز نضوج hiPSC-CM ، بما في ذلك التلاعب بالمصفوفة خارج الخلية (ECM) في أحاديات الطبقات ثنائية الأبعاد وتطوير أنسجة القلب المهندسة ثلاثية الأبعاد (EHTs) 17،18. في الوقت الحالي ، هناك اعتقاد سائد على نطاق واسع بأن استخدام 3D EHTs سيوفر نضجا فائقا مقارنة بالنهج القائمة على 2D أحادية الطبقة. ومع ذلك ، توفر الطبقات الأحادية 2D كفاءة أعلى لاستخدام الخلايا وزيادة النجاح في الطلاء مقارنة ب 3D EHTs ؛ تستخدم 3D EHTs أعدادا أكبر من الخلايا ، وغالبا ما تتطلب إدراج أنواع أخرى من الخلايا يمكن أن تربك النتائج. لذلك ، في هذه المقالة ، ينصب التركيز على استخدام طريقة بسيطة لنضج hiPSC-CMs المستزرعة كطبقة أحادية 2D من الخلايا المقترنة كهربائيا وميكانيكيا.

يمكن تحقيق نضج hiPSC-CM المتقدم في أحادي الطبقات 2D باستخدام ECM. يمكن نضج الطبقات الأحادية 2D من hiPSC-CMs باستخدام غطاء بوليديميثيل سيلوكسان ناعم ومرن ، مطلي بمصفوفة غشاء قاعدي تفرزها خلية ساركوما فأر Engelbreth-Holm-Swarm (الماوس ECM). في عام 2016 ، أظهرت التقارير أن hiPSC-CMs المستزرعة على حالة ECM الناعمة هذه نضجت وظيفيا ، حيث أظهرت سرعات توصيل جهد الفعل بالقرب من قيم قلب البالغين (~ 50 سم / ثانية) 18. علاوة على ذلك ، أظهرت هذه hiPSC-CMs الناضجة العديد من الخصائص الكهربية الأخرى التي تذكرنا بقلب البالغين ، بما في ذلك إمكانات غشاء الراحة المفرط الاستقطاب والتعبير عن Kir2.1. في الآونة الأخيرة ، حددت التقارير طلاء ECM البشري المشتق من الخلايا الجذعية في الفترة المحيطة بالولادة والذي يعزز النضج الهيكلي ل 2D hiPSC-CMs19. هنا ، يتم تقديم طرق سهلة الاستخدام لأحادية الطبقات 2D hiPSC-CM الناضجة هيكليا لاستخدامها في الشاشات الكهربية عالية الإنتاجية. علاوة على ذلك ، نقدم التحقق من صحة أداة رسم الخرائط الضوئية للاكتساب والتحليل الآلي لوظيفة الفيزيولوجيا الكهربية أحادية الطبقة 2D hiPSC-CM ، باستخدام الأصباغ الحساسة للجهد (VSDs) والمجسات والبروتينات الحساسة للكالسيوم.

Protocol

تمت الموافقة على استخدام hiPSC في هذا البروتوكول من قبل لجنة HPSCRO بجامعة ميشيغان (لجنة الإشراف على الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات). انظر جدول المواد للحصول على قائمة بالمواد والمعدات. انظر الجدول 1 للاطلاع على الوسائط ومؤلفاتها.

1. إذابة الجليد والطلاء المتاحان تجاريا hiPSC-CMs المحفوظة بالتبريد للنضج على مصفوفة خارج الخلية تحفز النضج (MECM)

