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要約

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、前臨床心毒性スクリーニングに動物を使用する代替手段を提供します。前臨床毒性スクリーニングにおけるhiPSC-CMの広範な採用に対する制限は、細胞の未熟な胎児様表現型です。ここでは、hiPSC-CMを堅牢かつ迅速に成熟させるためのプロトコルを紹介します。

要約

ヒト誘導幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、前臨床心毒性試験のために動物および動物細胞への依存を置き換え、軽減するために使用されます。2次元単層フォーマットでは、hiPSC-CMは、最適な細胞外マトリックス(ECM)上で培養すると、成人のヒト心筋細胞の構造と機能を再現します。ヒト周産期幹細胞由来ECM(成熟誘導細胞外マトリックス-MECM)は、プレーティング後7日でhiPSC-CMの構造、機能、代謝状態を成熟させます。

成熟したhiPSC-CM単分子膜は、臨床的に関連する薬物療法にも期待どおりに反応し、不整脈や心毒性を引き起こすリスクが知られています。hiPSC-CM単分子膜の成熟は、これまで、これらの貴重な細胞を規制科学や安全性スクリーニングに広く採用する上での障害となっていました。本稿では、hiPSC-CMの電気生理学的および収縮機能のプレーティング、成熟、ハイスループットの機能的表現型分析のための検証済みの方法を紹介します。これらの方法は、市販の精製心筋細胞だけでなく、高効率のチャンバー特異的分化プロトコルを使用して社内で生成された幹細胞由来の心筋細胞にも適用されます。

ハイスループットの電気生理学的機能は、電位感受性色素(VSD、発光:488 nm)、カルシウム感受性蛍光色素(CSF)、または遺伝子にコードされたカルシウムセンサー(GCaMP6)のいずれかを使用して測定されます。各機能パラメータの光学記録にはハイスループットの光学マッピング装置を使用し、電気生理学的データ解析にはカスタム専用ソフトウェアを使用します。MECMプロトコルは、陽性変力剤(イソプレナリン)およびヒトエーテルゴーゴー関連遺伝子(hERG)チャネル特異的遮断薬を使用した投薬スクリーニングに適用されます。これらのリソースにより、他の研究者は、ハイスループットの前臨床心毒性スクリーニング、心臓投薬効果試験、および心血管研究のために成熟したhiPSC-CMをうまく利用することができます。

概要

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は国際規模で検証されており、in vitro心毒性スクリーニングに利用できます1。高純度のhiPSC-CMは、事実上無制限の数で生成し、凍結保存し、解凍することができます。再メッキすると、彼らはまた蘇生し、人間の心臓を彷彿とさせるリズムで収縮し始めます2,3。驚くべきことに、個々のhiPSC-CMは互いに結合し、単一の組織として拍動する機能的合胞体を形成します。現在、hiPS細胞は日常的に患者の血液サンプルに由来するため、in vitro hiPSC-CM心毒性スクリーニングアッセイを使用して、あらゆる人を表すことができます4,5。これにより、「皿の中の臨床試験」を実施する機会が生まれ、多様な集団からの重要な代表がいます6。

既存の動物および動物細胞の心毒性スクリーニングアプローチに対する重要な利点の1つは、hiPSC-CMが完全なヒトゲノムを利用し、ヒト心臓と遺伝的に類似したin vitroシステムを提供することです。これは、薬理ゲノミクスや個別化医療にとって特に魅力的であり、薬物療法やその他の治療法の開発にhiPSC-CMを使用することで、より正確で正確かつ安全な投薬処方が可能になると予測されています。実際、2次元(2D)hiPSC-CM単層アッセイは、不整脈を引き起こすリスクが知られている臨床的に使用される薬物のパネルを使用して、薬物の心毒性を予測することが証明されています1、7、8、9。hiPSC-CMの大きな可能性と、医薬品開発を合理化し、より安価にすることを約束しているにもかかわらず、これらの新しいアッセイを使用することには消極的でした10、11、12。

