Criblage de cardiotoxicité à haut débit utilisant des monocouches de cardiomyocytes de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme mature

Résumé

Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) offrent une alternative à l’utilisation d’animaux pour le dépistage cardiotoxique préclinique. Une limite à l’adoption généralisée des CSPhi-CM dans le dépistage de la toxicité préclinique est le phénotype immature, semblable au fœtus des cellules. Les protocoles pour une maturation robuste et rapide des CM-HIPSC sont présentés ici.

Résumé

Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches induites humaines (hiPSC-CM) sont utilisés pour remplacer et réduire la dépendance à l’égard des animaux et des cellules animales pour les tests de cardiotoxicité précliniques. Dans des formats monocouches bidimensionnels, les hiPSC-CM récapitulent la structure et la fonction des cellules du muscle cardiaque humain adulte lorsqu’elles sont cultivées sur une matrice extracellulaire optimale (ECM). Une ECM (matrice extracellulaire induisant la maturation-MECM) dérivée de cellules souches périnatales humaines fait mûrir la structure, la fonction et l’état métabolique de l’hiPSC-CM en 7 jours après le placage.

Les monocouches matures d’hiPSC-CM répondent également comme prévu aux médicaments cliniquement pertinents, avec un risque connu de provoquer des arythmies et une cardiotoxicité. La maturation des monocouches hiPSC-CM était un obstacle à l’adoption généralisée de ces cellules précieuses pour la science réglementaire et le dépistage de la sécurité, jusqu’à présent. Cet article présente des méthodes validées pour le placage, la maturation et le phénotypage fonctionnel à haut débit de la fonction électrophysiologique et contractile de l’hiPSC-CM. Ces méthodes s’appliquent aux cardiomyocytes purifiés disponibles dans le commerce, ainsi qu’aux cardiomyocytes dérivés de cellules souches générés en interne à l’aide de protocoles de différenciation hautement efficaces et spécifiques à la chambre.

La fonction électrophysiologique à haut débit est mesurée à l’aide de colorants sensibles à la tension (VSD; émission: 488 nm), de fluorophores sensibles au calcium (LCR) ou de capteurs de calcium génétiquement codés (GCaMP6). Un dispositif de cartographie optique à haut débit est utilisé pour les enregistrements optiques de chaque paramètre fonctionnel, et un logiciel dédié personnalisé est utilisé pour l’analyse des données électrophysiologiques. Les protocoles MECM sont appliqués pour le dépistage des médicaments à l’aide d’un inotrope positif (isoprénaline) et d’un gène humain lié à l’éther (hERG) bloqueur spécifique du canal. Ces ressources permettront à d’autres chercheurs d’utiliser avec succès les CM-HIPSC matures pour le dépistage cardiotoxique préclinique à haut débit, les tests d’efficacité des médicaments cardiaques et la recherche cardiovasculaire.

Introduction

Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC-CM) ont été validés à l’échelle internationale et sont disponibles pour le dépistage de la cardiotoxicité in vitro ¹. Les hiPSC-CM très purs peuvent être générés en nombre pratiquement illimité, cryoconservés et décongelés. Lors du replating, ils se réaniment également et commencent à se contracter avec un rythme rappelant le cœur humain ^2,3. Remarquablement, les hiPSC-CM individuels se couplent les uns aux autres et forment une syncytie fonctionnelle qui bat comme un seul tissu. De nos jours, les CSPhi sont systématiquement dérivées d’échantillons de sang de patients, de sorte que toute personne peut être représentée à l’aide de tests de cardiotoxicité hiPSC-CM in vitro ^4,5. Cela crée l’opportunité d’effectuer des « essais cliniques dans un plat », avec une représentation significative de diverses populations⁶.