  1. قم بتسخين جميع الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة وأعد ترطيب ألواح MECM بمحلول ملح هانك المتوازن (HBSS) أو محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم ، لمدة 1 ساعة قبل طلاء خلايا عضلة القلب (200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكل بئر من صفيحة 96 بئرا).
  2. اغسل ألواح MECM 2x باستخدام HBSS أو PBS التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم لمدة 1 ساعة قبل طلاء عضلة القلب (200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكل بئر من صفيحة 96 بئرا) وحافظ على رطوبة الآبار.
  3. تحضير حمام مائي 37 درجة مئوية.
  4. قم بإزالة أنابيب الخلايا العضلية القلبية من خزان النيتروجين السائل ، وانقل الأنابيب إلى الثلج الجاف ، وافتح أغطية الأنبوب قليلا لتحرير الضغط.
    ملاحظة: تحرير الضغط في الأنابيب مهم للغاية ! إذا تراكم الكثير من الضغط داخل الأنابيب ، فقد تنفجر.
  5. أعد إغلاق أغطية الأنابيب وضعها في حمام مائي لتذوب لمدة 4 دقائق.
    ملاحظة: اسمح لها بالذوبان تماما ، لتجنب تلف الخلايا بسبب الذوبان الجزئي.
  6. بعد ذوبان الخلايا ، قم برش الأنابيب بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل الفتح. انقل الخلايا إلى أنابيب مخروطية سعة 15 مل باستخدام ماصة سعة 1 مل. قم بالتنقيط ببطء 8 مل من وسط الطلاء ، مع تحريك الأنبوب في كل مرة يتم فيها إضافة 1 مل ، للسماح للخلايا بالتكيف مع التغيرات في الأسمولية.
    1. اغسل المبرد ب 1 مل من وسط الطلاء باستخدام ماصة زجاجية سعة 1 مل. ثم ، قم بتقطير الغسيل ببطء في الأنبوب المخروطي سعة 15 مل.
  7. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في ~ 300 × غرام لمدة 5 دقائق. نضح الطافع وإعادة تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط الطلاء. إزالة القسمة وإجراء عد الخلايا الحية باستخدام مقياس الدم. أضف وسط طلاء إضافي للحصول على 7.5 × 105 خلايا / مل.
    ملاحظة: مطلوب حوالي 10 مل من تعليق الخلية لإعداد 96 بئرا.
  8. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر من لوحة 96 بئر مطلية ب MECM باستخدام ماصة متعددة القنوات.
    ملاحظة: تأكد من تجنب ترسيب الخلية والحصول على كثافة خلية موحدة في جميع الآبار أثناء الطلاء.
  9. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة يومين قبل تغيير الوسط إلى وسط الصيانة (200 ميكرولتر / بئر). قم بتغيير وسيط الصيانة في اليوم 5 بعد الذوبان. قم بإجراء فحوصات EP في اليوم 7 أو ما بعده ، كما هو موضح سابقا 8,9. قم بتغيير الوسط كل يوم عند اختيار توسيع ثقافة الخلية.

2. التمايز الموجه للقلب hiPSC وتنقية hiPSC-CM

  1. محلول حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك الدافئ المتوفر تجاريا 1x (EDTA) ، HBSS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم (HBSS--) ، وألواح 6 آبار مطلية بمصفوفة غشاء قاعدي قابلة للذوبان تفرزها خلية ساركوما فأر Engelbreth-Holm-Swarm (الماوس ECM) إلى درجة حرارة الغرفة.
  2. قم بتمييز المستعمرات المتمايزة عن طريق الفحص المجهري على النقيض من الطور ونضح / استئصال. اغسل كل بئر ب 1 مل من HBSS--. قم بإجراء غسلتين في الآبار التي تحتوي على >10 نقاط تمايز.
  3. استنشاق HBSS - وإضافة 1 مل من محلول EDTA إلى كل بئر. احتضن الأطباق لمدة تصل إلى 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. تحقق من اللوحات بعد 3 دقائق وابحث عن مستعمرات بيضاء شفافة مرئية.
  4. نضح محلول EDTA وإضافة 1 مل إلى بئر واحد. قم بإزاحة الخلايا التي تحتوي على 2 مل من وسط hiPSC عن طريق سحب المعلق لأعلى ولأسفل بشكل متكرر ، باستخدام ماصة زجاجية سعة 10 مل لفصل جميع الخلايا الجذعية عن البئر ، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب تجميع. كرر الطموح والنزوح مع الآبار اللاحقة.
    ملاحظة: قم بإزاحة المستعمرات التي يصعب رفعها بطرف الماصة الزجاجية.
  5. عد الخلايا الجذعية واضبط الحجم على اللوحة 8.0 × 105 خلايا / بئر. استزرع الخلايا على وسط hiPSC (2 مل / بئر) حتى تصل الخلايا الجذعية إلى التقاء 90٪ (يشار إلى هذه المرة من الآن فصاعدا باسم D0).
  6. تحضير 2 مل من وسط التمايز القاعدي المكمل ب 4 ميكرومتر من CHIR99021.
  7. في D0 ، اغسل كل بئر من صفيحة 6 آبار من الخلايا الجذعية مع 1 مل من HBSS لكل بئر. استبدل HBSS بوسط تمايز قاعدي مكمل ب 4 ميكرومتر من CHIR99021.
  8. في D1 ، لا تفعل شيئا.
  9. في D2 ، قم بإعداد وسط التمايز القاعدي المكمل ب 4 ميكرومتر من IWP4.
  10. استبدل الوسط ب 2 مل من وسط التمايز القاعدي المكمل ب IWP4 لكل بئر.
  11. في D3 ، لا تفعل شيئا من أجل التمايز الخاص بالبطين. للحصول على تمايز خاص بالأذينين ، قم باستنشاق الوسط وإضافة 2 مل من الوسط القاعدي المكمل ب 4 ميكرومتر من IWP4 و 1 ميكرومتر من محلول حمض الريتينويك (RA) لكل بئر.
  12. في D4 ، نضح الوسط وأضف 2 مل من الوسط القاعدي لكل بئر لتمايز البطين. للتمايز الأذيني ، قم باستنشاق الوسط وإضافة 2 مل من الوسط القاعدي المكمل بمحلول RA 1 ميكرومتر لكل بئر.
  13. في D5 ، لا تفعل شيئا.
  14. في D6 ، نضح الوسط وأضف 2 مل من الوسط القاعدي لكل بئر (لكل من التمايز الأذيني والبطيني).
  15. في D7 ، لا تفعل شيئا.
  16. في D8 ، نضح الوسط وأضف 2 مل من وسط صيانة عضلة القلب. قم بتغيير الوسط كل يومين حتى انفصال الخلايا ، أو اتبع خطة التعرض المزمن للأدوية.