これまで、hiPSC-CMスクリーニングアッセイの広範な採用と受け入れの大きな制限の1つは、未熟な胎児のような外観とその機能でした。hiPSC-CM成熟の重要な問題は、科学文献アドナウセウム13,14,15,16でレビューされ、議論されています。同様に、2D単層での細胞外マトリックス(ECM)操作や3D操作心臓組織(EHT)の開発など、hiPSC-CMの成熟を促進するために多くのアプローチが採用されてきました17,18。現時点では、3D EHTの使用は、2D単層ベースのアプローチと比較して優れた成熟度を提供すると広く信じられています。ただし、2D単分子膜は、3D EHTと比較して、セル利用の効率が高く、めっきの成功率が向上します。3D EHTはより多くの細胞を利用し、多くの場合、結果を混乱させる可能性のある他の細胞タイプを含める必要があります。そこで本稿では、電気的・機械的結合細胞の2次元単層として培養したhiPSC-CMを簡便な方法で成熟させることに焦点をあてます。

高度なhiPSC-CM成熟は、ECMを使用して2D単層で達成できます。hiPSC-CMの2D単分子膜は、Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫細胞(マウスECM)によって分泌される基底膜マトリックスでコーティングされた、柔らかく柔軟なポリジメチルシロキサンカバーガラスを使用して成熟させることができます。2016年には、このソフトECM条件で培養したhiPSC-CMが機能的に成熟し、成人の心臓値(~50 cm/s)に近い活動電位伝導速度を示すことが報告されました18。さらに、これらの成熟したhiPSC-CMは、過分極休止膜電位やKir2.1の発現など、成人の心臓を連想させる他の多くの電気生理学的特性を示しました。最近では、2D hiPSC-CMの構造的成熟を促進するヒト周産期幹細胞由来のECMコーティングが同定されたという報告があります19。ここでは、ハイスループット電気生理学的スクリーニングで使用するために、構造的に成熟した2D hiPSC-CM単分子膜に使いやすい方法を紹介します。さらに、電位感受性色素(VSD)とカルシウム感受性プローブおよびタンパク質を使用して、2D hiPSC-CM単層電気生理学的機能の自動取得と分析のための光学マッピング装置の検証を提供します。

プロトコル

このプロトコルにおけるhiPScの使用は、ミシガン大学HPSCRO委員会(ヒト多能性幹細胞監視委員会)によって承認された。材料と機器のリストについては、 材料表 を参照してください。メディアとその組成については 、表 1 を参照してください。

1. 市販の凍結保存済みhiPSC-CMを成熟誘導細胞外マトリックス(MECM)上で解凍・めっき

  1. すべての試薬を室温に温め、心筋細胞プレーティングの前に、カルシウムとマグネシウムを含むハンクの平衡塩溶液(HBSS)またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でMECMプレートを1時間再水和します(96ウェルプレートのウェルあたり200 μLのバッファー)。
  2. 心筋細胞プレーティングの前に、カルシウムとマグネシウムを含むHBSSまたはPBSでMECMプレートを2回洗浄し(96ウェルプレートのウェルあたり200 μLのバッファー)、ウェルを水和状態に保ちます。
  3. 37°Cの水浴を用意します。
  4. 心筋細胞チューブを液体窒素タンクから取り外し、チューブをドライアイスに移し、チューブキャップを少し開いて圧力を解放します。
    注:チューブ内の圧力を解放することは 非常に重要です !チューブ内に圧力がかかりすぎると、爆発する可能性があります。
  5. チューブキャップを再シールし、水浴に入れて4分間解凍します。
    注意: 部分的な解凍による細胞の損傷を避けるために、完全に解凍してください。
  6. 細胞が解凍したら、開封前にチューブに70%エタノールをスプレーします。細胞を1 mLピペットで15 mLコニカルチューブに移します。8mLのメッキ培地をゆっくりと滴下し、1mLが添加されるたびにチューブを攪拌し、細胞が浸透圧の変化に順応できるようにした。
    1. 1 mLのガラスピペットを使用して、1 mLのメッキ媒体でクライオバイアルを洗浄します。次に、洗浄液を15 mLのコニカルチューブにゆっくりと滴下します。
  7. チューブを~300 × g で5分間遠心分離します。上清を吸引し、ペレットを1 mLのメッキ媒体に再懸濁します。アリコートを除去し、血球計算盤で生細胞計数を行います。追加のめっき培地を追加して、7.5 × 105 cells/mLを取得します。
    注:96ウェルを調製するには、約10 mLの細胞懸濁液が必要です。
  8. マルチチャンネルピペットを使用して、MECMコーティングされた96ウェルプレートのウェルあたり100 μLの細胞懸濁液を分注します。
    注:プレーティング中は、細胞の沈殿を避け、すべてのウェルで均一な細胞密度を得るようにしてください。
  9. 細胞を37°C、5%CO2 で2日間インキュベートしてから、培地を維持培地(200 μL/ウェル)に変更します。解凍後5日目にメンテナンス培地を交換してください。前述のように、7日目以降にEPアッセイを実行します8、9。細胞培養の延長を選択する場合は、一日おきに培地を交換してください。