Un avantage essentiel par rapport aux approches existantes de dépistage de la cardiotoxicité animale et cellulaire animale est que les hiPSC-CM utilisent le génome humain complet et offrent un système in vitro présentant des similitudes génétiques avec le cœur humain. Ceci est particulièrement intéressant pour la pharmacogénomique et la médecine personnalisée - l’utilisation de hiPSC-CM pour le développement de médicaments et d’autres thérapies devrait fournir des prescriptions de médicaments plus précises, précises et sûres. En effet, les tests bidimensionnels (2D) hiPSC-CM monocouche se sont avérés prédictifs de la cardiotoxicité des médicaments, en utilisant un panel de médicaments utilisés cliniquement avec un risque connu de provoquer des arythmies 1,7,8,9. Malgré le vaste potentiel des hiPSC-CM et la promesse de rationaliser et de rendre le développement de médicaments moins cher, il y a eu une réticence à utiliser ces nouveaux tests^10,11,12.

Jusqu’à présent, l’une des principales limites de l’adoption et de l’acceptation généralisées des tests de dépistage HiPSC-CM est leur apparence immature, semblable à celle du fœtus, ainsi que leur fonction. La question critique de la maturation hiPSC-CM a été examinée et débattue dans la littérature scientifique ad nauseum^13,14,15,16. De même, de nombreuses approches ont été utilisées pour promouvoir la maturation hiPSC-CM, y compris les manipulations de la matrice extracellulaire (ECM) dans les monocouches 2D et le développement de tissus cardiaques modifiés en 3D (EHTs)^17,18. À l’heure actuelle, il existe une croyance largement répandue selon laquelle l’utilisation de EHT 3D fournira une maturation supérieure par rapport aux approches monocouches 2D. Cependant, les monocouches 2D offrent une plus grande efficacité d’utilisation des cellules et un succès accru dans le placage par rapport aux EHT 3D; Les EHT 3D utilisent un plus grand nombre de cellules et nécessitent souvent l’inclusion d’autres types de cellules qui peuvent confondre les résultats. Par conséquent, dans cet article, l’accent est mis sur l’utilisation d’une méthode simple pour faire mûrir les hiPSC-CM cultivés en tant que monocouches 2D de cellules couplées électriquement et mécaniquement.

La maturation hiPSC-CM avancée peut être réalisée en monocouches 2D à l’aide d’un ECM. Les monocouches 2D des hiPSC-CM peuvent être affinées à l’aide d’une couche de couverture souple et flexible en polydiméthylsiloxane, recouverte d’une matrice membranaire basale sécrétée par une cellule de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (ECM de souris). En 2016, des rapports ont montré que les CM-HIPSC cultivés sur cette condition ECM molle ont mûri fonctionnellement, affichant des vitesses de conduction potentielles d’action proches des valeurs cardiaques adultes (~50 cm/s)¹⁸. De plus, ces hiPSC-CM matures présentaient de nombreuses autres caractéristiques électrophysiologiques rappelant le cœur adulte, notamment un potentiel membranaire au repos hyperpolarisé et l’expression de K_ir2.1. Plus récemment, des rapports ont identifié un revêtement ECM dérivé de cellules souches périnatales humaines qui favorise la maturation structurelle des hiPSC-CMs^{2D 19}. Ici, des méthodes faciles à utiliser sont présentées aux monocouches 2D hiPSC-CM structurellement matures pour une utilisation dans des criblages électrophysiologiques à haut débit. En outre, nous fournissons la validation d’un instrument de cartographie optique pour l’acquisition et l’analyse automatisées de la fonction électrophysiologique monocouche 2D hiPSC-CM, à l’aide de colorants sensibles à la tension (VSD) et de sondes et protéines sensibles au calcium.

Protocole

L’utilisation de la CSPhi dans ce protocole a été approuvée par le comité HPSCRO de l’Université du Michigan (Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee). Voir le tableau des matériaux pour une liste des matériaux et de l’équipement. Voir le tableau 1 pour les supports et leurs compositions.