3. تنقية hiPSC-CM عبر MACS (فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا)

  1. نضح وسط زراعة الخلايا وغسل كل بئر مع 1 مل من HBSS--. فصل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من 0.25٪ تربسين / EDTA واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 10 دقائق. أعد تعليق الخلايا وتفردها في كل بئر باستخدام 2 مل من وسط الطلاء لتعطيل التربسين / EDTA.
  2. اجمع الخلايا من الآبار الستة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع مصفاة 70 ميكرومتر. ثم اغسل المصفاة ب 3 مل من وسط الطلاء. عد الخلايا.
  3. أجهزة الطرد المركزي التعليق في ~ 300 × غرام لمدة 5 دقائق. نضح المادة الطافية واغسل الخلايا ب 20 مل من المخزن المؤقت لفصل MACS المثلج البارد. ثم ، أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في ~ 300 × غرام لمدة 5 دقائق.
  4. أعد تعليق الحبيبات في 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفصل MACS البارد لكل 5 × 106 خلايا. أضف 20 ميكرولتر من كوكتيل استنفاد الخلايا العضلية غير القلبية الباردة (الإنسان) لكل 5 × 106 خلايا. اخلطي تعليق الخلية برفق واحتضنها على الثلج لمدة 10 دقائق.
  5. اغسل العينة بإضافة 4 مل من المخزن المؤقت لفصل MACS البارد لكل 5 × 106 خلايا. أجهزة الطرد المركزي العينة في ~ 300 × غرام لمدة 5 دقائق ونضح طاف طاف.
  6. أعد تعليق الحبيبات في 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفصل MACS البارد لكل 5 × 106 خلايا. أضف 20 ميكرولتر من الميكروبيدات الباردة المضادة للبيوتين لكل 5 × 106 خلايا. امزج تعليق الخلية برفق واحتضنه لمدة 10 دقائق على الثلج.
  7. أثناء احتضان العينات ، ضع أعمدة الاستنفاد الإيجابية (المزودة بمرشحات ما قبل الفصل 30 ميكرومتر) على فاصل MACS ، وضع أنابيب التجميع 15 مل الموسومة أسفل الأعمدة. هناك حاجة إلى عمود واحد لكل 5 × 106 خلايا.
  8. قم بتجهيز كل عمود ب 3 مل من المخزن المؤقت لفصل MACS البارد. امزج معلق الخلية المعالج بالأجسام المضادة مع 2 مل من المخزن المؤقت لفصل MACS لكل 5 × 106 خلايا ، وأضفه إلى العمود.
    ملاحظة: لا أجهزة الطرد المركزي! الطرد المركزي في هذه الخطوة له آثار ضارة على إنتاج عضلة القلب.
  9. أضف 2 مل من المخزن المؤقت لفصل MACS إلى كل عمود ، واجمع التدفق حتى يتم جمع 12 مل من تعليق خلايا عضلة القلب المتدفقة.
    ملاحظة: لا تدع الأعمدة تجف تماما.
  10. أجهزة الطرد المركزي للخلايا العضلية القلبية في ~ 300 × غرام لمدة 5 دقائق ، وتجاهل الطافية ، وتعليق خلايا عضلة القلب في 1 مل من وسط الطلاء.
  11. عد الخلايا لتحديد التركيز ، واضبط الحجم على كثافة البذر المطلوبة ، وقم بلوحة الخلايا. صفيحة الخلايا العضلية القلبية المنقاة على ألواح MECM 96-Well ، كما هو موضح أعلاه في الخطوات 1.9-1.11 (7.5 × 105 خلايا / بئر).