2. hiPS細胞心臓指向性分化とhiPSC-CM精製

  1. 市販のエチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液1x、カルシウムおよびマグネシウムを含まないHBSS(HBSS--)、およびエンゲルブレス-ホルム-スウォームマウス肉腫細胞(マウスECM)によって分泌される可溶化基底膜マトリックスでコーティングされた6ウェルプレートを室温に温めます。
  2. 分化したコロニーを位相差顕微鏡と吸引/アブレートでマークします。各ウェルを1 mLのHBSSで洗浄します--.>10の分化スポットを含むウェルで2回の洗浄を行います。
  3. HBSSを吸引し、各ウェルに1 mLのEDTA溶液を加えます。プレートを37°Cで最大5分間インキュベートします。 3分後にプレートを確認し、半透明の白い目に見えるコロニーを探します。
  4. EDTA溶液を吸引し、1 mLを1つのウェルに加えます。10 mLのガラスピペットを使用してすべての幹細胞をウェルから剥離し、細胞懸濁液を回収チューブに移し、懸濁液を上下に繰り返しピペッティングして、2 mLのhiPSC培地で細胞を取り除きます。その後のウェルで吸引と脱落を繰り返します。
    注意: ガラスピペットの先端でコロニーを持ち上げるために強く取り除きます。
  5. 幹細胞をカウントし、容量を調整して8.0 × 105 細胞/ウェルをプレートします。幹細胞が90%コンフルエントに達するまで、hiPSC培地(2 mL /ウェル)で細胞を培養します(この時間はこれからD0と呼びます)。
  6. 4 μMのCHIR99021を添加した2 mLの基礎分化培地を調製します。
  7. D0上で、幹細胞の6ウェルプレートの各ウェルを1ウェル当たり1mLのHBSSで洗浄する。HBSSを4 μMのCHIR99021を添加した基礎分化培地と交換します。
  8. D1 では、何もしません。
  9. D2上に、4μMのIWP4を添加した基礎分化培地を調製する。
  10. 培地をウェルあたり2 mLのIWP4添加基礎分化培地と交換します。
  11. D3では、心室特異的分化のために何もしません。心房特異的分化のために、培地を吸引し、ウェルあたり4 μMのIWP4および1 μMのレチノイン酸(RA)溶液を補充した2 mLの基礎培地を追加します。
  12. D4で、培地を吸引し、心室分化のためにウェルあたり2 mLの基礎培地を追加します。心房分化の場合は、培地を吸引し、ウェルあたり1 μM RA溶液を補充した2 mLの基礎培地を追加します。
  13. D5 では、何もしません。
  14. D6で、培地を吸引し、ウェルあたり2 mLの基礎培地を追加します(心房分化と心室分化の両方)。
  15. D7 では、何もしません。
  16. D8に培地を吸引し、心筋細胞維持培地2mLを加える。細胞が分離するまで一日おきに培地を交換するか、慢性薬物曝露計画に従ってください。

