JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), klinik öncesi kardiyotoksisite taraması için hayvanların kullanılmasına bir alternatif sunar. Preklinik toksisite taramasında hiPSC-CM'lerin yaygın olarak benimsenmesinin bir sınırlaması, hücrelerin olgunlaşmamış, fetal benzeri fenotipidir. Burada hiPSC-CM'lerin sağlam ve hızlı olgunlaşması için protokoller sunulmaktadır.

Özet

İnsan kaynaklı kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), klinik öncesi kardiyotoksisite testi için hayvanlara ve hayvan hücrelerine olan bağımlılığı değiştirmek ve azaltmak için kullanılır. İki boyutlu tek katmanlı formatlarda, hiPSC-CM'ler, optimal bir hücre dışı matris (ECM) üzerinde kültürlendiğinde yetişkin insan kalp kası hücrelerinin yapısını ve işlevini özetler. İnsan perinatal kök hücre kaynaklı ECM (olgunlaşmaya neden olan hücre dışı matriks-MECM), kaplamadan sonraki 7 gün içinde hiPSC-CM yapısını, işlevini ve metabolik durumunu olgunlaştırır.

Olgun hiPSC-CM monokatmanları da klinik olarak ilgili ilaçlara beklendiği gibi yanıt verir ve aritmilere ve kardiyotoksisiteye neden olma riski vardır. HiPSC-CM monokatmanlarının olgunlaşması, şimdiye kadar düzenleyici bilim ve güvenlik taraması için bu değerli hücrelerin yaygın olarak benimsenmesinin önünde bir engeldi. Bu makalede, hiPSC-CM elektrofizyolojik ve kontraktil fonksiyonun kaplanması, olgunlaşması ve yüksek verimli, fonksiyonel fenotiplemesi için doğrulanmış yöntemler sunulmaktadır. Bu yöntemler, ticari olarak temin edilebilen saflaştırılmış kardiyomiyositlerin yanı sıra, yüksek verimli, odaya özgü farklılaşma protokolleri kullanılarak şirket içinde üretilen kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler için de geçerlidir.

Yüksek verimli elektrofizyolojik fonksiyon, voltaja duyarlı boyalar (VSD'ler; emisyon: 488 nm), kalsiyuma duyarlı floroforlar (CSF'ler) veya genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri (GCaMP6) kullanılarak ölçülür. Her fonksiyonel parametrenin optik kayıtları için yüksek verimli bir optik haritalama cihazı kullanılır ve elektrofizyolojik veri analizi için özel özel bir yazılım kullanılır. MECM protokolleri, pozitif inotrop (izoprenalin) ve insan Ether-a-go-go-ilişkili gen (hERG) kanalına özgü blokerler kullanılarak ilaç taraması için uygulanır. Bu kaynaklar, diğer araştırmacıların yüksek verimli, klinik öncesi kardiyotoksisite taraması, kardiyak ilaç etkinlik testi ve kardiyovasküler araştırmalar için olgun hiPSC-CM'leri başarıyla kullanmalarını sağlayacaktır.

Giriş

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler) uluslararası ölçekte doğrulanmıştır ve in vitro kardiyotoksisite taraması için mevcuttur1. Son derece saf hiPSC-CM'ler neredeyse sınırsız sayıda üretilebilir, kriyoprezerve edilebilir ve çözülebilir. Yeniden kaplama üzerine, aynı zamanda yeniden canlanırlar ve insan kalbini anımsatan bir ritimle büzülmeye başlarlar 2,3. Dikkat çekici bir şekilde, bireysel hiPSC-CM'ler birbirleriyle çiftleşir ve tek bir doku olarak atan fonksiyonel sinsiti oluşturur. Günümüzde, hiPSC'ler rutin olarak hasta kan örneklerinden türetilmektedir, bu nedenle in vitro hiPSC-CM kardiyotoksisite tarama testleri 4,5 kullanılarak herhangi bir kişi temsil edilebilir. Bu, çeşitli popülasyonlardan önemli temsillerle "Bir Tabakta Klinik Çalışmalar" gerçekleştirme fırsatı yaratır6.