1. Décongélation et placage de hiPSC-CM cryoconservés disponibles dans le commerce pour maturation sur une matrice extracellulaire induisant la maturation (MECM)

1. Réchauffer tous les réactifs à température ambiante et réhydrater les plaques MECM avec la solution saline équilibrée (HBSS) ou la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de Hank contenant du calcium et du magnésium, pendant 1 h avant le placage cardiomyocytaire (200 μL de tampon par puits d’une plaque de 96 puits).
2. Laver les plaques MECM 2x avec HBSS ou PBS contenant du calcium et du magnésium pendant 1 h avant le placage cardiomyocytaire (200 μL de tampon par puits d’une plaque de 96 puits) et garder les puits hydratés.
3. Préparez un bain-marie à 37 °C.
4. Retirez les tubes cardiomyocytaires du réservoir d’azote liquide, transférez les tubes dans de la glace sèche et ouvrez légèrement les bouchons des tubes pour relâcher la pression.
   REMARQUE: Relâcher la pression dans les tubes est extrêmement important! Si trop de pression s’accumule à l’intérieur des tubes, ils pourraient exploser.
5. Refermez les bouchons du tube et placez-les au bain-marie pour les décongeler pendant 4 min.
   REMARQUE: Laissez-les décongeler complètement, pour éviter les dommages cellulaires dus à la décongélation partielle.
6. Après la décongélation des cellules, pulvériser les tubes avec de l’éthanol à 70% avant de les ouvrir. Transférer les cellules dans des tubes coniques de 15 mL à l’aide d’une pipette de 1 mL. Égoutter lentement 8 mL de milieu de placage, en agitant le tube chaque fois que 1 mL est ajouté, pour permettre aux cellules de s’adapter aux changements d’osmolarité.
   1. Laver le cryoflain avec 1 mL de produit de placage à l’aide d’une pipette en verre de 1 mL. Ensuite, versez lentement le lavage dans le tube conique de 15 mL.
7. Centrifuger les tubes à ~300 × g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 1 mL de milieu de placage. Retirer une partie aliquote et effectuer le comptage des cellules vivantes à l’aide d’un hémocytomètre. Ajouter un milieu de placage supplémentaire pour obtenir 7,5 × 10⁵ cellules/mL.
   REMARQUE : Environ 10 mL de suspension cellulaire sont nécessaires pour préparer 96 puits.
8. Distribuer 100 μL de suspension cellulaire par puits d’une plaque de 96 puits revêtue de MECM à l’aide d’une pipette multicanal.
   REMARQUE: Assurez-vous d’éviter la précipitation cellulaire et d’obtenir une densité cellulaire uniforme dans tous les puits pendant le placage.
9. Incuber les cellules à 37 °C, 5% de CO 2 pendant₂ jours avant de changer le milieu en milieu d’entretien (200 μL/puits). Changez le milieu d’entretien le jour 5 après la décongélation. Effectuer des tests EP le jour 7 ou plus tard, comme décrit précédemment ^8,9. Changez le milieu tous les deux jours lorsque vous optez pour l’extension de la culture cellulaire.