4. رسم الخرائط البصرية باستخدام الأصباغ الحساسة للجهد (VSDs) والفلوروفورات الحساسة للكالسيوم (CSFs)

  1. تحضير الكمية المناسبة من VSD في HBSS مع الكالسيوم والمغنيسيوم ، عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من صبغة VSD لكل مل من HBSS و 10 ميكرولتر من مساعد التحميل لكل مل من HBSS.
    ملاحظة: عادة ، تتطلب لوحة 96 بئرا 10 مل من محلول VSD.
  2. بدلا من ذلك ، قم بإعداد HBSS مع الكالسيوم والمغنيسيوم المكمل ب 5 ميكرومتر من السائل الدماغي النخاعي. نضح وسط صيانة خلايا عضلة القلب واستبدله ب 100 ميكرولتر من VSD أو CSF لكل بئر من صفيحة 96 بئرا. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا.
  3. قم بإزالة الأصباغ واستبدلها بوسيط الفحص أو HBSS. التوازن عند 37 درجة مئوية للحصول على رسم الخرائط البصرية للبيانات الأساسية باستخدام جهاز رسم الخرائط الضوئية عالي الإنتاجية.
  4. عالج الخلايا بالأدوية لاختبار التعرض الحاد ، أو قم بتعيين الخلايا التي تعرضت بشكل مزمن للعقاقير ذات الأهمية.
  5. لاختبار السمية القلبية في 96 لوحة بئر ، استخدم أربع جرعات من مركب يحتوي على ستة آبار على الأقل لكل جرعة. استخدم جرعات تتراوح من أقل إلى أعلى من تركيز البلازما العلاجية الفعال ، بما في ذلك جرعة من تركيز البلازما العلاجية الفعالة سريريا.
  6. تمييع الأدوية في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، وتخزينها كمحاليل مخزون عند -20 درجة مئوية ، ثم تخفيفها في HBSS إلى التركيزات المطلوبة.
  7. قم بإجراء قياسات الفيزيولوجيا الكهربية الأساسية قبل تطبيق الدواء ، كما هو موضح في القسم 5. بمجرد تطبيق الأدوية ، قم بإجراء تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية بعد 30 دقيقة على الأقل للدراسات المزمنة. راجع الأقسام التالية للحصول على بيانات الخرائط الضوئية وإجراءات تحليلها.

5. رسم الخرائط البصرية باستخدام مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا (GECI)