Mevcut hayvan ve hayvan hücresi kardiyotoksisitesi tarama yaklaşımlarına göre kritik bir avantaj, hiPSC-CM'lerin tüm insan genomunu kullanması ve insan kalbine genetik benzerliklere sahip bir in vitro sistem sunmasıdır. Bu özellikle farmakogenomik ve kişiselleştirilmiş tıp için caziptir - ilaç ve diğer tedavi geliştirme için hiPSC-CM'lerin kullanımının daha doğru, kesin ve güvenli ilaç reçeteleri sağlayacağı tahmin edilmektedir. Gerçekten de, iki boyutlu (2D) hiPSC-CM tek katmanlı testlerin, aritmilere neden olduğu bilinen bir klinik olarak kullanılan ilaç paneli kullanılarak ilaç kardiyotoksisitesinin öngörücü olduğu kanıtlanmıştır 1,7,8,9. HiPSC-CM'lerin geniş potansiyeline ve ilaç geliştirmeyi kolaylaştırma ve daha ucuz hale getirme vaadine rağmen, bu yeni tahlilleri kullanma konusunda isteksizlik olmuştur10,11,12.

Şimdiye kadar, hiPSC-CM tarama testlerinin yaygın olarak benimsenmesi ve kabul edilmesinin önemli bir sınırlaması, olgunlaşmamış, fetal benzeri görünümlerinin yanı sıra işlevleridir. HiPSC-CM olgunlaşmasının kritik konusu ad nauseum13,14,15,16 bilimsel literatüründe gözden geçirilmiş ve tartışılmıştır. Benzer şekilde, 2D monokatmanlarda hücre dışı matriks (ECM) manipülasyonları ve 3D mühendislik kalp dokularının (EHT'ler) geliştirilmesi de dahil olmak üzere hiPSC-CM olgunlaşmasını teşvik etmek için birçok yaklaşım kullanılmıştır17,18. Şu anda, 3D EHT'lerin kullanımının 2D tek katmanlı yaklaşımlara göre üstün olgunlaşma sağlayacağına dair yaygın bir inanç var. Bununla birlikte, 2D monolayer'lar, 3D EHT'lere kıyasla daha yüksek bir hücre kullanımı verimliliği ve kaplamada daha fazla başarı sağlar; 3D EHT'ler daha fazla sayıda hücre kullanır ve genellikle sonuçları karıştırabilecek diğer hücre tiplerinin dahil edilmesini gerektirir. Bu nedenle, bu makalede, elektriksel ve mekanik olarak bağlanmış hücrelerin 2D tek katmanları olarak kültürlenmiş hiPSC-CM'leri olgunlaştırmak için basit bir yöntem kullanmaya odaklanılmıştır.

Gelişmiş hiPSC-CM olgunlaşması, bir ECM kullanılarak 2D tek katmanlarda elde edilebilir. HiPSC-CM'lerin 2D monokatmanları, bir Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkomu hücresi (fare ECM) tarafından salgılanan bazal membran matrisi ile kaplanmış yumuşak, esnek bir polidimetilsiloksan örtü kayması kullanılarak olgunlaştırılabilir. 2016 yılında raporlar, bu yumuşak ECM koşulunda kültürlenen hiPSC-CM'lerin işlevsel olarak olgunlaştığını ve yetişkin kalp değerlerine (~ 50 cm / s) yakın aksiyon potansiyeli iletim hızları gösterdiğini göstermiştir18. Ayrıca, bu olgun hiPSC-CM'ler, hiperpolarize dinlenme zarı potansiyeli ve Kir2.1'in ekspresyonu da dahil olmak üzere yetişkin kalbini anımsatan birçok elektrofizyolojik özellik göstermiştir. Daha yakın zamanlarda, raporlar, 2D hiPSC-CM'lerin yapısal olgunlaşmasını destekleyen insan perinatal kök hücre kaynaklı bir ECM kaplaması tanımladı19. Burada, yüksek verimli elektrofizyolojik ekranlarda kullanılmak üzere yapısal olarak olgun 2D hiPSC-CM tek katmanlara kullanımı kolay yöntemler sunulmaktadır. Ayrıca, voltaja duyarlı boyalar (VSD'ler) ve kalsiyuma duyarlı problar ve proteinler kullanarak 2D hiPSC-CM tek katmanlı elektrofizyolojik fonksiyonun otomatik olarak elde edilmesi ve analizi için optik bir haritalama cihazının doğrulanmasını sağlıyoruz.

