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要約

このプロトコルは人間の好中球のβ2インテグリンの活発化を禁じる低分子薬剤を識別するために流れのcytometryベースの、ハイスループットのスクリーニング方法を記述する。

要約

このプロトコルは、β2インテグリン活性化の低分子アンタゴニストを特定する方法を確立することを目的としており、コンフォメーション変化報告抗体とハイスループットフローサイトメトリーを利用しています。この分析法は、他の抗体ベースのハイスループットスクリーニング法のガイドとしても役立ちます。β2インテグリンは、免疫応答に重要な白血球特異的な接着分子です。好中球は、感染症と戦うだけでなく、複数の炎症性疾患に関与するために、血流から出るためにインテグリンの活性化に依存しています。β2インテグリンの活性化を制御することは、好中球関連炎症性疾患を治療するための実行可能なアプローチです。このプロトコルでは、モノクローナル抗体であるmAb24は、β2インテグリンの高親和性ヘッドピースに特異的に結合し、単離された一次ヒト好中球のβ2インテグリンの活性化を定量化するために利用されます。N-ホルミルメチオニル-ロイシル-フェニルアラニン(fMLP)は、好中球β2インテグリンを活性化するための刺激として使用されます。この研究では、384ウェルプレートサンプルを自動的に分析できるハイスループットフローサイトメーターを使用しました。β2 インテグリン阻害に対する 320 種類の化学物質の効果を 3 時間以内に評価します。このアプローチにより、β2インテグリンを直接標的とする分子、またはGタンパク質共役受容体開始インテグリンのインサイドアウト活性化シグナル伝達経路の標的分子を同定することができます。

概要

多くの炎症性疾患は、腫れまたは損傷の部位における好中球の浸潤を特徴とする1。これらの組織に浸潤するために、好中球は、内皮への停止、血管壁を横切る血管外漏出、および組織への動員を含む好中球動員カスケードを完了する必要があります2。循環好中球は、特に停止期において、このカスケードを完了するためにβ2インテグリン活性化を必要とします。したがって、好中球の接着、血管外漏出、および動員を減少させるインテグリン阻害薬は、炎症性疾患を効果的に治療する可能性があります3,4。

β2インテグリンは、以前から炎症性疾患の標的となっていました。インテグリンαLβ2を直接標的とするモノクローナル抗体であるエファリズマブは、乾癬の治療薬として開発されました5。しかし、エファリズマブは、JCウイルスの再活性化に起因する進行性多巣性白質脳症という致命的な副作用のために中止されました6,7。新しい抗炎症インテグリンベースの治療法では、副作用を最小限に抑えるために白血球の抗感染機能を維持することを考慮する必要があります。エファリズマブの副作用は、血流中のモノクローナル抗体の循環が長引くことが原因である可能性があり、長期的には免疫機能を阻害する可能性があります8。最近の研究では、エファリズマブがαLβ2架橋とα4インテグリンの望ましくない内在化を媒介することが示されており、副作用の代替的な説明を提供しています9。したがって、短命の低分子アンタゴニストはこの問題を回避できる可能性があります。

ここでは、ヒト好中球を用いた低分子β2インテグリン拮抗薬のスクリーニングのためのハイスループット法を紹介します。β2インテグリンの活性化は、インテグリンエクトドメインへのアクセスとリガンドへの結合親和性の増加を得るために、インテグリンエクトドメインの立体配座変化を必要とします。正準スイッチブレードモデルでは、ベントクローズドインテグリンエクトドメインは、最初に拡張-閉鎖コンフォメーションまで伸長し、次にそのヘッドピースを完全に活性化された拡張-開放コンフォメーションに開きます10,11,12,13。また、ベントクローズドからベントオープン、エクステンデッドオープン、最終的には14,15,16,17,18,19までの代替経路もあります。コンフォメーション特異的抗体mAb24は、エクトドメインのヘッドピースが開いているときにヒトβ2-I様ドメインのエピトープに結合します20,21,22,23。

