インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

要約

このプロトコルは人間の好中球のβ2インテグリンの活発化を禁じる低分子薬剤を識別するために流れのcytometryベースの、ハイスループットのスクリーニング方法を記述する。

要約

このプロトコルは、β2インテグリン活性化の低分子アンタゴニストを特定する方法を確立することを目的としており、コンフォメーション変化報告抗体とハイスループットフローサイトメトリーを利用しています。この分析法は、他の抗体ベースのハイスループットスクリーニング法のガイドとしても役立ちます。β2インテグリンは、免疫応答に重要な白血球特異的な接着分子です。好中球は、感染症と戦うだけでなく、複数の炎症性疾患に関与するために、血流から出るためにインテグリンの活性化に依存しています。β2インテグリンの活性化を制御することは、好中球関連炎症性疾患を治療するための実行可能なアプローチです。このプロトコルでは、モノクローナル抗体であるmAb24は、β2インテグリンの高親和性ヘッドピースに特異的に結合し、単離された一次ヒト好中球のβ2インテグリンの活性化を定量化するために利用されます。N-ホルミルメチオニル-ロイシル-フェニルアラニン(fMLP)は、好中球β2インテグリンを活性化するための刺激として使用されます。この研究では、384ウェルプレートサンプルを自動的に分析できるハイスループットフローサイトメーターを使用しました。β2 インテグリン阻害に対する 320 種類の化学物質の効果を 3 時間以内に評価します。このアプローチにより、β2インテグリンを直接標的とする分子、またはGタンパク質共役受容体開始インテグリンのインサイドアウト活性化シグナル伝達経路の標的分子を同定することができます。

概要

多くの炎症性疾患は、腫れまたは損傷の部位における好中球の浸潤を特徴とする¹。これらの組織に浸潤するために、好中球は、内皮への停止、血管壁を横切る血管外漏出、および組織への動員を含む好中球動員カスケードを完了する^{必要があります2。}循環好中球は、特に停止期において、このカスケードを完了するためにβ2インテグリン活性化を必要とします。したがって、好中球の接着、血管外漏出、および動員を減少させるインテグリン阻害薬は、炎症性疾患を効果的に治療する可能性があります^3,4。

β2インテグリンは、以前から炎症性疾患の標的となっていました。インテグリンαLβ2を直接標的とするモノクローナル抗体であるエファリズマブは、乾癬^の治療薬として開発されました5。しかし、エファリズマブは、JCウイルスの再活性化に起因する進行性多巣性白質脳症という致命的な副作用のために中止されました^6,7。新しい抗炎症インテグリンベースの治療法では、副作用を最小限に抑えるために白血球の抗感染機能を維持することを考慮する必要があります。エファリズマブの....

プロトコル

ヘパリン処理された全血サンプルは、ヘルシンキ宣言の原則に従って、UConn Health の治験審査委員会によって承認されたインフォームド コンセントを取得した後、匿名化された健康な人間のドナーから採取されました。すべてのドナーからインフォームドコンセントが得られました。この研究の選択/除外基準は、参加者の適合性を確保し、潜在的なリスクを最小限に抑えるために慎重に開発されました。適格な参加者は、18歳から65歳で、あらゆる民族で、英語に堪能で、インフォームドコンセントを提供できる人でした。除外された参加者には、法的に権限のある代理人を必要とする人、18歳未満または65歳以上の個人、投獄された個人、妊娠中の女性など、自分でインフォームドコンセントを提供できない人が含まれていました。さらに、参加者は抗炎症薬の使用や炎症状態から解放されている必要がありました。現在の感染症または進行中の慢性または急性炎症状態も除外基準でした。最後に、COVID-19感染の既往歴がある人または最近の人は、この研究に不適格でした。これらの基準は、研究結果に影響を与える可能性のある潜在的な交絡因子を最小限に抑えながら、参加者の安全性と適合性を確保するように設計されています。

1. 試薬の調製

1. 好中球培地:フェノールレッドを含まないRPMI-1640に2%ヒト血清アルブミンを添加して好中球培地を調製します( 材料表を参照....

ディスカッション

好中球の刺激と染色の開始と終了は、好中球と固定剤PFAの添加によって決定されます。したがって、好中球または PFA を各カラムにピペッティングする間隔を同じにすることが重要です。これにより、各ウェルからの好中球の刺激と染色時間が一定に保たれます。好中球の寿命は短いため、ドナーからの採血からフローサイトメトリーの完了まで、すべての実験を同じ日に実施する必要があ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
16-channel pipettes	Thermo	4661090N	Instrument
384-well plate	Greiner	784201	Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24	BioLegend	363410	Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform	Agilent	16050-102	384 multi-channel liquid handler
Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R	Instrument
FlowJo	Becton, Dickinson & Company	NA	Software
Human Serum Albumin Solution (25%)	GeminiBio	800-120	Reagents
Lifitegrast	Thermofisher	50-208-2121	Reagents
Nexinhib20	Tocris	6089	Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)	Sigma	F3506	Reagents
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710	Reagents
Plate buckets	Eppendorf	UL155	Accessory
Plate shaker	Fisher	88-861-023	Instrument
PolymorphPrep	PROGEN	1895 (previous 1114683)	Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)	Prestwick Chemical Libraries	Ver19_384	1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red	Gibco	11-835-030	Reagents
Swing-bucket rotor	Eppendorf	A-4-62	Rotor
ZE5 Cell Analyzer	Bio-Rad Laboratories	Model ZE5	Instrument