Protokol

Bu protokolde hiPSC kullanımı Michigan Üniversitesi HPSCRO Komitesi (Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee) tarafından onaylanmıştır. Malzeme ve ekipman listesi için Malzeme Tablosu'na bakın. Medya ve kompozisyonları için Tablo 1'e bakınız.

1. Olgunlaşmaya neden olan hücre dışı matris (MECM) üzerinde olgunlaşma için ticari olarak temin edilebilen kriyokorunmuş hiPSC-CM'lerin çözülmesi ve kaplanması

  1. Tüm reaktifleri oda sıcaklığına ısıtın ve MECM plakalarını Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) veya kalsiyum ve magnezyum içeren fosfat tamponlu salin (PBS) ile kardiyomiyosit kaplamadan önce 1 saat boyunca yeniden sulandırın (96 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 200 μL tampon).
  2. MECM plakalarını kardiyomiyosit kaplamadan önce 1 saat boyunca HBSS veya kalsiyum ve magnezyum içeren HBSS veya PBS ile 2 kez yıkayın (96 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 200 μL tampon) ve kuyucukları nemli tutun.
  3. 37 °C su banyosu hazırlayın.
  4. Kardiyomiyosit tüplerini sıvı azot tankından çıkarın, tüpleri kuru buza aktarın ve basıncı serbest bırakmak için tüp kapaklarını hafifçe açın.
    NOT: Tüplerdeki basıncın serbest bırakılması son derece önemlidir! Tüplerin içinde çok fazla basınç oluşursa, patlayabilirler.
  5. Tüp kapaklarını tekrar kapatın ve 4 dakika boyunca çözülmesi için su banyosuna yerleştirin.
    NOT: Kısmi çözülme nedeniyle hücre hasarını önlemek için tamamen çözülmelerine izin verin.
  6. Hücreler çözüldükten sonra, açmadan önce tüplere% 70 etanol püskürtün. Hücreleri 1 mL pipetle 15 mL konik tüplere aktarın. Hücrelerin ozmolaritedeki değişikliklere uyum sağlamasına izin vermek için her 1 mL eklendiğinde tüpü çalkalayarak yavaşça 8 mL kaplama ortamı damlatın.
    1. Kriyoviali, 1 mL cam pipet kullanarak 1 mL kaplama ortamı ile yıkayın. Ardından, yıkamayı yavaşça 15 mL konik tüpe damlatın.
  7. Tüpleri 5 dakika boyunca ~ 300 × g'da santrifüjleyin. Süpernatantı aspire edin ve peletleri 1 mL kaplama ortamında yeniden askıya alın. Bir aliquot çıkarın ve bir hemositometre ile canlı hücre sayımı yapın. 7.5 × 105 hücre/mL elde etmek için ek kaplama ortamı ekleyin.
    NOT: 96 kuyucuğun hazırlanması için yaklaşık 10 mL hücre süspansiyonu gereklidir.
  8. Çok kanallı pipet kullanarak MECM kaplı 96 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 100 μL hücre süspansiyonu dağıtın.
    NOT: Kaplama sırasında hücre çökelmesinden kaçındığınızdan ve tüm kuyucuklarda eşit hücre yoğunluğu elde ettiğinizden emin olun.
  9. Ortamı bakım ortamına (200 μL / kuyu) değiştirmeden önce hücreleri 37 ° C,% 5 CO 2'de2 gün boyunca inkübe edin. Çözme işleminden sonraki 5. günde bakım ortamını değiştirin. EP tahlillerini daha önce 8,9'da açıklandığı gibi 7. günde veya daha sonra gerçekleştirin. Hücre kültürünü genişletmeyi seçerken ortamı her geçen gün değiştirin.