ここでは、mAb24-APCを使用して、β2インテグリンが活性化されているかどうかを判断します。好中球とインテグリンを活性化するために、好中球β2インテグリン24を活性化できる細菌由来の短い走化性ペプチドであるN-ホルミルメチオニル-ロイシル-フェニルアラニン(fMLP)をこのプロトコルの刺激として使用します。fMLPが好中球上のFpr1に結合すると、Gタンパク質、ホスホリパーゼCβ、およびホスホイノシチド3-キナーゼγを含む下流のシグナル伝達カスケードが活性化されます。これらのシグナル伝達事象は、最終的に、インサイドアウトシグナル伝達経路を介してインテグリン活性化をもたらす18,25。β2インテグリンに直接結合し、インテグリン活性化の立体構造変化を防ぐ低分子アンタゴニスト26に加えて、β2インテグリンのインサイドアウト活性化シグナル伝達経路の成分を阻害できる化合物もこの方法で検出されます。自動フローサイトメーターにより、ハイスループットスクリーニングが可能になります。新しいアンタゴニストを同定することで、インテグリン生理学の理解が深まるだけでなく、インテグリンベースの抗炎症療法に関するトランスレーショナルな洞察が得られる可能性があります。

プロトコル

ヘパリン処理された全血サンプルは、ヘルシンキ宣言の原則に従って、UConn Health の治験審査委員会によって承認されたインフォームド コンセントを取得した後、匿名化された健康な人間のドナーから採取されました。すべてのドナーからインフォームドコンセントが得られました。この研究の選択/除外基準は、参加者の適合性を確保し、潜在的なリスクを最小限に抑えるために慎重に開発されました。適格な参加者は、18歳から65歳で、あらゆる民族で、英語に堪能で、インフォームドコンセントを提供できる人でした。除外された参加者には、法的に権限のある代理人を必要とする人、18歳未満または65歳以上の個人、投獄された個人、妊娠中の女性など、自分でインフォームドコンセントを提供できない人が含まれていました。さらに、参加者は抗炎症薬の使用や炎症状態から解放されている必要がありました。現在の感染症または進行中の慢性または急性炎症状態も除外基準でした。最後に、COVID-19感染の既往歴がある人または最近の人は、この研究に不適格でした。これらの基準は、研究結果に影響を与える可能性のある潜在的な交絡因子を最小限に抑えながら、参加者の安全性と適合性を確保するように設計されています。

1. 試薬の調製

  1. 好中球培地:フェノールレッドを含まないRPMI-1640に2%ヒト血清アルブミンを添加して好中球培地を調製します( 材料表を参照)。
  2. fMLP溶液:10 mM fMLPジメチルスルホキシド(DMSO)保存溶液( 資料表を参照)を、フェノールレッドを含まないRPMI 1640で100倍に希釈してfMLP溶液を調製し、100 μMのfMLP溶液を生成します。
  3. 抗体溶液:β2インテグリンの高親和性コンフォメーションを報告するアロフィコシアニン(APC)標識モノクローナル抗体mAb24(mAb24-APC)( 資料表参照)120 μLを10 mLの好中球培地で希釈し、1.2 μg/mLのmAb24-APC溶液を調製します。
  4. 化合物ライブラリー:リキッドハンドラーを使用して、384ウェルプレート中のDMSO45 μLに10 mMライブラリー( 材料表を参照)5 μLを添加することにより、最初の化合物ライブラリーを10 mM〜1 mMの濃度で希釈します。続いて、リキッドハンドラーを使用して、1 mM 化合物ライブラリーのウェルあたり 5 μL を空の 384 ウェルプレートに移します。
  5. 図 1 に示すように、4 つのカラム( 1、2、23、24)には DMSO のみが含まれ、化合物は含まれておらず、スクリーニングのポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして機能しました。フェノールレッドを含まないRPMI-1640を45μL添加して各ウェルをさらに希釈し、すべての化合物の最終濃度を100μMにします。

2. ヒト血液からの好中球分離

  1. 血清ピペットを使用して、市販の密度勾配培地( 材料表を参照)8 mLの上に4 mLの血液を15 mLの遠心分離チューブに慎重に重ねます(図2A)。
  2. 血液を550 × g で20°Cで30〜50分間遠心分離します。 ローターを徐々に減速します(減速係数1)。
    注:赤血球からの好中球( 図2Bのバンド2)の分離の成功は、ドナーによって異なる場合があります。ほとんどのドナーでは、30分間の遠心分離で十分です。ただし、一部のドナーでは、分離が成功しない場合、さらに10〜30分の遠心分離が必要になる場合があります(図2C)。
  3. 血漿(上部の黄色い液体)と単核細胞(上部の曇ったバンド; 図2BのPBMCバンド)を1mLのピペットで使用しました。
  4. 下部の濁ったバンド( 図2Bの好中球バンド)から好中球を採取し、透明な液体の約3〜4 mL下から、10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む15 mL遠心分離チューブに収集します。好中球懸濁液を2〜3回反転させて静かに混合します。
  5. 懸濁液を400 × g で20°Cで10分間遠心分離し、デカンティングして上清を慎重に除去します。
  6. ペレットを5 mLのPBSで静かに再懸濁し、300 × g で20°Cで5分間遠心分離します。
  7. デカントして上澄み液を取り除き、真空吸引を使用してチューブ口の周りとチューブ壁に残っている上澄みを慎重に除去します。ペレットを好中球培地1mLに再懸濁します。
  8. 血球計算盤を使用して細胞数をカウントします。典型的には、1〜4〜10×7 個の好中球が8mLのヒト血液から得られた。
    注:好中球懸濁液に赤血球汚染がある可能性があります。赤血球はほとんどのアッセイに大きな影響を与えず、好中球の活性化/プライミングを妨げる可能性があります27。正確な好中球濃度を得るためには、赤血球をカウントする前に溶解する必要があります。10 μLの細胞懸濁液を891 μLの脱イオン水に10〜30秒間加えて赤血球を溶解し、次に99 μLの10× PBSを加えて浸透圧のバランスを取り、好中球の溶解を防ぎます。
  9. 好中球培地を添加して、細胞密度を6.25×105 細胞/mLに調整します。

3. 384ウェルプレートの調製

  1. 1.5 mLの遠心チューブに、1 mLの抗体溶液(1.2 μg/mL mAb24-APC)と0.2 mLの好中球培地を混合して、1 μg/mLのmAb24-APC溶液を調製します。次に、この混合物 25 μL を 384 ウェルプレート( 図 1 の青色のウェル)のネガティブコントロールウェルに添加します。
  2. 15 mLの遠心チューブ内で、9 mLの抗体溶液を21.6 μLのfMLP溶液(100 μM)および1.7784 mLの好中球培地と混合し、1 μg/mLのmAb24-APCおよび200 nM fMLPを含む溶液を調製します。次に、この混合物 25 μL を 384 ウェルプレート( 図 1 の赤と青のウェル)のポジティブコントロールおよびテストウェルに加えます。
  3. マルチチャンネルピペットを使用して、100 μM の化合物溶液のうち 5 μL を化合物ライブラリプレートから 384 ウェルプレートに移します。
  4. 液体を室温で500 × gで1分間遠心分離します。
    注:プレートを遠心分離するには、スイングバケットローターとプレートバケットが必要です。

4. 細胞の処理

  1. 16チャンネルピペット(384ウェルプレートの各カラムで5〜50μLの範囲)を使用して、各ウェルに20μLの好中球懸濁液を加えます。ピペットを使用して5〜10回静かに混合し、各ピペッティング間の時間間隔を一定に保ちます。
    注:ウェル内の最終濃度は次のとおりです:好中球2.5×105 細胞/ mL(すべてのウェル);mAb24-APC 0.5 μg/mL (全ウェル);fMLP 100 nM(ポジティブコントロールおよびテストウェル);化合物10μM(試験ウェル)。
  2. プレートをシェーカー上で300rpm、室温(RT)、10分間インキュベートします。
  3. 16チャンネルピペット(最終PFA濃度~0.91%)を使用して、各ウェルに3 μLの16%パラホルムアルデヒド(PFA)を添加して細胞を固定します。その後、氷上で10分間インキュベートします。
    注:好中球と PFA を添加する際には、異なるカラム間で一定の時間間隔を維持することが推奨されます。これにより、各ウェルの好中球は、fMLPおよびmAb24-APCで同じインキュベーション時間を持つようになります。

5. フローサイトメトリー

  1. フローサイトメーターの電源を入れ( 材料表を参照)、装置に接続されているコンピューターの電源もオンになっていることを確認します。
  2. シース液容器が満杯で、廃液容器が空で、機器に正しく接続されていることを確認してください。
  3. 384ウェルプレートをフローサイトメーターのサンプルローダーにロードします。プレートの A1 ウェルがローダーの A1 マークと揃っていることを確認します。
  4. ソフトウェアを開き、新しい実験を作成します。 384ウェル を選択し、目的の蛍光色素を選択します。次に、 プレート設定をクリックし、ドラッグしてすべてのウェルを選択し、 サンプルをクリックします。「高スループット」スイッチをオンにし、レートパネルの下にある 「高」 を選択します。
    1. ボリュームボックスに 「50」と入力します。奇数列のサンプルを選択し、「撹拌」スイッチをアクティブにします。最後に、右側のパネルでサンプルに名前を付けます。
  5. Plot and gateをクリックします。次に、[適用]ボタン(緑色で塗りつぶされた円の上の2つの矢印)をクリックし、続いて再生ボタン(三角形の形)をクリックします。数秒待って最初のウェルからいくつかのセルを観察し、一時停止ボタンをクリックします。
    1. FSC 電圧と SSC 電圧を調整して、プロット上のセルが適切に可視化されるようにします。 Acquisitionをクリックし、 再生 ボタン(三角形)をクリックしてアッセイを開始します。
  6. フローサイトメーターは、各ウェルから1000-3000の好中球を~50μL順次サンプリングします。384ウェルプレート全体を完成させるには、約3時間かかります。
  7. すべてのサンプルを完了したら、次の手順のために .fcs ファイルをエクスポートします。

6. データ解析

  1. フローサイトメトリーデータ解析ソフトウェアを開きます( 材料表を参照)。すべての.fcsファイルを含むフォルダを選択してソフトウェアウィンドウにドラッグし、放してデータをソフトウェアにインポートします。
  2. 1つのサンプルをダブルクリックし、ポップアップウィンドウでFSCおよびSSC28、29、30 に基づくゲート単一好中球を表示します( 図3を参照)。ゲート付きの行を選択してフォルダーにドラッグし、離すと、そのフォルダー内のすべてのサンプルにゲートが適用されます。
  3. ソフトウェアのテーブルエディター機能を使用して、各ウェルからの好中球のAPC中央蛍光強度(MFI)を計算してエクスポートします。「編集」タブの「列の追加」をクリックします。統計量タブで中央値を選択し、ゲート母集団好中球を選択し、パラメータとしてAPCを選択します。[OK]ボタンをクリックします。
  4. 「Table editor」タブに戻り、「Group」タブの All Samples を選択し、 Create tableボタンを押します。新しいウィンドウが開き、作成されたテーブルが表示されます。テキスト、CSV、またはExcelファイルとして保存します。
  5. エクスポートした表を開き、ポジティブコントロールサンプルとネガティブコントロールサンプルのAPC MFIの平均値と標準偏差を計算します(図4)。
  6. プレートのZ'係数(Z')は、次の式を使用して計算します。
    Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μp - μn)、
    ここで、σ p と σ n は、それぞれポジティブコントロールとネガティブコントロールの標準偏差であり、μp と μn は、それぞれポジティブコントロールとネガティブコントロールの平均である31。
    注:Z'係数は、正の対照分布と負の対照分布の分離を示します。Z' が 0 の場合は分離がないことを意味し、Z' が 0.5 の場合は分離が等しいことを示します。以前の研究31で述べたように、Z'>0.5は化合物スクリーニングのための優れたアッセイを示しています。0.5 から 0 の範囲の Z' は許容されますが、アッセイで強いヒットを同定するだけであり、二次アッセイでさらに検証する必要があります。
  7. 化合物処理した好中球のAPC MFIが、ポジティブコントロールMFIからポジティブコントロールMFIを差し引いた標準偏差の3倍より低い場合、化合物をスクリーニングの「ヒット」と見なします(P = 0.0013、 図4の点線で表されます)。

結果

代表的な384ウェルプレートスクリーニングのデータ(図4)では、陰性対照のmAb24-APCのMFIは3236±110であり、陽性対照のmAb24-APCのMFIは7588±858であることが明らかになりました。このプレートのZ'係数は約0.33で、許容範囲内です31。ただし、Z'は二次アッセイでさらに検証する必要があります。

データを正規化するために、すべての値をス?...

ディスカッション

好中球の刺激と染色の開始と終了は、好中球と固定剤PFAの添加によって決定されます。したがって、好中球または PFA を各カラムにピペッティングする間隔を同じにすることが重要です。これにより、各ウェルからの好中球の刺激と染色時間が一定に保たれます。好中球の寿命は短いため、ドナーからの採血からフローサイトメトリーの完了まで、すべての実験を同じ日に実施する必要があ?...

開示事項

著者らは、競合する金銭的利害関係がないことを宣言します。

謝辞

UConn HealthのフローサイトメトリーコアのEvan Jellison博士とLi Zhu氏にはフローサイトメトリーの支援を、UConn Healthの免疫学部門のLynn Puddington博士には機器のサポートを、UConn Healthの臨床研究コアには血液サンプルの採取に協力していただいたSlawa Gajewska氏とPaul Appleton博士に感謝します。UConn School of MedicineのChristopher "Kit" Bonin博士とGeneva Hargis博士には、この原稿の科学的執筆と編集に協力していただいたことに感謝します。この研究は、米国国立衛生研究所、国立心肺血液研究所(R01HL145454)、米国国立総合医学研究所(P20GM121176)、米国心臓協会からのキャリア開発賞(18CDA34110426)、およびUConn Healthからのスタートアップ資金の支援を受けました。 図 1 は BioRender.com で作成されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
16-channel pipettesThermo4661090NInstrument
384-well plateGreiner784201Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24BioLegend363410Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform Agilent16050-102384 multi-channel liquid handler
CentrifugeEppendorfModel 5810RInstrument
FlowJoBecton, Dickinson & CompanyNASoftware
Human Serum Albumin Solution (25%)GeminiBio800-120Reagents
LifitegrastThermofisher 50-208-2121Reagents
Nexinhib20Tocris6089Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)SigmaF3506Reagents
Paraformaldehyde 16% solutionElectron Microscopy Sciences15710Reagents
Plate bucketsEppendorfUL155Accessory
Plate shaker Fisher88-861-023Instrument
PolymorphPrepPROGEN1895 (previous 1114683)Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)Prestwick Chemical LibrariesVer19_3841520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol redGibco11-835-030Reagents
Swing-bucket rotor EppendorfA-4-62Rotor
ZE5 Cell AnalyzerBio-Rad LaboratoriesModel ZE5Instrument

参考文献

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