使用成熟的人诱导多能干细胞来源心肌细胞单层进行高通量心脏毒性筛选

摘要

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）为使用动物进行临床前心脏毒性筛查提供了一种替代方案。hiPSC-CMs在临床前毒性筛查中广泛采用的一个限制是细胞的不成熟，胎儿样表型。这里介绍的是用于hiPSC-CMs稳健和快速成熟的方案。

摘要

人诱导干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）用于替代和减少对动物和动物细胞的依赖，以进行临床前心脏毒性测试。在二维单层形式中，hiPSC-CMs概括了在最佳细胞外基质（ECM）上培养的成人心肌细胞的结构和功能。人围产期干细胞衍生的ECM（成熟诱导细胞外基质-MECM）在铺板后7天内使hiPSC-CM结构、功能和代谢状态成熟。

成熟的hiPSC-CM单层对临床相关药物也有预期的反应，已知有引起心律失常和心脏毒性的风险。到目前为止，hiPSC-CM单层的成熟是这些有价值的细胞广泛用于监管科学和安全筛选的障碍。本文介绍了用于hiPSC-CM电生理和收缩功能的电镀、成熟和高通量功能表型的验证方法。这些方法适用于市售纯化的心肌细胞，以及使用高效的腔室特异性分化方案在内部生成的干细胞来源的心肌细胞。

使用电压敏感染料 （VSD;发射波长:488 nm）、钙敏感荧光团 （CSF） 或基因编码钙传感器 （GCaMP6） 测量高通量电生理功能。高通量光学映射设备用于每个功能参数的光学记录，并使用定制的专用软件进行电生理数据分析。MECM方案用于使用正性肌力药物（异丙肾上腺素）和人乙醚相关基因（hERG）通道特异性阻断剂进行药物筛查。这些资源将使其他研究人员能够成功地利用成熟的hiPSC-CMs进行高通量，临床前心脏毒性筛查，心脏药物疗效测试和心血管研究。

引言

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已在国际范围内得到验证，可用于体外心脏毒性筛查¹。高纯度的hiPSC-CMs可以产生几乎无限的数量，冷冻保存和解冻。重新镀层后，它们也会复活并开始以让人联想到人类心脏的节奏收缩^2，3。值得注意的是，单个hiPSC-CMs相互偶联并形成功能性合胞体，作为单个组织跳动。如今，hiPSCs通常来自患者的血液样本，因此任何人都可以使用体外hiPSC-CM心脏毒性筛查测定4^，5来代表。这为进行"培养皿中的临床试验"创造了机会，来自不同人群的重要代表性⁶.

与现有的动物和动物细胞心脏毒性筛选方法相比，一个关键优势是hiPSC-CMs利用完整的人类基因组，并提供与人类心脏具有遗传相似性的体外系统。这对于药物基因组学和个性化医疗特别有吸引力 - 使用hiPSC-CMs进行药物和其他治疗开发预计将提供更准确，精确和安全的药物处方。事实上，二维（2D）hiPSC-CM单层测定已被证明可以预测药物的心脏毒性，使用一组临床使用的药物，已知有引起心律失常的风险1，⁷，^8，9。尽管hiPSC-CMs具有巨大的潜力，并且有望简化和降低药物开发成本，但人们一直不愿意使用这些新型检测方法¹⁰，^11，12。

到目前为止，广泛采用和接受hiPSC-CM筛查测定的一个主要限制是它们不成熟的胎儿外观以及它们的功能。hiPSC-CM成熟的关键问题已经在科学文献中进行了回顾和辩论，并进行了恶心¹³，^14，15，16。同样，已经采用了许多方法来促进hiPSC-CM成熟，包括2D单层中的细胞外基质（ECM）操作和3D工程心脏组织（EHT）的开发^17，18。目前，人们普遍认为，相对于基于2D单层的方法，使用3D EHT将提供更高的成熟度。然而，与 3D EHT 相比，2D 单层提供了更高的细胞利用效率，并提高了电镀成功率;3D EHT利用更多的细胞，并且通常需要包含可能混淆结果的其他细胞类型。因此，在本文中，重点是使用一种简单的方法来成熟培养为电和机械耦合细胞的2D单层的hiPSC-CMs。

