Technique à haut débit basée sur la cytométrie en flux pour le criblage de médicaments inhibiteurs de l’intégrine

Résumé

Ce protocole décrit une méthode de criblage à haut débit basée sur la cytométrie en flux pour identifier les médicaments à petites molécules qui inhibent l’activation de l’intégrine β2 sur les neutrophiles humains.

Résumé

Ce protocole vise à établir une méthode d’identification des petits antagonistes moléculaires de l’activation de l’intégrine β2, en utilisant des anticorps rapporteurs de changement conformationnel et une cytométrie en flux à haut débit. La méthode peut également servir de guide pour d’autres méthodes de criblage à haut débit à base d’anticorps. Les intégrines β2 sont des molécules d’adhésion spécifiques aux leucocytes qui sont cruciales dans les réponses immunitaires. Les neutrophiles dépendent de l’activation de l’intégrine pour sortir de la circulation sanguine, non seulement pour combattre les infections, mais aussi pour être impliqués dans de multiples maladies inflammatoires. Le contrôle de l’activation de l’intégrine β2 présente une approche viable pour le traitement des maladies inflammatoires associées aux neutrophiles. Dans ce protocole, un anticorps monoclonal, mAb24, qui se lie spécifiquement à la coiffe de haute affinité des intégrines β2, est utilisé pour quantifier l’activation de l’intégrine β2 sur des neutrophiles humains primaires isolés. La N-formylméthionyl-leucyl-phénylalanine (fMLP) est utilisée comme stimulus pour activer les intégrines β2 des neutrophiles. Un cytomètre en flux à haut débit capable d’analyser automatiquement des échantillons de plaques à 384 puits a été utilisé dans cette étude. Les effets de 320 produits chimiques sur l’inhibition de l’intégrine β2 sont évalués dans les 3 heures. Les molécules qui ciblent directement les intégrines β2 ou les molécules cibles dans la voie de signalisation d’activation de l’intégrine initiée par le récepteur couplé aux protéines G peuvent être identifiées grâce à cette approche.

Introduction

De nombreuses maladies inflammatoires sont caractérisées par l’infiltration de neutrophiles sur le site d’un gonflement ou d’une blessure¹. Pour infiltrer ces tissus, les neutrophiles doivent compléter la cascade de recrutement des neutrophiles, qui implique l’arrêt de l’endothélium, l’extravasation à travers la paroi du vaisseau et le recrutement dans le tissu². Les neutrophiles circulants ont besoin de l’activation de l’intégrine β2 pour compléter cette cascade, en particulier pour la phase d’arrêt. Ainsi, les médicaments inhibiteurs de l’intégrine qui réduisent l’adhésion, l’extravasation et le recrutement des neutrop....

Protocole

Des échantillons de sang total hépariné ont été obtenus auprès de donneurs humains sains anonymisés après avoir obtenu un consentement éclairé, tel qu’approuvé par l’Institutional Review Board de UConn Health, conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki. Le consentement éclairé de tous les donneurs a été obtenu. Les critères d’inclusion et d’exclusion de cette étude ont été soigneusement élaborés afin de s’assurer de la pertinence des participants et de minimiser les risques potentiels. Les participants admissibles étaient âgés de 18 à 65 ans, de toute origine ethnique, parlant couramment l’anglais et capables de donner un consentement éclairé. Les partici....

Résultats

Les données d’un criblage représentatif de plaques à 384 puits (Figure 4) ont révélé que les témoins négatifs avaient une MFI de mAb24-APC de 3236 ± 110, tandis que les témoins positifs avaient une MFI de mAb24-APC de 7588 ± 858. Le facteur Z' de cette plaque est d’environ 0,33, ce qui se situe dans une plage acceptable^{de 31}. Cependant, Z' nécessite une validation supplémentaire dans les tests secondaires.

Pour normaliser l.......

Discussion

L’initiation et l’arrêt de la stimulation et de la coloration des neutrophiles sont déterminés par l’ajout de neutrophiles et du PFA fixateur. Par conséquent, il est essentiel d’assurer le même intervalle de temps entre le pipetage des neutrophiles ou de l’APF dans chaque colonne. Cela garantit que le temps de stimulation et de coloration des neutrophiles de chaque puits reste constant. En raison de la courte durée de vie des neutrophiles, l’ensemble de l’expérience, de la collecte de sang des donneu.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
16-channel pipettes	Thermo	4661090N	Instrument
384-well plate	Greiner	784201	Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24	BioLegend	363410	Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform	Agilent	16050-102	384 multi-channel liquid handler
Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R	Instrument
FlowJo	Becton, Dickinson & Company	NA	Software
Human Serum Albumin Solution (25%)	GeminiBio	800-120	Reagents
Lifitegrast	Thermofisher	50-208-2121	Reagents
Nexinhib20	Tocris	6089	Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)	Sigma	F3506	Reagents
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710	Reagents
Plate buckets	Eppendorf	UL155	Accessory
Plate shaker	Fisher	88-861-023	Instrument
PolymorphPrep	PROGEN	1895 (previous 1114683)	Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)	Prestwick Chemical Libraries	Ver19_384	1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red	Gibco	11-835-030	Reagents
Swing-bucket rotor	Eppendorf	A-4-62	Rotor
ZE5 Cell Analyzer	Bio-Rad Laboratories	Model ZE5	Instrument