2. Différenciation dirigée vers le cœur de la hiPSC et purification de l’hiPSC-CM

1. Solution chaude 1x d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) disponible dans le commerce, HBSS sans calcium ni magnésium (HBSS--), et plaques à 6 puits recouvertes d’une matrice membranaire basale solubilisée sécrétée par une cellule de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (ECM de souris) à température ambiante.
2. Marquez les colonies différenciées par microscopie à contraste de phase et aspirez/ablate. Bien laver chaque lavage avec 1 mL de HBSS--. Effectuer deux lavages dans des puits contenant >10 points de différenciation.
3. Aspirer le HBSS et ajouter 1 mL de solution d’EDTA à chaque puits. Incuber les plaques jusqu’à 5 min à 37 °C. Vérifiez les plaques après 3 minutes et recherchez des colonies blanches translucides et visibles.
4. Aspirer la solution d’EDTA et ajouter 1 mL dans un seul puits. Déloger les cellules avec 2 mL de milieu hiPSC en pipetant la suspension de haut en bas à plusieurs reprises, à l’aide d’une pipette en verre de 10 ml pour détacher toutes les cellules souches du puits, et transférer la suspension cellulaire dans un tube de collecte. Répétez l’aspiration et délogez avec les puits suivants.
   REMARQUE: Délogez les colonies difficiles à soulever avec la pointe de la pipette en verre.
5. Compter les cellules souches et ajuster le volume à la plaque 8,0 × 10⁵ cellules/puits. Culture des cellules sur milieu hiPSC (2 mL/puits) jusqu’à ce que les cellules souches atteignent 90% de confluence (cette fois est désormais appelée D₀).
6. Préparer 2 mL de milieu de différenciation basal additionné de 4 μM de CHIR99021.
7. À J₀, laver chaque puits d’une plaque de cellules souches à 6 puits avec 1 mL d’HBSS par puits. Remplacer le HBSS par un milieu de différenciation basal complété par 4 μM de CHIR99021.
8. Sur J₁, ne rien faire.
9. Sur_J2, préparer un milieu de différenciation basal complété par 4 μM d’IWP4.
10. Remplacer le milieu par 2 mL de milieu de différenciation basal supplémenté en IWP4 par puits.
11. Sur D₃, ne rien faire pour une différenciation ventrale spécifique. Pour une différenciation spécifique à l’auriculaire, aspirer le milieu et ajouter 2 mL de milieu basal complété par 4 μM d’IWP4 et 1 μM de solution d’acide rétinoïque (RA) par puits.
12. Sur_J4, aspirer le milieu et ajouter 2 mL de milieu basal par puits pour la différenciation ventriculaire. Pour une différenciation auriculaire, aspirer le milieu et ajouter 2 mL de milieu basal complété par 1 μM de solution de PR par puits.
13. Sur J₅, ne rien faire.
14. Sur_J6, aspirer le milieu et ajouter 2 mL de milieu basal par puits (pour la différenciation auriculaire et ventriculaire).
15. Sur la J₇, ne rien faire.
16. À_J8, aspirer le milieu et ajouter 2 mL de milieu d’entretien cardiomyocytes. Changez le milieu tous les deux jours jusqu’à la séparation des cellules, ou suivez un plan d’exposition chronique au médicament.

3. purification hiPSC-CM via MACS (tri cellulaire activé magnétiquement)

1. Aspirer le milieu de culture cellulaire et bien laver chaque avec 1 mL de HBSS--. Dissocier les cellules en ajoutant 1 mL de trypsine/EDTA à 0,25 % et en incubant à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 10 min. Remettez en suspension et singularisez les cellules de chaque puits avec 2 mL de milieu de placage pour inactiver la trypsine/EDTA.
2. Recueillir les cellules des six puits dans un tube conique de 50 ml avec une crépine de 70 μm. Ensuite, lavez la passoire avec 3 ml de produit de placage. Comptez les cellules.
3. Centrifuger la suspension à ~300 × g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et laver les cellules avec 20 ml de tampon de séparation MACS glacé. Ensuite, centrifuger à nouveau à ~300 × g pendant 5 min.
4. Remettez la pastille en suspension dans 80 μL de tampon de séparation MACS froid par 5 × 10⁶ cellules. Ajouter 20 μL de cocktail froid de déplétion non cardiomyocytaire (humain) par 5 × 10⁶ cellules. Mélanger délicatement la suspension cellulaire et incuber sur de la glace pendant 10 min.
5. Lavez l’échantillon en ajoutant 4 mL de tampon de séparation MACS froid par 5 × 10^{à 6} cellules. Centrifuger l’échantillon à ~300 × g pendant 5 min et aspirer le surnageant.
6. Remettez la pastille en suspension dans 80 μL de tampon de séparation MACS froid par 5 × 10⁶ cellules. Ajouter 20 μL de microbilles froides anti-biotine par 5 × 10⁶ cellules. Mélanger délicatement la suspension cellulaire et incuber pendant 10 min sur de la glace.
7. Pendant l’incubation des échantillons, placer les colonnes de déplétion positive (équipées des filtres de préséparation de 30 μm) sur le séparateur MACS et placer les tubes de prélèvement de 15 mL étiquetés sous les colonnes. Une colonne est nécessaire pour 5 × 10⁶ cellules.
8. Amorcez chaque colonne avec 3 mL de tampon de séparation MACS froid. Mélanger la suspension cellulaire traitée par anticorps avec 2 mL de tampon de séparation MACS par 5 × 10⁶ cellules, et ajouter à la colonne.
   REMARQUE: Ne pas centrifuger! La centrifugation à cette étape a des effets néfastes sur le rendement en cardiomyocytes .
9. Ajouter 2 mL de tampon de séparation MACS à chaque colonne et recueillir le flux jusqu’à ce que 12 mL de suspension de cardiomyocytes à écoulement continu soient recueillis.
   REMARQUE : Ne laissez jamais les colonnes sécher complètement.
10. Centrifuger les cardiomyocytes à ~300 × g pendant 5 min, jeter le surnageant et suspendre les cardiomyocytes dans 1 mL de milieu de placage.
11. Compter les cellules pour déterminer la concentration, ajuster le volume à la densité d’ensemencement souhaitée et plaquer les cellules. Plaquez les cardiomyocytes purifiés sur les plaques MECM 96 puits, comme décrit ci-dessus aux étapes 1.9-1.11 (7,5 × 10⁵ cellules/puits).

4. Cartographie optique à l’aide de colorants sensibles à la tension (VSD) et de fluorophores sensibles au calcium (LCR)

1. Préparer la quantité appropriée de VSD dans HBSS avec du calcium et du magnésium, en ajoutant 1 μL de colorant VSD par mL de HBSS et 10 μL d’adjuvant de charge par mL de HBSS.
   REMARQUE : En règle générale, une plaque de 96 puits nécessite 10 mL de solution VSD.
2. Vous pouvez également préparer HBSS avec du calcium et du magnésium complétés par 5 μM de LCR. Aspirer le milieu d’entretien des cardiomyocytes et remplacer par 100 μL de VSD ou de LCR par puits d’une plaque de 96 puits. Incuber les cellules pendant 30 min dans l’incubateur de culture cellulaire.
3. Retirez les colorants et remplacez-les par un milieu de dosage ou HBSS. Équilibrer à 37 °C pour l’acquisition de la cartographie optique des données de base avec un dispositif de cartographie optique à haut débit.
4. Traiter les cellules avec des médicaments pour les tests d’exposition aiguë, ou cartographier les cellules qui ont été exposées de façon chronique à des médicaments d’intérêt.
5. Pour les essais de cardiotoxicité dans des plaques à 96 puits, utiliser quatre doses d’un composé avec au moins six puits par dose. Utiliser des doses allant de dessous à au-dessus de la concentration plasmatique thérapeutique efficace, y compris une dose de la concentration plasmatique thérapeutique cliniquement efficace.
6. Diluer les médicaments dans du diméthylsulfoxyde, les conserver sous forme de solutions mères à -20 °C, puis les diluer dans HBSS aux concentrations souhaitées.
7. Effectuer des mesures électrophysiologiques de base avant l’application du médicament, comme décrit à la section 5. Une fois les médicaments appliqués, faites des enregistrements électrophysiologiques au moins 30 minutes plus tard pour les études chroniques. Voir les sections suivantes pour les procédures d’acquisition et d’analyse des données de cartographie optique.

5. Cartographie optique à l’aide d’un indicateur de calcium codé génétiquement (GECI)

1. Plaques hiPSC-CM disponibles dans le commerce ou purifiées MACS, comme décrit ci-dessus, utilisant des plaques 96 puits revêtues de MECM pour fabriquer des hiPSC-CM matures. Pour former des monocouches confluentes, plaquer 7,5 × 10⁴ cm par puits de chaque plaque de 96 puits. Utilisez un support de placage.
2. Après 48 h en milieu de placage, passer au milieu d’entretien des cardiomyocytes .
3. Le jour 4 après la décongélation et le replatage, ajouter l’adénovirus recombinant pour exprimer GCaMP6m (AdGCaMP6m) aux cellules à une multiplicité d’infection (MOI) = 5. Ajouter le virus à l’aide du milieu de dosage CM.
   REMARQUE: Ici, des expériences utilisant GCaMP6m ont été effectuées sur des cardiomyocytes iCell² d’un fournisseur commercial.
4. Le jour 5, retirez le milieu adGCaMP6m et remplacez-le par un nouveau RPMI+B27 (milieu d’entretien cardiomyocytes).
5. Le jour 7, observez les CM à l’aide de la microscopie ou de l’imageur de cartographie optique, pour visualiser les contractions spontanées et les transitoires calciques correspondants.
6. Au jour 7 ou plus tard, pour le dépistage des médicaments, transférer directement les plaques à 96 puits des monocouches hiPSC-CM matures exprimant GCaMP6m à l’imageur de cartographie optique de l’incubateur pour l’acquisition des données de référence.
7. Après l’acquisition des données électrophysiologiques, retourner les plaques des CM dans l’incubateur de culture tissulaire, pour des mesures à un point temporel ultérieur.
8. Après les enregistrements de référence, appliquer les médicaments, en utilisant au moins quatre doses de chaque médicament et au moins six puits par dose. Équilibrer les médicaments sur les cellules pendant au moins 30 minutes avant la collecte des données. Réchauffer la température du puits à ~37 °C avant et pendant l’acquisition des données.
9. Après les enregistrements de base d’une plaque entière, ajouter de l’isoprotérénol (500 nM) à chaque puits pour obtenir des données robustes sur la réponse aux médicaments. Quantifier les effets de l’isoprotérénol sur la vitesse de battement monocouche, l’amplitude de contraction (amplitude transitoire du calcium) et la durée transitoire du calcium (voir Figure 6), comme décrit à la rubrique 5.

6. Acquisition de données cartographiques optiques et analyse

1. Assurez-vous que la caméra du périphérique de cartographie optique, le transilluminateur et le réchauffeur de plaque sont allumés.
2. Ouvrez le logiciel d’acquisition et déterminez l’emplacement d’enregistrement du fichier.
3. Ouvrez le tiroir avant et positionnez la plaque sur la plaque chauffante.
4. Acquérir un cadre sombre en cliquant sur le bouton Cadre sombre .
5. Sélectionnez Durée (10-30 s) et Frame Rate of Acquisition (par exemple, 100 ips ; 250 ips pour une résolution temporelle supérieure), puis cliquez sur Démarrer l’acquisition.
6. Ouvrez le logiciel d’analyse et, dans l’onglet Importer/Filtrer, sélectionnez Rechercher un seul fichier ou Mosaïque multiple pour reconstruire une plaque.
7. Sélectionnez Mode paramètre (APD ou CaTD), entrez Distance par pixel et utilisez l’Assistant Puits pour déterminer l’emplacement des puits dans l’image. Cliquez sur Enregistrer le processus pour passer à l’onglet suivant.
8. Ouvrez l’onglet ROIs (régions d’intérêt) et choisissez de dessiner les ROIs manuellement, Automatically ou Ne pas utiliser les ROI du tout, ce qui considérerait alors l’ensemble du puits pour analyse. Une fois les ROI sélectionnés, cliquez sur le bouton Traiter/Enregistrer pour passer à l’étape suivante. Cochez les cases Masquer les puits et Afficher uniquement les filtres pour visualiser le retour sur investissement.
9. Ouvrez l’onglet Analyse et, en haut à droite de l’écran, sélectionnez chaque puits ou retour sur investissement pour confirmer la précision de la détection automatique des battements. Ajoutez ou supprimez des battements des traces en appuyant sur Ajouter un battement/Enregistrer les battements, ou en sélectionnant un rythme individuel et en appuyant sur Suppr sur le clavier.
10. Vous pouvez également utiliser la fonction Cartes thermiques moyennes pour créer des cartes thermiques des paramètres sélectionnés pour la plaque.
11. Cliquez sur le bouton Time-Space Plot dans l’onglet Analyse pour visualiser les données de chaque puits ou le retour sur investissement. Après vous être assuré que la détection de battement est précise, passez à l’onglet Exporter et sélectionnez Format de fichier. Appuyez sur Exporter et créez un dossier vers lequel les données à exporter. Procédez à l’ouverture des fichiers de données et exécutez la routine d’analyse statistique choisie.
    Remarque : .xlxs fichiers sont préférés car tous les paramètres sont exportés dans un seul fichier ; D’autres formats (.csv ou .tsv) génèrent un fichier par paramètre.

Résultats

maturation hiPSC-CM caractérisée par contraste de phase et imagerie confocale immunofluorescente
La chronologie de la maturation médiée par ECM des CM-hiPSC disponibles dans le commerce à l’aide de plaques à 96 puits revêtues de MECM est présentée à la figure 1A. Ces données sont recueillies à l’aide de cardiomyocytes disponibles dans le commerce qui arrivent en laboratoire sous forme de flacons cryoconservés de cellules. Chaque flacon contient >5 × 10

Discussion

Il existe plusieurs approches différentes pour le dépistage de la cardiotoxicité in vitro à l’aide de hiPSC-CM. Un récent article sur les « meilleures pratiques » sur l’utilisation des CM-HIPSC a présenté les différents tests in vitro , leurs lectures primaires et, surtout, la granularité de chaque essai pour quantifier la fonction électrophysiologique cardiaque humaine²⁰. En plus d’utiliser des électrodes de perçage de membrane, la mesure la plus directe de l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin EDTA	Gibco	25200-056
0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L)	Millipore Sigma	A3294
2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)	Millipore Sigma	H4034
AdGCaMP6m	Vector biolabs	1909
Albumin human	Sigma	A9731-1G
alpha actinin antibody	ThermoFisher	MA1-22863
B27	Gibco	17504-044
Blebbistatin	Sigma	B0560
CalBryte 520AM	AAT Bioquest	20650
CELLvo MatrixPlus 96wp	StemBiosys	N/A	https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus
CHIR99021	LC Laboratories	c-6556
Clear Assay medium (fluorobrite)	ThermoFisher	A1896701	For adenovirus transduction
DAPI	ThermoFisher	62248
DMEM:F12	Gibco	11330-032
FBS (Fetal Bovine Serum)	Sigma	F4135-500ML
FluoVolt	ThermoFisher	F10488
HBSS	Gibco	14025-092
iCell CM maintenance media	FUJIFILM/Cellular Dynamics	M1003
iCell2 CMs	FUJIFILM	1434
Incucyte Zoom	Sartorius
iPS DF19-9-11T.H	WiCell
Isoproterenol	MilliporeSigma	CAS-51-30-9
IWP4	Tocris	5214
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate	Sigma	A8960-5g
L-glutamine	Gibco	A2916801
LS columns	Miltenyii Biotec	130-042-401
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)	Miltenyii Biotec	130-091-221
Matrigel	Corning	354234
MitoTracker Red	ThermoFisher	M7512
Nautilus HTS Optical Mapping	CuriBio		https://www.curibio.com/products-overview
Nikon A1R Confocal Microscope	Nikon
nonessential amino acids	Gibco	11140-050
pre-separation filter	Miltenyii Biotec	130-041-407
PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human	Miltenyii Biotec	130-110-188
Pulse	CuriBio		https://www.curibio.com/products-overview
Quadro MACS separator (Magnet)	Miltenyii Biotec	130-091-051
Retinoic acid	Sigma	R2625
RPMI 1640	Gibco	11875-093
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)	Gibco	22400-089
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyii Biotec	130-107-086
TnI antibody (pan TnI)	Millipore Sigma	MAB1691
Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution)	Gibco	15040-066
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
β-mercaptoethanol	Gibco	21985023