先进的hiPSC-CM成熟可以使用ECM在2D单层中实现。hiPSC-CMs的2D单层可以使用柔软，灵活的聚二甲基硅氧烷盖玻片成熟，该盖玻片涂有由Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞（小鼠ECM）分泌的基底膜基质。2016年，报告显示，在这种软ECM条件下培养的hiPSC-CMs在功能上成熟，显示出接近成人心脏值（~50 cm / s）的动作电位传导速度¹⁸。此外，这些成熟的hiPSC-CMs显示出许多其他让人联想到成人心脏的电生理特征，包括超极化静息膜电位_{和K ir}2.1的表达。最近，报告发现了一种人类围产期干细胞衍生的ECM涂层，可促进2D hiPSC-CMs¹⁹的结构成熟。在这里，提出了结构成熟的2D hiPSC-CM单层的易于使用的方法，用于高通量电生理筛选。此外，我们还使用电压敏感染料（VSD）和钙敏感探针和蛋白质，提供用于自动采集和分析2D hiPSC-CM单层电生理功能的光学映射仪器的验证。

研究方案

该协议中的hiPSC使用已获得密歇根大学HPSCO委员会（人类多能干细胞监督委员会）的批准。有关材料和设备的列表，请参阅 材料表 。有关培养基及其组成，请参见 表1 。

1. 解冻和接种市售冷冻保存的 hiPSC-CM，以便在诱导成熟的细胞外基质 （MECM） 上成熟

1. 将所有试剂加热至室温，并在心肌细胞接种前用含有钙和镁的Hank平衡盐溶液（HBSS）或磷酸盐缓冲盐水（PBS）对MECM板进行再水化1小时（96孔板每孔200μL缓冲液）。
2. 在心肌细胞接种前，用含有钙和镁的HBSS或PBS洗涤MECM板2小时（96孔板每孔200μL缓冲液），并保持孔水分。
3. 准备37°C水浴。
4. 从液氮罐中取出心肌细胞管，将管转移到干冰中，然后稍微打开管盖以释放压力。
   注意:释放管中的 压力非常重要！ 如果管内压力过大，它们可能会爆炸。
5. 重新密封管盖并将其放入水浴中解冻4分钟。
   注意:让它们完全解冻，以避免由于部分解冻而损坏细胞。
6. 细胞解冻后，在打开前用70%乙醇喷洒试管。用 1 mL 移液器将细胞转移到 15 mL 锥形管中。缓慢滴入 8 mL 电镀介质，每次加入 1 mL 时搅拌试管，以使细胞适应渗透压的变化。
   1. 使用 1 mL 玻璃移液管用 1 mL 电镀介质清洗冷冻管。然后，将洗涤液慢慢滴入 15 mL 锥形管中。
7. 将试管以~300 ×g 离心5分钟。吸出上清液并将沉淀重悬于1mL电镀介质中。取出等分试样并用血细胞计数器进行活细胞计数。加入额外的电镀介质以获得 7.5 × 10⁵ 个细胞/mL。
   注意:制备96孔大约需要10 mL细胞悬液。
8. 使用多通道移液器在MECM包被的96孔板的每孔中分配100μL细胞悬液。
   注意:确保避免细胞沉淀，并在电镀时在所有孔中获得均匀的细胞密度。
9. 将细胞在37°C，5%CO₂ 下孵育2天，然后将培养基更换为维持培养基（200μL /孔）。解冻后第 5 天更换维持培养基。在第 7 天或更晚进行 EP 测定，如前所述^8，9。选择延长细胞培养物时，每隔一天更换一次培养基。