  1. لوحة متاحة تجاريا أو hiPSC-CMs منقاة من MACS ، كما هو موضح أعلاه ، باستخدام ألواح 96 بئر مطلية ب MECM لصنع hiPSC-CMs ناضجة. لتشكيل طبقة أحادية متقاربة ، لوحة 7.5 × 104 سم لكل بئر من كل لوحة 96 بئر. استخدام وسط الطلاء.
  2. بعد 48 ساعة في وسط الطلاء ، قم بالتبديل إلى وسط صيانة عضلة القلب.
  3. في اليوم الرابع بعد الذوبان وإعادة الطلاء ، أضف الفيروس الغدي المؤتلف للتعبير عن GCaMP6m (AdGCaMP6m) إلى الخلايا عند تعدد العدوى (MOI) = 5. أضف الفيروس باستخدام وسيط مقايسة CM.
    ملاحظة: هنا ، تم إجراء تجارب باستخدام GCaMP6m في خلايا عضلة القلب iCell2 من بائع تجاري.
  4. في اليوم 5 ، قم بإزالة وسيط adGCaMP6m واستبدله ب RPMI + B27 جديد (وسط صيانة عضلة القلب).
  5. في اليوم 7 ، راقب CMs باستخدام المجهر أو تصوير الخرائط البصرية ، لتصور الانقباضات التلقائية وعابرات الكالسيوم المقابلة.
  6. في اليوم 7 أو بعد ذلك ، لفحص الدواء ، انقل مباشرة 96 لوحة بئر من الطبقات الأحادية الناضجة hiPSC-CM التي تعبر عن GCaMP6m إلى جهاز تصوير الخرائط البصري من الحاضنة للحصول على بيانات خط الأساس.
  7. بعد الحصول على بيانات الفيزيولوجيا الكهربية ، أعد لوحات CMs إلى حاضنة زراعة الأنسجة ، لإجراء قياسات في نقطة زمنية لاحقة.
  8. باتباع التسجيلات الأساسية ، قم بتطبيق الأدوية ، باستخدام أربع جرعات على الأقل من كل دواء وستة آبار على الأقل لكل جرعة. قم بموازنة الأدوية على الخلايا لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل جمع البيانات. قم بتسخين درجة حرارة البئر إلى ~ 37 °C قبل وأثناء الحصول على البيانات.
  9. بعد التسجيلات الأساسية للوحة كاملة ، أضف الأيزوبروتيرينول (500 نانومتر) إلى كل بئر لتمكين بيانات الاستجابة القوية للأدوية. تحديد آثار الأيزوبروتيرينول على معدل النبض أحادي الطبقة ، وسعة الانكماش (سعة الكالسيوم العابرة) ، ومدة الكالسيوم العابرة (انظر الشكل 6) ، كما هو موضح في القسم 5.

6. الحصول على بيانات الخرائط البصرية وتحليلها

  1. تأكد من تشغيل كاميرا جهاز رسم الخرائط الضوئية وجهاز الإرسال وسخان اللوحة.
  2. افتح برنامج الاستحواذ وحدد موقع حفظ الملف.
  3. افتح الدرج الأمامي وضع اللوحة على سخان اللوحة.
  4. احصل على إطار داكن بالنقر فوق الزر "إطار داكن ".
  5. حدد المدة (10-30 ثانية) ومعدل اكتساب الإطارات (على سبيل المثال، 100 إطار في الثانية؛ 250 إطارا في الثانية للحصول على دقة زمنية أعلى)، وانقر فوق بدء الاستحواذ.
  6. افتح برنامج التحليل، وفي علامة التبويب استيراد/تصفية ، حدد إما الاستعراض بحثا عن ملف واحد أو تجانب متعدد لإعادة إنشاء لوحة.
  7. حدد وضع المعلمات (APD أو CaTD)، أدخل المسافة لكل بكسل، واستخدم معالج البئر لتحديد مكان الآبار في الصورة. انقر فوق عملية حفظ للانتقال إلى علامة التبويب التالية.
  8. افتح علامة التبويب ROIs (مناطق الاهتمام) واختر رسم عائد الاستثمار يدويا أو تلقائيا أو عدم استخدام عائد الاستثمار على الإطلاق ، والذي سينظر بعد ذلك في البئر بالكامل للتحليل. بعد تحديد عائد الاستثمار ، انقر فوق معالجة / حفظ زر للانتقال إلى الخطوة التالية. حدد مربعات إخفاء الآبار وإظهار المربعات التي تمت تصفيتها فقط لتصور عائد الاستثمار.
  9. افتح علامة التبويب التحليل ، وفي أعلى الجانب الأيمن من الشاشة ، حدد كل بئر أو عائد استثمار لتأكيد دقة الكشف التلقائي عن النبضات. قم بإضافة أو إزالة Beats من الآثار بالضغط على Add Beat / Save Beats ، أو عن طريق تحديد Beat فردي والضغط على Delete على لوحة المفاتيح.
  10. اختياريا ، استخدم ميزة خرائط متوسط الحرارة لإنشاء خرائط حرارية للمعلمات المحددة للوحة.
  11. انقر فوق الزر Time-Space Plot في علامة التبويب Analysis لتصور البيانات لكل بئر أو عائد الاستثمار. بعد التأكد من دقة اكتشاف الإيقاع ، انتقل إلى علامة التبويب تصدير وحدد تنسيق الملف. اضغط على تصدير وأنشئ مجلدا للبيانات المراد تصديرها إليه. تابع لفتح ملفات البيانات وتشغيل روتين التحليل الإحصائي المختار.
    ملاحظة: يفضل ملفات .xlxs حيث يتم تصدير كافة المعلمات في ملف واحد; تقوم التنسيقات الأخرى (.csv أو .tsv) بإنشاء ملف واحد لكل معلمة.