2. hiPSC kardiyak yönelimli farklılaşma ve hiPSC-CM saflaştırma

  1. Ticari olarak temin edilebilen 1x etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi, kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS (HBSS--) ve bir Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkom hücresi (fare ECM) tarafından oda sıcaklığına salgılanan çözünür bazal membran matrisi ile kaplanmış 6 delikli plakalar.
  2. Farklılaşmış kolonileri faz-kontrast mikroskobu ile işaretleyin ve aspirat / ablate edin. Her bir kuyucuğu 1 mL HBSS ile yıkayın--. >10 farklılaşma noktası içeren kuyucuklarda iki yıkama yapın.
  3. HBSS'yi aspire edin - ve her bir kuyucuğa 1 mL EDTA çözeltisi ekleyin. Plakaları 37 ° C'de 5 dakikaya kadar inkübe edin. 3 dakika sonra plakaları kontrol edin ve yarı saydam beyaz, görünür kolonileri arayın.
  4. EDTA çözeltisini aspire edin ve tek bir kuyucuğa 1 mL ekleyin. Tüm kök hücreleri kuyudan ayırmak için 10 mL'lik bir cam pipet kullanarak süspansiyonu tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri 2 mL hiPSC ortamı ile yerinden çıkarın ve hücre süspansiyonunu bir toplama tüpüne aktarın. Aspirasyonu ve yerinden çıkarmayı sonraki kuyucuklarla tekrarlayın.
    NOT: Cam pipetin ucuyla kolonileri kaldırmak için sert bir şekilde yerinden çıkarın.
  5. Kök hücreleri sayın ve ses seviyesini plaka 8.0 × 105 hücre / kuyuya ayarlayın. Kök hücreler %90 birleşime ulaşana kadar hücreleri hiPSC ortamında (2 mL/kuyu) kültürleyin (bu sefer bundan böyle D0 olarak anılacaktır).
  6. 4 μM CHIR99021 ile desteklenmiş 2 mL bazal farklılaşma ortamı hazırlayın.
  7. D0'da, 6 delikli bir kök hücre plakasının her bir kuyucuğunu, kuyu başına 1 mL HBSS ile yıkayın. HBSS'yi 4 μM CHIR99021 ile desteklenmiş bazal farklılaşma ortamı ile değiştirin.
  8. D1'de hiçbir şey yapmayın.
  9. D2'de, 4 μM IWP4 ile desteklenmiş bazal farklılaşma ortamı hazırlayın.
  10. Ortamı, kuyu başına 2 mL IWP4 takviyeli bazal farklılaşma ortamı ile değiştirin.
  11. D3'te, ventriküler spesifik bir farklılaşma için hiçbir şey yapmayın. Atriyal spesifik bir farklılaşma için, ortamı aspire edin ve kuyu başına 4 μM IWP4 ve 1 μM retinoik asit (RA) çözeltisi ile desteklenmiş 2 mL bazal ortam ekleyin.
  12. D4'te, ortamı aspire edin ve ventriküler farklılaşma için kuyucuk başına 2 mL bazal ortam ekleyin. Atriyal bir farklılaşma için, ortamı aspire edin ve kuyucuk başına 1 μM RA çözeltisi ile desteklenmiş 2 mL bazal ortam ekleyin.
  13. D5'te hiçbir şey yapmayın.
  14. D6'da, ortamı aspire edin ve kuyucuk başına 2 mL bazal ortam ekleyin (hem atriyal hem de ventriküler farklılaşma için).
  15. D7'de hiçbir şey yapmayın.
  16. D8'de, ortamı aspire edin ve 2 mL kardiyomiyosit bakım ortamı ekleyin. Hücre ayrılana kadar ortamı her gün değiştirin veya kronik bir ilaca maruz kalma planını izleyin.