2. hiPSC心脏定向分化和hiPSC-CM纯化

1. 温热的 1x 市售乙二胺四乙酸 （EDTA） 溶液、不含钙和镁的 HBSS （HBSS--） 和涂有由 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤细胞（小鼠 ECM） 分泌的溶解基底膜基质的 6 孔板至室温。
2. 通过相差显微镜和吸液/消融标记分化的菌落。用 1 mL HBSS 洗涤每个孔--.在含有>10个分化点的孔中进行两次洗涤。
3. 吸出HBSS，并向每个孔中加入1mL的EDTA溶液。将板在37°C孵育长达5分钟。 3分钟后检查平板，寻找半透明的白色可见菌落。
4. 吸出EDTA溶液并向单个孔中加入1 mL。使用 10 mL 玻璃移液管将所有干细胞从孔中分离出来，通过反复上下移液悬浮液，用 2 mL hiPSC 培养基去除细胞，并将细胞悬液转移到收集管中。重复抽吸并移位与后续孔。
   注意:用玻璃移液器的尖端移开难以提起的菌落。
5. 计数干细胞并将体积调节至板8.0×10⁵ 细胞/孔。在hiPSC培养基（2 mL /孔）上培养细胞，直到干细胞达到90%汇合（此时从现在开始称为D₀）。
6. 制备 2 mL 基础分化培养基，补充有 4 μM CHIR99021。
7. 在D₀上，每孔用1mL HBSS洗涤6孔干细胞板的每个孔。用补充有4μMCHIR99021的基础分化培养基代替HBSS。
8. 在 D₁ 上，不执行任何操作。
9. 在D₂上，制备补充有4μMIWP4的基础分化培养基。
10. 用每孔 2 mL 补充 IWP4 的基础分化培养基替换培养基。
11. 在 D₃ 上，不对心室特异性分化执行任何操作。对于心房特异性分化，吸出培养基，每孔加入 2 mL 基础培养基，补充 4 μM IWP4 和 1 μM 视黄酸 （RA） 溶液。
12. 在D₄上，吸出培养基，每孔加入2 mL基础培养基以进行心室分化。对于心房分化，吸出培养基并每孔加入 2 mL 基础培养基，补充有 1 μM RA 溶液。
13. 在 D₅ 上，什么都不做。
14. 在D₆上，吸出培养基，每孔加入2mL基础培养基（用于心房和心室分化）。
15. 在 D₇ 上，什么都不做。
16. 在D₈上，吸出培养基并加入2mL心肌细胞维持培养基。每隔一天更换培养基，直到细胞分离，或遵循慢性药物暴露计划。

3. 通过MACS（磁性激活细胞分选） 纯 化hiPSC-CM

1. 吸出细胞培养基并用 1 mL HBSS 洗涤每个孔--.通过加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 并在 37 °C、5% CO₂ 下孵育 10 分钟来解离细胞。用 2 mL 电镀培养基重悬并奇异化每个孔中的细胞以灭活胰蛋白酶/EDTA。
2. 将六个孔中的细胞收集到带有 70 μm 过滤器的 50 mL 锥形管中。然后，用 3 mL 电镀介质清洗过滤器。计数细胞。
3. 将悬浮液以~300× g 离心5分钟。吸出上清液并用 20 mL 冰冷的 MACS 分离缓冲液洗涤细胞。然后，再次以~300 ×g 离心5分钟。
4. 将沉淀重悬于每 5 × 10⁶ 个细胞的 80 μL 冷 MACS 分离缓冲液中。每 5 × 10⁶ 个细胞添加 20 μL 冷非心肌细胞消耗鸡尾酒（人）。轻轻混合细胞悬液并在冰上孵育10分钟。
5. 通过每 5 × 10⁶ 个细胞添加 4 mL 冷 MACS 分离缓冲液来洗涤样品。将样品以~300 ×g 离心5分钟并吸出上清液。
6. 将沉淀重悬于每 5 × 10⁶ 个细胞的 80 μL 冷 MACS 分离缓冲液中。每 5 × 10⁶ 个细胞添加 20 μL 冷抗生素生物素微珠。轻轻混合细胞悬液并在冰上孵育10分钟。
7. 在样品孵育时，将阳性去除柱（装有30 μm预分离过滤器）放在MACS分离器上，并将标记的15 mL收集管放置在柱下方。每 5 × 10^{个 6} 个单元格需要一列。
8. 每根色谱柱均加入 3 mL 冷 MACS 分离缓冲液。将抗体处理的细胞悬液与每 5 × 10⁶ 个细胞 2 mL MACS 分离缓冲液混合，并添加到色谱柱中。
   注意:请勿离心！该步骤的离心对心肌细胞产量有不利影响。
9. 向每根色谱柱中加入 2 mL MACS 分离缓冲液，并收集流出物，直到收集 12 mL 流通型心肌细胞悬浮液。
   注意:切勿让色谱柱完全干燥。
10. 将心肌细胞以~300× g 离心5分钟，弃去上清液，并将心肌细胞悬浮在1mL电镀培养基中。
11. 计数细胞以确定浓度，将体积调整到所需的接种密度，然后将细胞铺板。将纯化的心肌细胞铺在MECM 96孔板上，如上述步骤1.9-1.11（7.5×10⁵ 细胞/孔）中所述。