3. MACS(磁気活性化細胞ソーティング )による hiPSC-CM精製

  1. 細胞培養培地を吸引し、各ウェルを1 mLのHBSSで洗浄します--.1 mLの0.25%トリプシン/EDTAを添加し、37°C、5%CO2 で10分間インキュベートすることにより、細胞を解離します。各ウェルの細胞を2 mLのプレーティング培地で再懸濁および単離し、トリプシン/EDTAを不活性化します。
  2. 6つのウェルから細胞を70 μmのストレーナーで50 mLのコニカルチューブに集めます。次に、3mLのメッキ媒体でストレーナーを洗浄します。セルを数えます。
  3. 懸濁液を~300 × g で5分間遠心分離します。上清を吸引し、20 mLの氷冷MACS分離バッファーで細胞を洗浄します。その後、再び~300 × g で5分間遠心分離します。
  4. ペレットを5細胞あたり80 μLの低温MACS分離バッファーに再懸濁×10 6 細胞。5細胞×106 細胞あたり20 μLの冷たい非心筋細胞枯渇カクテル(ヒト)を追加します。細胞懸濁液を穏やかに混合し、氷上で10分間インキュベートします。
  5. 5 ×10 6 細胞あたり4 mLの冷MACS分離バッファーを加えてサンプルを洗浄します。サンプルを~300 × g で5分間遠心分離し、上清を吸引します。
  6. ペレットを5細胞×10細胞あたり80 μLの低温MACS分離バッファーに再懸濁します。5細胞×106細胞あたり20 μLの冷たい抗ビオチンマイクロビーズを追加します。細胞懸濁液を穏やかに混合し、氷上で10分間インキュベートします。
  7. サンプルのインキュベーション中に、ポジティブデプレッションカラム(30 μmの予備分離フィルターを取り付けた)をMACSセパレーターに置き、ラベルの付いた15 mL収集チューブをカラムの下に置きます。5 ×10 6 セルごとに 1 つの列が必要です。
  8. 各カラムを3 mLの冷MACS分離バッファーでプライミングします。抗体処理した細胞懸濁液を、 5 × 106 細胞あたり2 mLのMACS分離バッファーと混合し、カラムに加える。
    注:遠心分離しないでください。この段階での遠心分離は、心筋細胞の収量に有害な影響を及ぼします。
  9. 各カラムに2 mLのMACS分離バッファーを加え、12 mLのフロースルー心筋細胞懸濁液が収集されるまでフロースルーを収集します。
    注意: カラムを完全に乾燥させないでください。
  10. 心筋細胞を~300 × g で5分間遠心分離し、上清を捨てて、心筋細胞を1 mLのプレーティング培地に懸濁します。
  11. 細胞を数えて濃度を決定し、容量を希望の播種密度に調整し、細胞をプレートします。上記のステップ1.9〜1.11(7.5×105 細胞/ウェル)で説明したように、精製した心筋細胞をMECM 96ウェルプレートにプレートします。

4. 電位感受性色素(VSD)およびカルシウム感受性蛍光色素(CSF)を用いた光学マッピング

  1. HBSS1 mLあたり1 μLのVSD色素とHBSS1 mLあたり10 μLのローディングアジュバントを添加して、カルシウムとマグネシウムを含むHBSS中の適量のVSDを調製します。
    注:通常、96ウェルプレートには10 mLのVSD溶液が必要です。
  2. あるいは、5 μMのCSFを添加したカルシウムとマグネシウムでHBSSを調製します。心筋細胞維持培地を吸引し、96ウェルプレートのウェルあたり100 μLのVSDまたはCSFと交換します。細胞培養インキュベーター内で細胞を30分間インキュベートします。
  3. 色素を除去し、アッセイ培地またはHBSSと交換します。37°Cで平衡化して、高スループットの光学マッピングデバイスを使用してベースラインデータ光学マッピングを取得します。
  4. 急性暴露試験のために細胞を薬物で処理するか、目的の薬物に慢性的に曝露された細胞をマッピングします。
  5. 96ウェルプレートでの心毒性試験には、1用量あたり少なくとも6ウェルの化合物を4回投与します。臨床有効治療血漿濃度の用量を含む、有効治療血漿濃度の下から上の範囲の用量を使用する。
  6. 薬物をジメチルスルホキシドで希釈し、ストック溶液として-20°Cで保存してから、HBSSで希望の濃度に希釈します。
  7. セクション5で説明されているように、薬物適用の前にベースラインの電気生理学測定を行います。.薬が適用されたら、慢性研究のために少なくとも30分後に電気生理学の記録を行います。光学マッピング・データの取得および解析手順については、以下のセクションを参照してください。

5. 遺伝子カルシウムインジケーター(GECI)を用いた光学マッピング

  1. 市販のプレートまたはMACS精製hiPSC-CMsは、上述のように、MECMコーティングされた96ウェルプレートを用いて、成熟hiPSC-CMを作製した。コンフルエント単層を形成するには、各96ウェルプレートのウェルあたり7.5×104 CMのプレート。メッキ媒体を使用してください。
  2. プレーティング培地で48時間後、心筋細胞維持培地に切り替えます。
  3. 融解および再めっき後4日目に、GCaMP6m(AdGCaMP6m)を発現するための組換えアデノウイルスを感染多重度(MOI)= 5で細胞に加える。CMアッセイ培地を使用してウイルスを追加します。
    注:ここでは、GCaMP6mを使用した実験を、市販ベンダーのiCell2 心筋細胞で実施しました。
  4. 5日目に、adGCaMP6m培地を取り外し、新しいRPMI+B27(心筋細胞維持培地)と交換します。
  5. 7日目に、顕微鏡または光学マッピングイメージャーを使用してCMを観察し、自発収縮と対応するカルシウム過渡現象を視覚化します。
  6. 7日目以降、投薬スクリーニングのために、GCaMP6mを発現する成熟hiPSC-CM単層の96ウェルプレートをインキュベーターから光学マッピングイメージャーに直接移し、ベースラインデータを取得します。
  7. 電気生理学データの取得に続いて、CMのプレートを組織培養インキュベーターに戻し、その後の時点で測定します。
  8. ベースライン記録に続いて、各薬の少なくとも4回の投与と、投与ごとに少なくとも6つのウェルを使用して、薬を適用します。.データ収集の前に、細胞上の薬を少なくとも30分間平衡化します。データ取得前および取得中にウェル温度を~37°Cに温めます。
  9. プレート全体のベースライン記録に続いて、すべてのウェルにイソプロテレノール(500 nM)を追加して、堅牢な薬物反応データを有効にします。セクション5で説明されているように、単層の拍動速度、収縮振幅(カルシウム過渡振幅)、およびカルシウム過渡持続時間に対するイソプロテレノールの効果を定量化します( 図6を参照)。

6. 光学マッピングデータの取得と解析

  1. 光学マッピングデバイスのカメラ、トランスイルミネーター、プレートヒーターがオンになっていることを確認します。
  2. 取得ソフトウェアを開き、ファイルの保存場所を決定します。
  3. 前面の引き出しを開き、プレートヒーターにプレートを配置します。
  4. ダークフレームボタンをクリックしてダーク フレーム を取得します。
  5. 「 継続 時間」(10〜30秒)と 「フレームレート 」(例:100 fps、時間解像度を高くする場合は250 fps)を選択し、「 取り込みを開始」をクリックします。
  6. 解析ソフトウェアを開き、[ インポート/フィルタ] タブで、[単一ファイル を参照 ]または [複数タイル] を選択してプレートを再構築します。
  7. パラメータモード(APDまたはCaTD)を選択し、ピクセルあたりの距離を入力し、ウェルウィザードを使用して画像内のウェルの位置を決定します。[プロセス保存] をクリックして、次のタブに移動します。
  8. ROI(関心領域)タブを開き、ROIを手動で描画するか、自動的に描画するか、ROIをまったく使用しないかを選択して、分析のために全体を考慮します。ROIを選択したら、[プロセス/保存]ボタンをクリックして次のステップに進みます。[ウェルを非表示にする] ボックスと [フィルターされたみを表示] チェックボックスをオンにして、ROI を視覚化します。
  9. [分析]タブを開き、画面の右上で各ウェルまたはROIを選択して、自動ビート検出の精度を確認します。トレースにビートを追加または削除するには、「ビートを追加/ビートを保存」を押すか、個々のビートを選択してキーボードのDeleteキーを押します。
  10. 必要に応じて、平均ヒートマップ機能を使用して、プレートの選択したパラメータの ヒートマップ を作成します。
  11. 分析タブの時空間プロットボタンをクリックして、各井戸のデータまたはROIを視覚化します。ビート検出が正確であることを確認したら、[エクスポート]タブに進み、[ファイル形式]を選択します。[エクスポート] を押して、データのエクスポート先のフォルダーを作成します。データ・ファイルのオープンに進み、選択した統計分析ルーチンを実行します。
    注: .xlxs ファイルは、すべてのパラメーターが 1 つのファイルにエクスポートされるため、優先されます。その他の形式 (.csv または .tsv) では、パラメーターごとに 1 つのファイルが生成されます。

結果

位相差と免疫蛍光共焦点イメージングを特徴とするhiPSC-CM成熟
MECMコーティングされた96ウェルプレートを使用した市販のhiPSC-CMのECMを介した成熟のタイムラインを 図1Aに示します。これらのデータは、細胞の凍結保存されたバイアルとして実験室に到着する市販の心筋細胞を使用して収集されます。各バイアルには、>5×106 の生存心筋細胞が含ま?...

ディスカッション

hiPSC-CMを用いた in vitro 心毒性スクリーニングには、いくつかの異なるアプローチがあります。hiPSC-CMの使用に関する最近の「ベストプラクティス」論文では、さまざまな in vitro アッセイ、それらの主要な読み出し、そして重要なことに、ヒトの心臓電気生理学的機能を定量化するための各アッセイの粒度が提示されました20。メンブレンピアス電極の使用に加?...

開示事項

TJHはStemBioSys, Inc.のコンサルタント兼科学アドバイザーであり、TBはStemBioSys, Inc.の従業員であり、AMRとJCはStemBioSys, Inc.の元コンサルタントであり、TJH、TB、AMR、およびJCはStemBioSys, Inc.の株主です。

謝辞

この作業は、NIH助成金HL148068-04およびR44ES027703-02(TJH)によってサポートされています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin EDTAGibco25200-056
0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L)Millipore SigmaA3294
2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)Millipore SigmaH4034
AdGCaMP6mVector biolabs1909
Albumin humanSigmaA9731-1G
alpha actinin antibodyThermoFisherMA1-22863
B27Gibco17504-044
BlebbistatinSigmaB0560
CalBryte 520AMAAT Bioquest20650
CELLvo MatrixPlus 96wpStemBiosysN/Ahttps://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus
CHIR99021LC Laboratoriesc-6556
Clear Assay medium (fluorobrite)ThermoFisherA1896701For adenovirus transduction
DAPIThermoFisher62248
DMEM:F12Gibco11330-032
FBS (Fetal Bovine Serum)SigmaF4135-500ML
FluoVoltThermoFisherF10488
HBSSGibco14025-092
iCell CM maintenance mediaFUJIFILM/Cellular DynamicsM1003
iCell2 CMsFUJIFILM1434
Incucyte Zoom Sartorius
iPS DF19-9-11T.HWiCell
IsoproterenolMilliporeSigmaCAS-51-30-9
IWP4Tocris5214
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrateSigmaA8960-5g
L-glutamineGibcoA2916801
LS columnsMiltenyii Biotec130-042-401
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)Miltenyii Biotec130-091-221
MatrigelCorning354234
MitoTracker RedThermoFisherM7512
Nautilus HTS Optical Mapping CuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Nikon A1R Confocal MicroscopeNikon
nonessential amino acidsGibco11140-050
pre-separation filterMiltenyii Biotec130-041-407
PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, humanMiltenyii Biotec130-110-188
PulseCuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Quadro MACS separator (Magnet)Miltenyii Biotec130-091-051
Retinoic acidSigmaR2625
RPMI 1640 Gibco11875-093
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)Gibco22400-089
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyii Biotec130-107-086
TnI antibody (pan TnI)Millipore SigmaMAB1691 
Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution)Gibco15040-066
Y-27632 dihydrochlorideTocris1254
β-mercaptoethanolGibco21985023

参考文献

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