3. MACS ile hiPSC-CM saflaştırma (manyetikle aktive edilmiş hücre sıralama)

  1. Hücre kültürü ortamını aspire edin ve her bir kuyucuğu 1 mL HBSS ile yıkayın--. 1 mL% 0.25 tripsin / EDTA ekleyerek ve 10 dakika boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2'de inkübe ederek hücreleri ayırın. Tripsin / EDTA'yı inaktive etmek için her bir kuyucuktaki hücreleri 2 mL kaplama ortamı ile yeniden askıya alın ve tekilleştirin.
  2. Altı kuyucuktan hücreleri 70 μm süzgeçli 50 mL'lik bir konik tüpe toplayın. Ardından, süzgeci 3 mL kaplama ortamı ile yıkayın. Hücreleri sayın.
  3. Süspansiyonu 5 dakika boyunca ~ 300 × g'da santrifüjleyin. Süpernatantı aspire edin ve hücreleri 20 mL buz gibi soğuk MACS ayırma tamponu ile yıkayın. Ardından, 5 dakika boyunca ~ 300 × g'da tekrar santrifüjleyin.
  4. Pelet, 5 × 106 hücre başına 80 μL soğuk MACS ayırma tamponunda tekrar askıya alın. 5 × 106 hücre başına 20 μL soğuk kardiyomiyosit olmayan tükenme kokteyli (insan) ekleyin. Hücre süspansiyonunu yavaşça karıştırın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
  5. 5 × 106 hücre başına 4 mL soğuk MACS ayırma tamponu ekleyerek numuneyi yıkayın. Numuneyi 5 dakika boyunca ~ 300 × g'da santrifüj edin ve süpernatanı aspire edin.
  6. Pelet, 5 × 106 hücre başına 80 μL soğuk MACS ayırma tamponunda tekrar askıya alın. 5 × 106 hücre başına 20 μL soğuk anti-biyotin mikroboncuk ekleyin. Hücre süspansiyonunu yavaşça karıştırın ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.
  7. Numuneler inkübe edilirken, pozitif tükenme sütunlarını (30 μm ön ayırma filtreleriyle donatılmış) MACS ayırıcısına yerleştirin ve etiketli 15 mL toplama tüplerini sütunların altına yerleştirin. Her 5 × 106 hücre için bir sütun gereklidir.
  8. Her sütunu 3 mL soğuk MACS ayırma arabelleği ile astarlayın. Antikorla muamele edilmiş hücre süspansiyonunu 5 × 106 hücre başına 2 mL MACS ayırma tamponu ile karıştırın ve sütuna ekleyin.
    NOT: Santrifüj yapmayın! Bu adımda santrifüjlemenin kardiyomiyosit verimi üzerinde zararlı etkileri vardır.
  9. Her sütuna 2 mL MACS ayırma arabelleği ekleyin ve 12 mL akış kardiyomiyosit süspansiyonu toplanana kadar akışı toplayın.
    NOT: Kolonların tamamen kurumasına asla izin vermeyin.
  10. Kardiyomiyositleri 5 dakika boyunca ~ 300 × g'da santrifüj edin, süpernatanı atın ve kardiyomiyositleri 1 mL kaplama ortamında askıya alın.
  11. Konsantrasyonu belirlemek için hücreleri sayın, hacmi istenen tohumlama yoğunluğuna ayarlayın ve hücreleri plakalayın. Saflaştırılmış kardiyomiyositleri, yukarıda 1.9-1.11 (7.5 × 105 hücre/kuyu) adımlarında açıklandığı gibi, MECM 96 kuyucuklu plakalar üzerine plakalayın.