4. 使用电压敏感染料 （VSD） 和钙敏感荧光团 （CSF） 进行光学映射

1. 通过每毫升 HBSS 添加 1 μL VSD 染料和每 mL HBSS 添加 10 μL 上样佐剂，在 HBSS 中用钙和镁制备适量的 VSD。
   注意:通常，96孔板需要10 mL的VSD溶液。
2. 或者，用补充有5μM脑脊液的钙和镁制备HBSS。吸出心肌细胞维持培养基，并在 96 孔板中每孔用 100 μL 室间隔缺损或脑脊液替换。将细胞在细胞培养箱中孵育30分钟。
3. 除去染料并用测定培养基或HBSS替换。在37°C下平衡，以使用高通量光学映射设备获取基线数据光学映射。
4. 用药物处理细胞进行急性暴露测试，或绘制长期暴露于目标药物的细胞图谱。
5. 对于 96 孔板的心脏毒性测试，请使用四剂化合物，每剂至少六孔。使用从低于到高于有效治疗血浆浓度的剂量，包括临床有效治疗血浆浓度的剂量。
6. 将药物稀释在二甲基亚砜中，将其作为储备溶液储存在-20°C，然后在HBSS中稀释至所需浓度。
7. 在药物应用之前进行基线电生理学测量，如第 5 节所述。一旦应用药物，至少30分钟后进行电生理学记录以进行慢性研究。有关光学映射数据采集和分析过程，请参阅以下部分。

5. 使用基因编码钙指示剂 （GECI） 进行光学映射

1. 如上所述，市售或MACS纯化的hiPSC-CMs板，使用MECM包被的96孔板制备成熟的hiPSC-CM。为了形成融合的单层，每个96孔板的每孔板7.5×10⁴ CM。使用电镀介质。
2. 在电镀培养基中48小时后，切换到心肌细胞维持培养基。
3. 在解冻和重新铺板后的第4天，以感染多重（MOI）= 5向细胞添加用于表达GCaMP6m（AdGCaMP6m）的重组腺病毒。使用CM测定培养基添加病毒。
   注意:在这里，使用GCaMP6m的实验是在商业供应商的iCell² 心肌细胞中进行的。
4. 在第5天，取出adGCaMP6m培养基并用新鲜的RPMI+B27（心肌细胞维持培养基）替换。
5. 在第7天，使用显微镜或光学映射成像仪观察CM，以可视化自发收缩和相应的钙瞬变。
6. 在第7天或更晚，对于药物筛选，将表达GCaMP6m的成熟hiPSC-CM单层的96孔板直接从培养箱转移到光学映射成像仪以进行基线数据采集。
7. 电生理学数据采集后，将CM的板返回组织培养箱，以便在随后的时间点进行测量。
8. 基线记录后，应用药物，每种药物至少使用四剂，每剂至少六口。在数据收集之前平衡细胞上的药物至少30分钟。在采集数据之前和期间将孔温加热至~37°C。
9. 在整个板的基线记录之后，向每个孔中加入异丙肾上腺素（500nM），以获得可靠的药物反应数据。量化异丙肾上腺素对单层搏动率、收缩幅度（钙瞬态振幅）和钙瞬时持续时间（见 图 6）的影响，如第 5 节所述。

6. 光学测绘数据的获取和分析

1. 确保光学映射设备相机、透射仪和板加热器已打开。
2. 打开采集软件并确定文件保存位置。
3. 打开前抽屉，将板放在板加热器上。
4. 通过单击暗框按钮获取暗 框 。
5. 选择 持续时间 （10-30 秒）和 帧速率 采集（例如，100 fps;250 fps 以获得更高的时间分辨率），然后单击 开始采集。
6. 打开分析软件，在"导入/过滤器"选项卡中，选择"浏览单个文件"或"平铺多个"以重建板。
7. 选择 参数模式 （APD 或 CaTD），输入 每像素距离，然后使用 孔向导 确定孔在图像中的位置。单击 "处理保存 "以移动到下一个选项卡。
8. 打开 ROI （感兴趣区域）选项卡，然后选择 手动、 自动或 根本不使用ROI绘制ROI，然后考虑整个井进行分析。选择 ROI 后，单击 "处理/保存 "按钮转到下一步。选中 隐藏井 和 仅显示筛选 框以可视化投资回报率。
9. 打开"分析"选项卡，然后在屏幕的右上角选择每个孔或ROI以确认自动节拍检测的准确性。通过按添加节拍/保存节拍，或选择单个节拍并按键盘上的 Delete 键，在轨迹中添加或删除节拍。
10. 或者，使用平均热图功能为板的选定参数创建 热图 。
11. 单击"分析"选项卡中的"时空图"按钮，可视化每个孔或ROI的数据。确保节拍检测准确后，继续 出口 选项卡并选择文件格式。按导出并为要导出的数据创建一个文件夹。继续打开数据文件并运行所选的统计分析例程。
    注意:首选 .xlxs 文件，因为所有参数都导出到单个文件中;其他格式（.csv 或 .tsv）为每个参数生成一个文件。

结果

以相衬和免疫荧光共聚焦成像为特征的hiPSC-CM成熟
使用MECM包被的96孔板对市售hiPSC-CMs进行ECM介导的成熟时间表如图 1A所示。这些数据是使用市售的心肌细胞收集的，这些心肌细胞作为冷冻保存的细胞瓶到达实验室。每个小瓶含有>5×10⁶ 活心肌细胞。细胞纯度为~98%，并经过严格的质量控制测试（每个小瓶均提供分析证书）。大量的CM能够使用同一批次的?...

讨论

有几种不同的方法可以使用hiPSC-CMs进行 体外 心脏毒性筛查。最近一篇关于使用 hiPSC-CMs 的"最佳实践"论文介绍了各种 体外 测定、其主要读数，以及重要的是，每种测定的粒度以量化人类心脏电生理功能²⁰。除了使用穿膜电极外，VSDs还提供了人类心脏电生理功能的最直接测量。 VSD检测读数能够直接可视化和量化关键电生理参数，包括动作电位持续时间、动作电位传?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin EDTA	Gibco	25200-056
0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L)	Millipore Sigma	A3294
2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)	Millipore Sigma	H4034
AdGCaMP6m	Vector biolabs	1909
Albumin human	Sigma	A9731-1G
alpha actinin antibody	ThermoFisher	MA1-22863
B27	Gibco	17504-044
Blebbistatin	Sigma	B0560
CalBryte 520AM	AAT Bioquest	20650
CELLvo MatrixPlus 96wp	StemBiosys	N/A	https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus
CHIR99021	LC Laboratories	c-6556
Clear Assay medium (fluorobrite)	ThermoFisher	A1896701	For adenovirus transduction
DAPI	ThermoFisher	62248
DMEM:F12	Gibco	11330-032
FBS (Fetal Bovine Serum)	Sigma	F4135-500ML
FluoVolt	ThermoFisher	F10488
HBSS	Gibco	14025-092
iCell CM maintenance media	FUJIFILM/Cellular Dynamics	M1003
iCell2 CMs	FUJIFILM	1434
Incucyte Zoom	Sartorius
iPS DF19-9-11T.H	WiCell
Isoproterenol	MilliporeSigma	CAS-51-30-9
IWP4	Tocris	5214
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate	Sigma	A8960-5g
L-glutamine	Gibco	A2916801
LS columns	Miltenyii Biotec	130-042-401
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)	Miltenyii Biotec	130-091-221
Matrigel	Corning	354234
MitoTracker Red	ThermoFisher	M7512
Nautilus HTS Optical Mapping	CuriBio		https://www.curibio.com/products-overview
Nikon A1R Confocal Microscope	Nikon
nonessential amino acids	Gibco	11140-050
pre-separation filter	Miltenyii Biotec	130-041-407
PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human	Miltenyii Biotec	130-110-188
Pulse	CuriBio		https://www.curibio.com/products-overview
Quadro MACS separator (Magnet)	Miltenyii Biotec	130-091-051
Retinoic acid	Sigma	R2625
RPMI 1640	Gibco	11875-093
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)	Gibco	22400-089
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyii Biotec	130-107-086
TnI antibody (pan TnI)	Millipore Sigma	MAB1691
Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution)	Gibco	15040-066
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
β-mercaptoethanol	Gibco	21985023