تقنية عالية الإنتاجية قائمة على قياس التدفق الخلوي لفحص الأدوية المثبطة للإنتغرين

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة فحص عالية الإنتاجية قائمة على قياس التدفق الخلوي لتحديد الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة التي تمنع تنشيط β2 integrin على العدلات البشرية.

Abstract

يهدف هذا البروتوكول إلى إنشاء طريقة لتحديد المضادات الجزيئية الصغيرة لتنشيط β2 integrin ، باستخدام الأجسام المضادة للإبلاغ عن التغيير المطابق وقياس التدفق الخلوي عالي الإنتاجية. يمكن أن تكون الطريقة أيضا بمثابة دليل لطرق الفحص الأخرى عالية الإنتاجية القائمة على الأجسام المضادة. β2 integrins هي جزيئات التصاق خاصة بالكريات البيض والتي تعتبر حاسمة في الاستجابات المناعية. تعتمد العدلات على تنشيط الإنتغرين للخروج من مجرى الدم ، ليس فقط لمكافحة العدوى ولكن أيضا للمشاركة في أمراض التهابية متعددة. يمثل التحكم في تنشيط β2 integrin نهجا قابلا للتطبيق لعلاج الأمراض الالتهابية المرتبطة بالعدلات. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام جسم مضاد وحيد النسيلة ، mAb24 ، والذي يرتبط على وجه التحديد بغطاء الرأس عالي التقارب ل β2 integrins ، لتحديد تنشيط β2 integrin على العدلات البشرية الأولية المعزولة. يستخدم N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) كحافز لتنشيط العدلات β2 integrins. تم استخدام مقياس خلوي عالي الإنتاجية قادر على تشغيل عينات صفيحة 384 بئرا تلقائيا في هذه الدراسة. يتم تقييم آثار 320 مادة كيميائية على تثبيط β2 integrin في غضون 3 ساعات. يمكن تحديد الجزيئات التي تستهدف مباشرة β2 integrins أو الجزيئات المستهدفة في مسار إشارات التنشيط من الداخل إلى الخارج الذي بدأه مستقبلات البروتين G من الداخل إلى الخارج من خلال هذا النهج.

Introduction

تتميز العديد من الأمراض الالتهابية بتسلل العدلات في موقع التورم أو الإصابة¹. للتسلل إلى هذه الأنسجة ، يجب أن تكمل العدلات سلسلة تجنيد العدلات ، والتي تنطوي على الاعتقال إلى البطانة ، والإسراف عبر جدار الوعاء الدموي ، والتجنيد في الأنسجة². تحتاج العدلات المتداولة إلى تنشيط β2 integrin لإكمال هذا الشلال ، خاصة لمرحلة الاعتقال. وبالتالي ، فإن الأدوية المثبطة للإنتغرين التي تقلل من التصاق العدلات ، والإسراف ، والتوظيف قد تعالج الأمراض الالتهابية بشكل فعال ^3,4.

تم استهداف β2 integrins للأمراض الالتهابية من قبل. تم تطوير Efalizumab ، وهو جسم....

Protocol

تم الحصول على عينات الدم الكامل الهيبارين من متبرعين أصحاء غير محددين بعد الحصول على موافقة مستنيرة ، على النحو الذي وافق عليه مجلس المراجعة المؤسسية ل UConn Health ، وفقا لمبادئ إعلان هلسنكي. وتم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع الجهات المانحة. تم تطوير معايير الإدراج / الاستبعاد لهذه الدراسة بعناية لضمان ملاءمة المشاركين وتقليل المخاطر المحتملة. وتتراوح أعمار المشاركين المؤهلين بين 18 و 65 عاما، من أي عرق، ويجيدون اللغة الإنجليزية، وقادرون على تقديم موافقة مستنيرة. شمل المشاركون المستبعدون أولئك غير القادرين على تقديم موافقة مستنيرة لأنفسهم ، مثل أولئك الذين يحتاجون إلى ممثل مفوض قانونا ، والأفراد الذين تقل أعمارهم عن 18 عاما أو أكثر من 65 عاما ، والأفراد المسجونين....

النتائج

كشفت البيانات المأخوذة من فحص لوحة 384 بئرا تمثيليا (الشكل 4) أن الضوابط السلبية تحتوي على MFI من mAb24-APC من 3236 ± 110 ، بينما كان للضوابط الإيجابية MFI من mAb24-APC من 7588 ± 858. يبلغ عامل Z لهذه اللوحة حوالي 0.33 ، وهو ضمن نطاق مقبول³¹. ومع ذلك ، يتطلب Z مزيدا من التحقق في المقايسات ا?.......

Discussion

يتم تحديد بدء وإنهاء تحفيز العدلات وتلطيخها عن طريق إضافة العدلات و PFA المثبت. لذلك ، فإن ضمان نفس الفاصل الزمني بين العدلات الماصة أو PFA في كل عمود أمر بالغ الأهمية. هذا يضمن أن وقت التحفيز وتلطيخ العدلات من كل بئر لا يزال ثابتا. نظرا لقصر عمر العدلات ، يجب إجراء التجربة بأكملها ، من جمع الدم.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16-channel pipettes	Thermo	4661090N	Instrument
384-well plate	Greiner	784201	Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24	BioLegend	363410	Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform	Agilent	16050-102	384 multi-channel liquid handler
Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R	Instrument
FlowJo	Becton, Dickinson & Company	NA	Software
Human Serum Albumin Solution (25%)	GeminiBio	800-120	Reagents
Lifitegrast	Thermofisher	50-208-2121	Reagents
Nexinhib20	Tocris	6089	Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)	Sigma	F3506	Reagents
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710	Reagents
Plate buckets	Eppendorf	UL155	Accessory
Plate shaker	Fisher	88-861-023	Instrument
PolymorphPrep	PROGEN	1895 (previous 1114683)	Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)	Prestwick Chemical Libraries	Ver19_384	1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red	Gibco	11-835-030	Reagents
Swing-bucket rotor	Eppendorf	A-4-62	Rotor
ZE5 Cell Analyzer	Bio-Rad Laboratories	Model ZE5	Instrument