النتائج

يتميز نضوج hiPSC-CM بتباين الطور والتصوير المناعي البؤري
يتم عرض الجدول الزمني للنضج بوساطة ECM ل hiPSC-CMs المتاحة تجاريا باستخدام ألواح 96 بئر مطلية ب MECM في الشكل 1A. يتم جمع هذه البيانات باستخدام خلايا عضلة القلب المتاحة تجاريا والتي تصل إلى المختبر كقوارير محفوظة بالتب...

Discussion

هناك عدة طرق مختلفة لفحص سمية القلب في المختبر باستخدام hiPSC-CMs. قدمت ورقة "أفضل الممارسات" الأخيرة حول استخدام hiPSC-CMs المقايسات المختلفة في المختبر ، وقراءاتها الأولية ، والأهم من ذلك ، دقة كل فحص لتحديد وظيفة الفيزيولوجيا الكهربية للقلب البشري20. بالإضافة إلى استخدام ?...

Disclosures

TJH هو مستشار ومستشار علمي لشركة StemBioSys، Inc. TB هو موظف في StemBioSys، Inc. AMR و JC مستشاران سابقان لشركة StemBioSys، Inc. TJH و TB و AMR و JC مساهمون في StemBioSys، Inc.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة HL148068-04 و R44ES027703-02 (TJH).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin EDTAGibco25200-056
0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L)Millipore SigmaA3294
2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)Millipore SigmaH4034
AdGCaMP6mVector biolabs1909
Albumin humanSigmaA9731-1G
alpha actinin antibodyThermoFisherMA1-22863
B27Gibco17504-044
BlebbistatinSigmaB0560
CalBryte 520AMAAT Bioquest20650
CELLvo MatrixPlus 96wpStemBiosysN/Ahttps://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus
CHIR99021LC Laboratoriesc-6556
Clear Assay medium (fluorobrite)ThermoFisherA1896701For adenovirus transduction
DAPIThermoFisher62248
DMEM:F12Gibco11330-032
FBS (Fetal Bovine Serum)SigmaF4135-500ML
FluoVoltThermoFisherF10488
HBSSGibco14025-092
iCell CM maintenance mediaFUJIFILM/Cellular DynamicsM1003
iCell2 CMsFUJIFILM1434
Incucyte Zoom Sartorius
iPS DF19-9-11T.HWiCell
IsoproterenolMilliporeSigmaCAS-51-30-9
IWP4Tocris5214
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrateSigmaA8960-5g
L-glutamineGibcoA2916801
LS columnsMiltenyii Biotec130-042-401
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)Miltenyii Biotec130-091-221
MatrigelCorning354234
MitoTracker RedThermoFisherM7512
Nautilus HTS Optical Mapping CuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Nikon A1R Confocal MicroscopeNikon
nonessential amino acidsGibco11140-050
pre-separation filterMiltenyii Biotec130-041-407
PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, humanMiltenyii Biotec130-110-188
PulseCuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Quadro MACS separator (Magnet)Miltenyii Biotec130-091-051
Retinoic acidSigmaR2625
RPMI 1640 Gibco11875-093
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)Gibco22400-089
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyii Biotec130-107-086
TnI antibody (pan TnI)Millipore SigmaMAB1691 
Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution)Gibco15040-066
Y-27632 dihydrochlorideTocris1254
β-mercaptoethanolGibco21985023

References

  1. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  2. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  3. Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
  4. Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
  5. Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical trials in a dish. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).
  6. Blinova, K., et al. Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs. Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).
  7. Blinova, ., et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
  8. da Rocha, A. M., et al. hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen. Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).
  9. da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay. Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).
  10. Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
  11. Lam, C. K., Wu, J. C. Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come. European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).
  12. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
  13. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
  14. Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: new phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
  15. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
  16. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  17. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  18. Herron, T. J., et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).
  19. Block, T., et al. Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes. Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).
  20. Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
  21. Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  23. Davis, J., et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).
  24. Diaz, R. J., Wilson, G. J. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models. Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved