Una técnica de alto rendimiento basada en citometría de flujo para el cribado de fármacos inhibidores de integrinas

Resumen

Este protocolo describe un método de cribado de alto rendimiento basado en citometría de flujo para identificar fármacos de moléculas pequeñas que inhiben la activación de la integrina β2 en neutrófilos humanos.

Resumen

Este protocolo tiene como objetivo establecer un método para identificar pequeños antagonistas moleculares de la activación de integrinas β2, utilizando anticuerpos que informan de cambios conformacionales y citometría de flujo de alto rendimiento. El método también puede servir como guía para otros métodos de cribado de alto rendimiento basados en anticuerpos. Las integrinas β2 son moléculas de adhesión específicas de los leucocitos que son cruciales en las respuestas inmunitarias. Los neutrófilos dependen de la activación de la integrina para salir del torrente sanguíneo, no solo para combatir infecciones, sino también para estar involucrados en múltiples enfermedades inflamatorias. El control de la activación de la integrina β2 presenta un enfoque viable para el tratamiento de las enfermedades inflamatorias asociadas a los neutrófilos. En este protocolo, se utiliza un anticuerpo monoclonal, mAb24, que se une específicamente a la pieza principal de alta afinidad de las integrinas β2, para cuantificar la activación de las integrinas β2 en neutrófilos humanos primarios aislados. La N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP) se utiliza como estímulo para activar las integrinas β2 de los neutrófilos. En este estudio se utilizó un citómetro de flujo de alto rendimiento capaz de procesar automáticamente muestras de placas de 384 pocillos. Los efectos de 320 sustancias químicas sobre la inhibición de la integrina β2 se evalúan en 3 h. A través de este enfoque, se pueden identificar moléculas que se dirigen directamente a las integrinas β2 o moléculas diana en la vía de señalización de activación de la integración iniciada por el receptor acoplado a la proteína G de adentro hacia afuera.

Introducción

Muchas enfermedades inflamatorias se caracterizan por la infiltración de neutrófilos en el sitio de la hinchazón o lesión¹. Para infiltrarse en estos tejidos, los neutrófilos deben completar la cascada de reclutamiento de neutrófilos, que implica la detención del endotelio, la extravasación a través de la pared del vaso y el reclutamiento en el tejido². Los neutrófilos circulantes necesitan la activación de la integrina β2 para completar esta cascada, especialmente para la fase de detención. Por lo tanto, los fármacos inhibidores de integrinas que reducen la adhesión, la extravasación y el recluta....

Protocolo

Se obtuvieron muestras de sangre entera heparinizadas de donantes humanos sanos no identificados después de obtener el consentimiento informado, según lo aprobado por la Junta de Revisión Institucional de UConn Health, siguiendo los principios de la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los donantes. Los criterios de inclusión/exclusión para este estudio se desarrollaron cuidadosamente para garantizar la idoneidad de los participantes y minimizar los riesgos potenciales. Los participantes elegibles tenían entre 18 y 65 años, eran de cualquier etnia, hablaban inglés con fluidez y eran capaces de dar su consentimiento informado. Entre l....

Discusión

El inicio y la terminación de la estimulación y tinción de neutrófilos están determinados por la adición de neutrófilos y el fijador PFA. Por lo tanto, es fundamental garantizar el mismo intervalo de tiempo entre el pipeteo de neutrófilos o PFA en cada columna. Esto asegura que el tiempo de estimulación y tinción de los neutrófilos de cada pocillo permanezca constante. Debido a la corta vida útil de los neutrófilos, todo el experimento, desde la recolección de sangre de los donantes hasta la realización de.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
16-channel pipettes	Thermo	4661090N	Instrument
384-well plate	Greiner	784201	Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24	BioLegend	363410	Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform	Agilent	16050-102	384 multi-channel liquid handler
Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R	Instrument
FlowJo	Becton, Dickinson & Company	NA	Software
Human Serum Albumin Solution (25%)	GeminiBio	800-120	Reagents
Lifitegrast	Thermofisher	50-208-2121	Reagents
Nexinhib20	Tocris	6089	Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)	Sigma	F3506	Reagents
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710	Reagents
Plate buckets	Eppendorf	UL155	Accessory
Plate shaker	Fisher	88-861-023	Instrument
PolymorphPrep	PROGEN	1895 (previous 1114683)	Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)	Prestwick Chemical Libraries	Ver19_384	1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red	Gibco	11-835-030	Reagents
Swing-bucket rotor	Eppendorf	A-4-62	Rotor
ZE5 Cell Analyzer	Bio-Rad Laboratories	Model ZE5	Instrument