4. Voltaja duyarlı boyalar (VSD'ler) ve kalsiyuma duyarlı floroforlar (CSF'ler) kullanarak optik haritalama

  1. HBSS'de mL HBSS başına 1 μL VSD boyası ve mL HBSS başına 10 μL yükleme adjuvanı ekleyerek kalsiyum ve magnezyum ile uygun miktarda VSD hazırlayın.
    NOT: Tipik olarak, 96 delikli bir plaka 10 mL VSD çözeltisi gerektirir.
  2. Alternatif olarak, HBSS'yi 5 μM BOS ile desteklenmiş kalsiyum ve magnezyum ile hazırlayın. Kardiyomiyosit bakım ortamını aspire edin ve 96 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 100 μL VSD veya BOS ile değiştirin. Hücreleri hücre kültürü inkübatöründe 30 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Boyaları çıkarın ve tahlil ortamı veya HBSS ile değiştirin. Yüksek verimli optik haritalama cihazı ile temel veri optik haritalamasının elde edilmesi için 37 °C'de dengeleyin.
  4. Hücreleri akut maruz kalma testi için ilaçlarla tedavi edin veya kronik olarak ilgilenilen ilaçlara maruz kalan hücreleri haritalayın.
  5. 96 kuyucuklu plakalarda kardiyotoksisite testi için, doz başına en az altı kuyucuklu bir bileşiğin dört dozunu kullanın. Klinik etkili terapötik plazma konsantrasyonunun bir dozu da dahil olmak üzere, etkili terapötik plazma konsantrasyonunun altından üstüne kadar değişen dozları kullanın.
  6. İlaçları dimetil sülfoksit içinde seyreltin, -20 ° C'de stok çözeltileri olarak saklayın ve daha sonra HBSS'de istenen konsantrasyonlara seyreltin.
  7. İlaç uygulamasından önce, bölüm 5'te açıklandığı gibi, temel elektrofizyoloji ölçümlerini yapın. İlaçlar uygulandıktan sonra, kronik çalışmalar için en az 30 dakika sonra elektrofizyoloji kayıtları yapın. Optik haritalama, veri toplama ve analiz yordamları için aşağıdaki bölümlere bakın.

5. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi (GECI) kullanarak optik haritalama

  1. Yukarıda açıklandığı gibi, olgun hiPSC-CM'ler yapmak için MECM kaplı 96 delikli plakalar kullanarak, ticari olarak temin edilebilen veya MACS saflaştırılmış hiPSC-CM'ler. Akıcı monokatmanlar oluşturmak için, her 96 delikli plakanın kuyucuğu başına 7.5 × 104 CM plaka. Kaplama ortamı kullanın.
  2. Kaplama ortamında 48 saat sonra, kardiyomiyosit bakım ortamına geçin.
  3. Çözülme ve yeniden kaplanmadan sonraki 4. günde, çok sayıda enfeksiyonda (MOI) = 5 hücrelere GCaMP6m (AdGCaMP6m) eksprese etmek için rekombinant adenovirüs ekleyin. CM tahlil ortamını kullanarak virüsü ekleyin.
    NOT: Burada, GCaMP6m kullanan deneyler, ticari bir satıcıdan iCell2 kardiyomiyositlerinde gerçekleştirilmiştir.
  4. 5. günde, adGCaMP6m ortamını çıkarın ve taze RPMI + B27 (kardiyomiyosit bakım ortamı) ile değiştirin.
  5. 7. günde, spontan kasılmaları ve karşılık gelen kalsiyum geçicilerini görselleştirmek için mikroskopi veya optik haritalama görüntüleyici kullanarak CM'leri gözlemleyin.
  6. 7. günde veya daha sonra, ilaç taraması için, GCaMP6m'yi ifade eden olgun hiPSC-CM monokatmanlarının 96 kuyucuklu plakalarını, temel veri toplama için inkübatörden optik haritalama görüntüleyicisine doğrudan aktarın.
  7. Elektrofizyoloji verilerinin toplanmasını takiben, CM'lerin plakalarını, sonraki bir zaman noktasında ölçümler için doku kültürü inkübatörüne geri döndürün.
  8. Temel kayıtları takiben, her ilacın en az dört dozunu ve doz başına en az altı kuyucuğu kullanarak ilaçları uygulayın. Veri toplamadan önce hücrelerdeki ilaçları en az 30 dakika boyunca dengeleyin. Veri elde etmeden önce ve veri toplama sırasında kuyu sıcaklığını ~ 37 ° C'ye ısıtın.
  9. Tüm plakanın temel kayıtlarını takiben, sağlam ilaç yanıt verilerini sağlamak için her kuyucuğa izoproterenol (500 nM) ekleyin. İzoproterenolün tek katmanlı atım hızı, kasılma genliği (kalsiyum geçici genliği) ve kalsiyum geçici süresi (bkz. Şekil 6) üzerindeki etkilerini, bölüm 5'te açıklandığı gibi ölçün.

6. Optik haritalama verilerinin ve analizinin elde edilmesi

  1. Optik haritalama aygıtı kamerasının, aydınlatıcının ve plaka ısıtıcısının açık olduğundan emin olun.
  2. Edinme yazılımını açın ve dosya kaydetme konumunu belirleyin.
  3. Ön çekmeceyi açın ve plakayı plaka ısıtıcısının üzerine yerleştirin.
  4. Koyu Çerçeve düğmesine tıklayarak koyu bir çerçeve elde edin.
  5. Süre (10-30 sn) ve Kare Çekim Hızı'nı (ör. 100 fps; daha yüksek zamansal çözünürlük için 250 fps) seçin ve Almayı Başlat'ı tıklatın.
  6. Analiz yazılımını açın ve İçe Aktar/Filtre Uygula sekmesinde, tek bir dosyaya gözat'ı veya bir plakayı yeniden oluşturmak için Birden Çok Döşeme'yi seçin.
  7. Parametre Modu'nu (APD veya CaTD) seçin, Piksel Başına Uzaklık girin ve kuyucukların görüntüdeki konumunu belirlemek için Kuyu Sihirbazı'nı kullanın. Sonraki sekmeye geçmek için Kaydet'i İşleme'yi tıklatın.
  8. YG'ler (ilgi alanları) sekmesini açın ve YG'leri Manuel, Otomatik veya YG'leri Hiç Kullanma'yı çizmeyi seçin, bu da analiz için tüm kuyuyu dikkate alır. YG'ler seçildikten sonra, bir sonraki adıma geçmek için İşlem/Kaydet düğmesini tıklatın. YG'leri görselleştirmek için Kutuları Gizle ve Yalnızca Filtrelenmiş Olanları Göster kutularını işaretleyin.
  9. Analiz sekmesini açın ve ekranın sağ üst tarafında, Otomatik Vuruş Algılamanın Doğruluğunu onaylamak için her bir Kuyu veya YG'yi seçin. Add Beat/Save Beats tuşuna basarak ya da bir Individual Beat seçip klavyede Delete tuşuna basarak izlere Beats ekleyin veya İzlerden Beat'leri kaldırın.
  10. İsteğe bağlı olarak, plaka için seçilen parametrelerin ısı haritalarını oluşturmak için Ortalama Isı Haritaları özelliğini kullanın.
  11. Her bir kuyu veya YG için verileri görselleştirmek üzere Analiz sekmesindeki Zaman-Uzay Grafiği düğmesine tıklayın. Vuruş algılamanın doğru olduğundan emin olduktan sonra, Dışa Aktar sekmesine ilerleyin ve Dosya Biçimi'ni seçin. Dışa Aktar'a basın ve verilerin verileceği klasör oluşturun. Veri dosyalarını açmaya devam edin ve seçilen istatistiksel analiz rutinini çalıştırın.
    NOT: Tüm parametreler tek bir dosyada verildiği için .xlxs dosyaları tercih edilir; Diğer biçimler (.csv veya .tsv) parametre başına bir dosya oluşturur.

Sonuçlar

faz kontrastı ve immünofloresan konfokal görüntüleme ile karakterize hiPSC-CM matürasyonu
MECM kaplamalı 96 delikli plakalar kullanılarak ticari olarak temin edilebilen hiPSC-CM'lerin ECM aracılı olgunlaşması için zaman çizelgesi Şekil 1A'da sunulmuştur. Bu veriler, laboratuvara kriyokorunmuş hücre şişeleri olarak gelen ticari olarak temin edilebilen kardiyomiyositler kullanılarak toplanır. Her flakon >5 × 106 canlı kardiyomiyosit içeri...

Tartışmalar

HiPSC-CM'ler kullanılarak in vitro kardiyotoksisite taramasına birkaç farklı yaklaşım vardır. HiPSC-CM'lerin kullanımı ile ilgili yakın tarihli bir "En İyi Uygulamalar" makalesi, çeşitli in vitro tahlilleri, birincil okumalarını ve daha da önemlisi, insan kardiyak elektrofizyolojik fonksiyonunu ölçmek için her bir tahlilin granülerliğini sunmuştur20. Membran delici elektrotların kullanılmasına ek olarak, insan kardiyak elektrofizyolojik fonksiyonunun en d...

Açıklamalar

TB, StemBioSys, Inc.'in bir çalışanıdır. AMR ve JC, StemBioSys, Inc.'in eski danışmanlarıdır.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH hibeleri HL148068-04 ve R44ES027703-02 (TJH) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin EDTAGibco25200-056
0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L)Millipore SigmaA3294
2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)Millipore SigmaH4034
AdGCaMP6mVector biolabs1909
Albumin humanSigmaA9731-1G
alpha actinin antibodyThermoFisherMA1-22863
B27Gibco17504-044
BlebbistatinSigmaB0560
CalBryte 520AMAAT Bioquest20650
CELLvo MatrixPlus 96wpStemBiosysN/Ahttps://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus
CHIR99021LC Laboratoriesc-6556
Clear Assay medium (fluorobrite)ThermoFisherA1896701For adenovirus transduction
DAPIThermoFisher62248
DMEM:F12Gibco11330-032
FBS (Fetal Bovine Serum)SigmaF4135-500ML
FluoVoltThermoFisherF10488
HBSSGibco14025-092
iCell CM maintenance mediaFUJIFILM/Cellular DynamicsM1003
iCell2 CMsFUJIFILM1434
Incucyte Zoom Sartorius
iPS DF19-9-11T.HWiCell
IsoproterenolMilliporeSigmaCAS-51-30-9
IWP4Tocris5214
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrateSigmaA8960-5g
L-glutamineGibcoA2916801
LS columnsMiltenyii Biotec130-042-401
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)Miltenyii Biotec130-091-221
MatrigelCorning354234
MitoTracker RedThermoFisherM7512
Nautilus HTS Optical Mapping CuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Nikon A1R Confocal MicroscopeNikon
nonessential amino acidsGibco11140-050
pre-separation filterMiltenyii Biotec130-041-407
PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, humanMiltenyii Biotec130-110-188
PulseCuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Quadro MACS separator (Magnet)Miltenyii Biotec130-091-051
Retinoic acidSigmaR2625
RPMI 1640 Gibco11875-093
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)Gibco22400-089
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyii Biotec130-107-086
TnI antibody (pan TnI)Millipore SigmaMAB1691 
Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution)Gibco15040-066
Y-27632 dihydrochlorideTocris1254
β-mercaptoethanolGibco21985023

Referanslar

  1. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  2. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  3. Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
  4. Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
  5. Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical trials in a dish. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).
  6. Blinova, K., et al. Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs. Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).
  7. Blinova, ., et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
  8. da Rocha, A. M., et al. hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen. Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).
  9. da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay. Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).
  10. Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
  11. Lam, C. K., Wu, J. C. Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come. European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).
  12. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
  13. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
  14. Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: new phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
  15. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
  16. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  17. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  18. Herron, T. J., et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).
  19. Block, T., et al. Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes. Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).
  20. Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
  21. Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  23. Davis, J., et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).
  24. Diaz, R. J., Wilson, G. J. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models. Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır